Công nghệ sản xuất VÀ ỨNG DỤNG ENZYME TRANSGLUTAMINASE TRONG công nghệ thực phẩm

Phản ứng tạo liên kết ngang Tuy nhiên TG-ases cũng có thể xúc tác cho nhiều phản ứng khác, ví dụ deamidation của một nhóm γ-amide, các nitrosylation và denitrosylation của nhóm -SH của C

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI TIỂU LUẬN

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: CNSX VÀ ỨNG DỤNG ENZYME

TRANSGLUTAMINASE TRONG CNTP

GVGD: NGUYỄN THỊ THU SANG

TKB: thứ 5_tiết 7,8_nhóm 20

MỤC LỤC

TP HỒ CHÍ MINH, 2015

I/ Tổng quan

1. Khái niệm

Transglutaminase (R-glutaminyl-peptide: amin g-glutamyltransferase, EC 2.3.2.13)

là một enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển acyl giữa các nhóm acyl γ-cacboxamit của glutamine và nhóm ε-amino của lysine Kết quả là hình thành liên kết isopeptide

Hình 1 Phản ứng tạo liên kết ngang

Tuy nhiên TG-ases cũng có thể xúc tác cho nhiều phản ứng khác, ví dụ deamidation của một nhóm γ-amide, các nitrosylation và denitrosylation của nhóm -SH của Cys, sự phân giải protein để hình thành các isopeptide hoặc phản ứng tạo phức protein Gh (GDP

«GTP) sẽ kích hoạt một số enzyme protein kinase và tham gia vào việc chuyển tín hiệu qua màng

Transglutaminase hoạt động trong một phạm vi pH rộng (pH 5-8), bền vững đến khoảng nhiệt độ 40°C Trên 75°C enzyme mất hoạt tính trong vòng một vài phút nếu sử dụng ở liều thông thường. Enzyme này bị ức chế mạnh bởi PCMB, Pb2+, Zn2+ và Cu2+

nhưng không bị ảnh hưởng bởi EDTA và Ca2+. Điều này cho thấy TG-ase tinh khiết là caxi độc lập và trung tâm hoạt động của nó có chứa Cys

2. Phân loại cấu trúc và tính chất của Transglutaminase.

Enzyme transglutaminase có thể tồn tại ở nhiều hình thức, thể hiện ít nhất bởi 9 loại gen, phân biệt bằng khả năng hòa tan, nội địa hóa, cấu trúc bậc bốn và chức năng

Có thể phân loại TG-ase như sau:

• TG-ase 1 (khối lượng phân tử khoảng 106 kDa) chủ yếu ở màng biểu mô

• TG-ase 2 (MW 80 kDa) ở dạng hòa tan, cytosolic và đã được tìm hiểu rộng nhất

• TG-ase 3 (77 kDa), cũng dạng hòa tan và chủ yếu ở lớp biểu mô

• TG-ase 4 (80 kDa) và hoạt động của nó xảy ra rõ ràng hơn trong tế bào

• TG-ase X (80 kDa) cùng với các yếu tố XIIIa làm đông máu

3. Cơ chế tác dụng của enzyme transglutaminase 2 (TG-ase 2)

TG-ase 2 xúc tác tạo liên kết ngang, tức là hình thành liên kết isopeptide giữa các peptide ràng buộc để cố định amide Gln dư lượng và các nhóm amin cơ bản của Lys (peptide dạng liên kết hay tự do) hoặc các nhóm amin khác Do đó các protein có thể được sửa đổi bởi: cầu nối các polyamine, deamidation hay thủy phân của các liên kết isopeptide Hơn nữa , khi tồn tại trên bề mặt bên ngoài thành tế bào, E cũng có thể tham gia vào việc chuyển tín hiệu qua màng, vì nó cũng có các chức năng như protein G; sau đó là liên kết với phức hệ GDP / GTP Các cơ chế của các quá trình xúc tác bởi TG-ase 2 được diễn

tả như sau:

Các hoạt động quan trọng

nhất của TG-ase 2 đã được thể

hiện trong hình sau đây: trong

cytosole (C), trong nhân(N),

trong không gian ngoại bào (E),

và trong màng tế bào (M)

