Phân lập lại, làm thuần
Phân lập lại, làm thuần nấm ký sinh trên SXBT hại rau họ hoa thập tự theo phương pháp nghiên cứu vi sinh thường áp dụng tại Việt nam [4; 12].
Tiến hành lấy nguồn nấm trên mẫu sâu nhiễm nấm cấy trên môi trường PDA có bổ sung kháng sinh Steptomyces.
Bước 1: Nấu môi trường PDA với thành phần 200g khoai tây, 20g
Agar và 5g đường Dextrose trong 1000ml nước (khoai tây thái lát đun sôi ở 1000C trong thời gian 20 phút và lọc lấy dịch chiết sau đó cho agar và đường vào). Khử trùng môi trường PDA ở nhiệt độ 1210C (áp suất 1 atm) trong thời gian 30 phút, sau đó để nguội khoảng 45 - 50oC và bổ sung kháng sinh streptomycin 0,1%. Đổ môi trường ra đĩa petri (đã được sấy khử trùng ở 250oC trong 2,5 giờ) và để nguội.
Bước 2: Cấy phân lập mẫu nấm: Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn
lửa đèn cồn, sau đó làm nguội và chấm nhẹ vào điểm có bào tử đặc trưng của các nguồn nấm ký sinh trên cơ thể sâu. Sau đó cấy ria lên bề mặt môi trường.
Để đĩa môi trường đã cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm 5 - 7 ngày, thấy khuẩn lạc đặc trưng của nấm xuất hiện thì tiến hành cấy tách ra các đĩa môi trường khác nhau để làm thuần chủng bằng phương pháp tách đơn bào tử.
Phương pháp tách đơn bào tử tạo dòng thuần nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae
Tạo dòng nấm thuần bằng phương pháp tách đơn bào tử trên đĩa thạch WA. Bằng cách dùng que cấy thuỷ tinh chấm nhẹ vào bề mặt khuẩn lạc có chứa bào tử, rồi cấy vào đĩa thạch môi trường WA. Sau đó, dùng trang thuỷ tinh trang đều ra bề mặt đĩa thạch và để đĩa thạch đó trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sau khoảng 12 - 24 giờ tiến hành soi đĩa nấm đó bằng kính lúp để bàn để quan sát bào tử nấm nảy mầm. Khi thấy bào tử nảy mầm, dùng que cấy có đầu nhọn hình lưỡi mác cắt riêng phần thạch chứa bào tử đó cấy sang đĩa môi trường khác, sau đó để đĩa có chứa đơn bào tử đó trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Đánh giá tuyển chọn các chủng Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae có độc tính cao đối với sâu hại.
Các chủng nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae sau
khi phân lập được thì tiến hành nuôi cấy trên môi trường ống giống PDA làm
nguồn thực liệu ban đầu.
Phương pháp pha dung dịch nấm để thí nghiệm được tiến hành như sau: Dùng 3ml nước cất cộng thêm 0,01% dung môi hoà tan (Agral) đổ vào ống giống nấm. Lắc ống giống, sao cho bào tử phân bố đều trong nước. Lấy 1ml dung dịch trên đếm số lượng bào tử trong 1ml với phương pháp pha loãng theo cơ số 10 (pha loãng 3 lần). Tiến hành đếm số bào tử trên buồng đếm hồng cầu.
Thí nghiệm nhà lưới được bố trí với các công thức lây nhiễm tương ứng với mỗi chủng nấm Paecilomyces javanicus và M. anisopliae đã phân lập. Các công thức thí nghiệm (tương ứng với các chủng nấm đã phân lập được) đều phun cùng một nồng độ 5 108 bào tử/ml và được bổ sung 0,1% Tween - 80 tăng khả năng bám dính. Mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc là một cây bắp cải thả 10 con sâu tuổi 2 - 3 và đối chứng phun nước lã.
Hàng ngày, đếm số lượng sâu chết ở từng lần nhắc lại của mỗi công thức. Hiệu lực gây chết sâu tính theo công thức Abbott.