Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose

Trong công nghệ đồ uống và thực phẩm, cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng làm nhiều sản phẩm như: nước trái cây, thực phẩm chức năng… Đặc biệt, một ứng dụng của cellulose vi khuẩn mới đư

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Môn Học: Ứng Dụng CNSH trong

CNTP

Giảng viên hướng dẫn: Nguyễn Thị Thu Sang

Mục Lục

Lời Mở Đầu

Cellulose là một hợp chất hóa học thường được biết đến với vai trò là bộ khung xương quan trọng trong cơ thể thực vật Không những cellulose được tổng hợp bởi thực vật, mà cellulose còn được tổng hợp nên bởi vi sinh vật, với tên gọi là cellulose vi khuẩn Một trong những loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose rất tốt đó là A xylinum Cellulose vi khuẩn ngày càng được quan tâm nhiều hơn bởi khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, âm thanh, xử lý nước thải, bảo vệ môi trường… Gần đây, khả năng ứng dụng cellulose vi khuẩn không ngừng được nghiên cứu, cải tiến bởi các nhà khoa học trên thế giới (Otomo et al., 2000)

Trong công nghệ đồ uống và thực phẩm, cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng làm nhiều sản phẩm như: nước trái cây, thực phẩm chức năng… Đặc biệt, một ứng dụng của cellulose vi khuẩn mới được phát hiện gần đây là khả năng ứng dụng làm màng bao thực phẩm chống vi sinh vật rất hiệu quả (Yoshinaga et al., 1997; Okiyama

et al., 1993) Từ những ứng dụng ưu việt trên của Bacterial Cellulose nhóm em đã tiến hành tìm hiểu về công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose trong cuốn tiểu luận này

Công nghệ sản xuất Bacterial Cellulose

1 Tổng quan

Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A xylinum lần đầu tiên được báo cáo bởi Brown et al (1986) Theo đó, khi nghiên cứu về vi khuẩn acetic, Brown đã phát hiện và quan sát thấy một khối rắn mà theo ông lúc đó khối rắn này không nằm trong các kết quả nghiên cứu ông dự định trước Khối rắn này khó bị phân hủy và giống với mô động vật Hợp chất đó sau này được xác định là cellulose và vi khuẩn tổng hợp ra nó là Bacterium xylinum (Brown et al., 1986) Đến nửa thế kỷ XX các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu nhiều về cellulose vi khuẩn Đầu tiên, Hestrin et al (1954) đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum Ông đã chứng minh rằng vi khuẩn này có thể sử dụng đường để tổng hợp cellulose Sau đó, Next và Colvin (1957) chứng minh rằng cellulose được A xylinum tổng hợp trong môi trường có đường và ATP Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, cấu trúc của cellulose vi khuẩn ngày càng được hiểu khá rõ, đó là các chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan Saxena (1990)

đã giải thích cơ chế tổng hợp cellulose của A xylinum bằng việc giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose Ông đã tách chiết được đoạn polypeptide liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose tinh khiết dài 83kDa Từ đó đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, cơ chế tổng hợp, ứng dụng… của cellulose vi khuẩn

1.1 Giới thiệu tổng quan về Bacterial cellulose

1.1.1 Cellulose vi khuẩn

Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1,5 nm Đây là những thớ sợi tự nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong tượng tầng ở một vài loài thực vật Các thớ sợi thứ cấp kết lại thành những vi sợi, những vi sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải Dải có chiều dày 3 – 4 nm, và chiều dài 130 – 177 nm (Yamanaka et al., 2000) Các dải siêu mịn của cellulose có chiều dài từ 1 µm đến 9 µm tạo thành cấu

trúc mắt lưới dày đặc, được ổn định nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki et al., 2001)

Hình 1 Cấu trúc của cellulose vi khuẩn (Yamanaka et al., 2000)

1.1.2 Mức độ polymer hoá (Degree of polymerization - DP)

Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học, cellulose bao gồm các liên kết β-1,4-glucan, nhưng mức độ polymer hoá khác nhau DP của cellulose thực vật khoảng 13000 – 14000, và của cellulose vi khuẩn khoảng 2000 –

6000 Tuy nhiên, trong một số trường hợp DP của cellulose vi khuẩn có thể đạt 16000 đến 20000 phân tử glucose (Watanabe et al., 1998) Đường kính của bacterial cellulose chỉ vào khoảng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (Bielecki et al., 2001) (hình 2.2)

1.1.3 Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn.