Ở nồng độ Ca2+ thích hợp,

TG-ase xúc tác cho các phản ứng:

(1) chuyển acyl giữa các nhóm

amide xác định Gin (peptide liên

kết) và các nhóm amin cơ bản

của Lys (peptide liên kết hay tự

do), cũng như polyamine

(putrescine, cadaverine,

histamine,cũng như một số amin

cơ bản khác);

(2) tham gia qua Lys ràng buộc

NH để hình thành liên kết

isopeptide; (3) thủy phân Gln

(nhóm amide loại bỏ NH3, Gln

Glu);

(4) khi vắng mặt ion Ca2+, TGase

có thể liên kết hệ protein

Gh-GDP / GTP; (5) kết quả của thay

đổi và chuyển giao bên ngoài bề

mặt màng TG-ase giúp làm tăng

kích thích các tín hiệu;

(6) TG-ase được tạo thành giữa

các tế bào có khả năng tham gia

các integrin protein và

Fibronectin sau khi Ca2+ tăng làm

xúc tác cho quá trình tham gia và

hình thành tế bào mô Sự thay đổi

của protein là kết quả của sự xúc

tác và tương tác của TG-ase với

các thụ thể kích hoạt và tạo phức

với các thành phần tích hợp

4. Nguồn gốc

Enzyme transglutaminase có nguồn gốc từ động vật, thực vật và vi sinh vật

TG-ase được sản xuất chủ yếu từ vi sinh vật như Streptoverticillium ladakanum;

S.mobaraense… trong môi trường rỉ đường có bổ sung glycerol.

Ở động vật TG-ase được tìm thấy trong tất cả các tế bào sống và tham gia vào nhiều quá trình sinh lý, do đó chúng có thể có mặt trong phần chất hòa tan (tế bào chất), cũng như không hòa tan (màng tế bào hoặc mô) Chúng cũng được tìm thấy trong các mô thần kinh (cả tế bào trung tâm và ngoại vi) và một số plastid (ví dụ như trong lục lạp hay màng hồng cầu)

Ở thực vật, ase được tìm thấy trong lục lạp, trong lá trưởng thành chủ yếu là TG-ase 77 kDa

Trong các loại TG-ase nêu trên thì chỉ có TG-ase có nguồn gốc từ vi sinh vật được ứng dụng trong sản xuất thực phẩm

II/Quy trình sản xuất enzyme transglutaminase.

1. Sơ đồ quy trình công nghệ

2. Thuyết minh quy trình.

a) Chuẩn bị môi trường

Rỉ đường được dùng làm cơ chất cho quá trình lên men Trước khi sử dụng, rỉ đường được loại bỏ các chất keo, chất lơ lửng và một số tạp chất khác để quá trình nuôi cấy diễn

ra tốt hơn và quá trình thu nhận enzyme diễn ra dễ dàng hơn

Môi trường nuôi cấy được chuẩn bị bao gồm rỉ đường pha loãng (60g/L của tổng lượng đường), glycerol (60g/L) hoặc hỗn hợp (rỉ đường 30g/L tổng lượng đường và 30g/L của glycerol) có bổ sung (g/L): sodium casein 38.4; peptone 10.5; chiết xuất nấm men 2.5; Na2HPO4 5, KH2PO4 2 và MgSO4 0.5

b) Xử lý môi trường

Thanh trùng

Mục đích: tiêu diệt vi sinh vật gây hại chuẩn bị cho quá trình lên men

Tiến hành: rỉ đường được tiệt trùng riêng bằng cách lọc qua màng có kích thước lọc 0.2µm, các thành phần còn lại của môi trường được khử trùng trong nồi hấp

Các biến đổi:

- Vật lý: nhiệt độ tăng

- Sinh học: các vi sinh vật tạp nhiễm bị tiêu diệt

- Hóa học: có thể xảy ra phản ứng maillard

- Hóa lý: độ nhớt dung dịch giảm

- Hóa sinh: các enzyme bị biến tính mất hoạt tính

Làm nguội

Mục đích: hạ nhiệt độ của canh trường xuống 26oC để chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy

Các biến đổi:

- Vật lý: nhiệt độ canh trường giảm

- Hóa lý: độ nhớt dung dịch tăng

c) Nhân giống

Mục đích: làm tăng lượng sinh khối cho tới khi đủ số lượng phục vụ sản xuất

Cách tiến hành: S ladakanum chủng NRRL 3191 được cấy vào ống nghiệm trong

môi trường thích hợp ở 26oC

Biến đổi chủ yếu là sinh khối tăng nhanh

d) Cấy giống

Giống sau khi được đạt đủ số lượng được cấy vào môi trường với tỷ lệ 2% v/v

e) Lên men

Mục đích: tăng lượng enzyme đến mức mong muốn

Tiến hành: Quá trình lên men ở nhiệt độ 26oC trong 72h, với tốc độ khuấy 400rpm, trong điều kiện hiếu khí với lượng Oxy được cung cấp 200cm3/phút/L

Các biến đổi:

- Hóa lý: nồng độ chất khô giảm

- Hóa sinh: sinh khối tế bào và lượng enzyme tăng

f) Ly tâm

Mục đích: loại bỏ sinh khối tế bào ra khỏi dung dich chuẩn bị cho quá trình kết tủa enzyme

Cách tiến hành: Có thể sử dụng thiết bị ly tâm đĩa để tách sinh khối tế bào ra khỏi dung dịch

Các biến đổi: dung dịch trong hơn

g) Kết tủa enzyme và lọc tách enzyme

Mục đích: tách riêng enzyme ra khỏi dịch lên men

Tiến hành:

Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat amon Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác

Trong khi tiến hành tủa cần làm lạnh cả dung dịch enzyme thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme Khi đổ chất kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính

Trong quá trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sunfat amon với liều lượng như sau:

cứ một phần dung dịch enzyme thô cần 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sunfat amon

Khi cho chất kết tủa vào dung dịch enzyme thô, tiến hành khuấy nhẹ sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường 4 đến 7oC) theo thời gian các enzyme sẽ được kết tủa và lắng xuống đáy Tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70% )

h) Tinh sạch

Mục đích: loại bỏ các enzyme không cần thiết để thu được enzyme transglutaminase

có độ tinh khiết cao

Tiến hành: Sử dụng phương pháp sắc kí lọc gel để tinh sạch enzyme Enzyme thu được sau khi kết tủa là một hỗn hợp nhiều enzyme khác nhau Do đó phải tiến hành sắc

ký lọc gel qua cột gel Blue sepharose để thu được enzyme transglutaminase

i) Sấy

Mục đích: bảo quản, hoàn thiện

Tiến hành: Sản phẩm sau sắc kí được sấy ở nhiệt độ 30-40oC để đảm bảo hoạt tính cho enzyme, độ ẩm sản phẩm từ 5-8%

III/ Ứng dụng của enzyme transglutaminase.

Transglutaminase là một loại enzyme gốc protein, tự nhiên và an toàn, có chức năng đóng khối thịt theo hình dạng mong muốn dựa trên liên kết polymer sinh học mà không sử dụng các loại phụ gia thực phẩm gốc phosphate

Công dụng:

- Tạo cấu trúc liên kết tốt giữa các Protein

- Tăng độ dai, giòn cho sản phẩm

- Giữ hương vị đặc trưng cho sản phẩm

- Hạn chế thất thoát nước trong quá trình chế biến

Transglutaminase được sử dụng để cải thiện kết cấu của các sản phẩm thịt nấu chín như xúc xích Transglutaminase xúc tác cho sự liên kết giữa các phân tử của glutamine và lysine dư trong các protein của thịt sống bằng cách tạo ra một mạng lưới phức tạp Vào cuối của xử lý các hoạt động của enzyme bị phá hủy bằng cách xử lý nhiệt

Hình 2.Chế phẩm enzyme transglutaminase trên thị trường và ứng dụng

Khi sử dụng enzyme transglutaminase cần bổ sung thêm các protein dạng hòa tan (gel ) Vì transglutaminase không thể tạo liên kết ngang với các protein ở trạng thái rắn

Trong các ngành chế biến thit cá, số lượng thịt vụn là đáng kể, TG-ase có thể giải quyết vấn đề này TG-ase giúp liên kết các mảnh thịt vụn thành một khối rồi chế biến mà chất lượng của sản phẩm không bị ảnh hưởng nhiều

Trên thị trường, E.Transglutaminase được chia thành nhiều code khác nhau, mỗi code sẽ có những chức năng riêng:

 Transglutaminase (code: TG-SA)

• Được ứng dụng chế biến kết dính thịt gia cầm, thịt đỏ và hải sản

• Dễ sử dụng bằng nhiều cách

• Không gây dị ứng

dính thịt heo và da gà nấu chín

thịt gà Hình 5 Ham thịt heo

Hình 6 Tái cấu trúc cá hồi Hình 7.Thịt xông khói cắt lát

Lợi ích của TG-SA:

• Dễ dàng sử dụng

• Trộn với thịt trực tiếp

• Tạo liên kết chéo tự nhiên của chính các mạch protein của thịt (cá)

• Không ảnh hưởng đến tính chất của thịt (cá)

• ổn định trong quá trình sử lý tiếp theo như cắt, ướp, sấy và đóng gói

• Có thể tiêu chuẩn hóa và kiểm sót thành phần nhằm tạo các giá trị gia

tăng.Sản phẩm có thể tiếp tục chế biến

 Transglutaminase (code: TG-MTC)

• Được pháp triển trong ứng dụng tăng trọng bằng phương pháp tiêm (injection)

và ướp ngấm (marination) trong thịt (cá)

• Là sản phẩm giúp tăng trọng lượng thịt (cá) bằng việc tích nước

• Không dùng phosphate và không làm ảnh hưởng đến hương vị tự nhiên của thịt (cá)

• Sau khi hấp thu TG-MTC, sản phẩm có thể được chế biến bình thường hoặc trộn TG-SA kết dính định hình với cấu trúc mới

Hình 8 Thịt bò trước và sau khi ướp ngấm với TG-MTC

Bảng 1 So sánh tỷ lệ tăng trọng giữa phosphate và TG-MTC

Thịt Phostphate (%) TG-MTC (%)

Lợi ích của TG-MTC:

• Cải thiện khả năng giữ nước, làm tăng việc lưu giữ nước và các thành phần cần thiết nếu có trong thực phẩm

• Ít thất thoát sau khi rã đông

• Nâng cao năng suất chế biến thức ăn, tăng khối lượng của sản phẩm

• Không làm thay đổi các đặc tính cảm quan của sản phẩm, cải thiện đặc tính ngoại quan (thịt trông tươi hơn)

 Transglutaminase (code: TG-0411)

• Được phát triển để cải thiện cấu trúc trong các sản phẩm thuần chay

• Có thể thay thế làng trắng trứng và các sản phẩm kết dính có nguồn gốc tảo biển trong sản phẩm chay

Lợi ích của TG-0411:

• Cải thiện độ đàn hồi, dai, và độ săn chắc của sản phẩm

• Tăng năng suất chế biến thức ăn

• Tăng khả năng cắt lát mỏng cho sản phẩm

• Giữ hương vị ban đầu tự nhiên của sản phẩm

• Sản phẩm chay sử dụng kết hợp với TG-0411 rất ổn định trong khi nấu, nướng, chiên

 Transglutaminase (code: TG-BH)

• Được phát triển cho các ứng dụng trong thịt và hải sản

• Được dùng cho các sản phẩm thịt (cá) kết dính và thái lát

• Thường được pha ở tỷ lệ dạng dung dịch (1:7) vì có hoạt tính enzyme cao

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Oscar M Portilla-Rivera, Simón J Téllez-Luis1, José A Ramírez de León1

and Manuel Vázquez_Production of Microbial Transglutaminase on Media

Made from Sugar Cane Molasses and Glycerol_2007.

[2] Lee C.H.1 and Lee.Y.K_ Microbial Fermentation Production Of The Enzyme

Transglutaminase_ Department of Microbiology, Yong Loo Lin School of

Medicine,National University of Singapore

[3] Aleksandr Shleikin, Andrey Gorbatovsky, Nikolay Danilov_ THE USE OF

TRANSGLUTAMINASE IN FOOD PROCESSING_2008.

[4] J Zotzel, P Keller and H.-L Fuchsbauer_ Transglutaminase from Streptomyces

mobaraensis is activated by an endogenous metalloprotease_2003.