Ngày nay nhờ vào các kỹ thuật công nghệ hiện đại người ta đã xác định được cấu trúc của cellulose vi khuẩn Chẳng hạn như kỹ thuật nhiễu xạ tia X giúp xác định được kích thước và phân biệt cấu trúc cellulose vi khuẩn Những kỹ thuật khác như phổ hồng ngoại, phổ Raman, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose (Bielecki et al., 2001)

Như các cellulose tự nhiên khác, cellulose vi khuẩn được tạo thành bởi hai loại cấu trúc tinh thể riêng biệt, cellulose Iα và Iβ Trong vi sợi cellulose đều có sự tham gia

của loại cấu trúc tinh thể này (Yamamoto & Horii, 1993) Trong khi hầu hết tinh thể Iβ

tinh khiết thu được từ cellulose thực vật thì vẫn chưa có cách nào thu nhận được các tinh thể Iα tinh khiết từ nguồn này Cấu trúc của cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn A xylinum chứa nhiều tinh thể Iα hơn cellulose thực vật, hàm lượng loại tinh thể này có thể lên đến hơn 60% Tỉ lệ này có thể dao động trong khoảng 64% đến 71% tuỳ vào chủng vi sinh vật và nhiệt độ môi trường (Yamamoto & Horii, 1994) Ngược lại Iβ chủ yếu có trong thành phần cellulose hình thành nên thành tế bào của một số loài thực vật bậc cao như cotton và gai Ở đó, cellulose Iα chỉ chiếm khoảng 20%

Nhìn chung, cấu trúc tinh thể được coi như là một yếu tố quan trọng trong việc xác định các tính chất của cellulose mặc dù cho đến bây giờ vẫn có rất ít các nghiên cứu về sự tương quan giữa cấu trúc tinh thể và những đặc tính riêng biệt của cellulose được thực hiện

1.1.4 Tính chất của cellulose vi khuẩn

- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, thành phần tỉ lệ Iα cao

- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao, đặc biệt là cellulose I

- Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc

- Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và hemicellulose

- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên có thể phục hồi

- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt

- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao

- Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản xuất một

số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian Đặc biệt vi khuẩn

có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng các sợi chỉ cực nhỏ

- Có thể kiểm soát được đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn bằng cách tác động vào quá trình sinh tổng hợp cellulose của A xylinum Từ đó có thể kiểm soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử cellulose

Hình 2 Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) (Bielecki et al., 2001)

1.2 Vi sinh vật tổng hợp cellulose.

Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A xylinum được biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose hiệu quả nhất và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất Cấu trúc của cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh vật khác nhau là khác nhau Sau đây là bảng tổng quan về các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose

Bảng Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose

Trong đó, Acetobacter được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trong việc sản xuất cellulose Đặc biệt là A xylinum vì những đặc điểm ưu việt của nó như: năng suất tạo cellulose cao, cấu trúc cellulose phù hợp cho các mục đích sử dụng…

1.2.1 Phân loại A Xylinum

A xylinum là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này bao gồm các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter và Kozakia Các loài vi khuẩn này trước đây được gọi với các tên gọi Acetobacter xylinus hay Acetobacter xylinum, sau đó được xếp lại vào giống Gluconacetobacter với tên gọi Gluconacetobacter xylynus

A xylinum có thể được phân lập từ các nguồn khác nhau như từ nước quả (Kahlon & Vyas, 1971), hay từ một số loài thực vật như lá của cây cọ (Faparusi et al., 1974), từ giấm (Passmore & Carr, 1975), từ thạch dừa (Bernado et al., 1998), từ nấm Kombucha và trà (Hermann et al., 1928)

1.2.2 Đặc điểm hình thái của A xylinum.

• A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động, không sinh bào tử Là vi khuẩn Gram âm, chúng có thể đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi

• Nếu A xylinum phát triển trên môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chúng biến đổi thành dạng có hình thái đặc biệt như: dạng tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh hoặc không phân nhánh và dần dần sẽ gây thoái hóa giống làm giảm hoạt tính một cách đáng kể

• Khuẩn lạc của A xylinum có kích thước nhỏ, bề mặt nhầy và trơn, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn

Hình 3 SEM của A Xylinum

1.2.3 Đặc điểm sinh lý của A xylinum (Jonas et al., 1998)

• Oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O

• Phản ứng catalase dương tính: tạo bọt khí trong dung dịch lên men

• Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer

• Chuyển hóa glucose thành acid gluconic

• Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton

• Không sinh sắc tố nâu

• Tổng hợp cellulose

1.2.4 Đặc điểm sinh trưởng của A Xylinum

Lớp màng cellulose tạo ra gây trở ngại đến khả năng biến dưỡng, vận chuyển chất dinh dưỡng và oxi đến tế bào Tuy nhiên lớp màng này có thể giữ nước nên giúp

vi khuẩn có thể phân hủy chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại tia UV.A.xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau và tùy thuộc vào chủng

vi khuẩn mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất Chẳng hạn chủng A xylinum BPR 2001 sử dụng fructose tốt nhất (Matsuoka et al., 1993) trong khi chủng A xylinum IFO 13693 sử dụng glucose hiệu quả hơn (Masaoka et al., 1993)… A xylinum có thể chuyển hóa glucose thành acid gluconic, điều này là nguyên nhân làm cho pH của môi trường nuôi cấy giảm từ 1 đến 2 đơn vị trong quá trình nuôi cấy

Nhiệt độ tối ưu để A xylinum phát triển từ 25 0C đến 300C và pH từ 5,4 đến 6,3 Theo Hestrin (1947) thì pH tối ưu để A xylinum phát triển là 5,5 và không phát triển ở nhiệt độ 37 0C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu Theo Maccormide et al (1996) cho rằng A xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 đến 8, nhiệt độ từ

12 0C đến 35 0C và có thể phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol lên tới 10%.Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, lúc còn non khuẩn lạc mọc riêng lẻ, khuẩn lạc nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày Khi già tế bào mọc dính thành cụm,

và chúng mọc theo đường cấy giống

A xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế người ta thường bổ sung thêm acid acetic hay acid citric vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ và tăng hiệu suất tổng hợp cellulose

1.2.5 Vai trò của cellulose vi khuẩn đối với A xylinum.

Màng cellulose được sản xuất bởi A xylinum đóng nhiều vai trò cho sự phát triển và tồn tại của vi sinh vật trong tự nhiên

• Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn trong điều kiện thiếu thức ăn (Bielecki

et al., 2001)

• Sự tổng hợp và tiết cellulose bởi A xylinum giúp tế bào lơ lửng và tới được bề mặt giàu khí oxy vì đây là vi khuẩn hiếu khí Do đó chỉ những tế bào gần ranh giới lỏng khí của môi trường mới sản xuất cellulose (Krystynowicz et al., 2002; Watanabe

• Sợi cellulose giúp chống ảnh hưởng gây chết của tia UV 23% vi khuẩn acetic được bao bọc bởi màng cellulose có thể sống sót hơn 1 giờ khi bị chiếu tia UV (Bielecki et al., 2001)

1.3 Sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn A xylinum

1.3.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A Xylinum

Theo Ross et al (1991), con đường sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn từ glucose thành các sợi kết tinh đòi hỏi phải có sự tổng hợp uridine diphosphoglucose (UDP – glucose), sau đó là một phản ứng tổng hợp cellulose và cuối cùng là sự tập hợp lại thành sợi cellulose nhỏ để hình thành nên các dải tinh thể cellulose

UDP-Glucose là một nucleotide tiền thân của sự tổng hợp cellulose trong A xylinum Như sơ đồ dưới đây, quá trình sinh tổng hợp UDP-Glucose từ glucose là một quá tình trải qua 3 bước có sự tham gia của 3 loại enzyme Những bước này là sự phosphoryl hóa của glucose bởi xúc tác của enzyme glucokinase thành glucose-6-phosphate, sự izomer hóa của glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate bởi phosphoglucomutase và sự tổng hợp UDP-Glucose bởi UDP-Glucose pyrophosphorylase UDP-Glucose phosphorylase đóng vai trò then chốt trong sự sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A xylinum trong khi các chủng A xylinum đột biến

không có khả năng tổng hợp cellulose bị thiếu enzyme này (Valla & Kjosbakken, 1981).

Hình 4 Con đường tổng hợp cellulose trong A.xylinum

1.3.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn

Quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A xylinum trên được chia thành hai giai đoạn chính: giai đoạn polymer hóa và giai đoạn kết tinh

1.3.2.1 Giai đoạn polymer hóa

Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P) Sau đó enzyme phosphoglucomutase (PGM) tiếp tục chuyển hóa glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) thông qua phản ứng isomer hóa Glucose-1-phosphate được enzyme UDP-Glucose pyrophosphorylase chuyển hóa thành UDP-Glucose Cuối cùng, UDP-Glucose được polymer hóa thành cellulose và cellulose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose synthase (Iguchi et al., 2000)

Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn sẽ tạo cellulose theo con đường sau: lúc này hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành fructose-1-phosphate Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được chuyển hóa thành fructose-1,6-biphosphate nhờ enzyme fructose-1-phosphatekinase Sau đó, enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa fructose-6-phosphate thành glucose-6-phosphate Tiếp theo glucose-6-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra cellulose (Iguchi et al., 2000).

Hình 5 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn

1.3.2.2 Giai đoạn kết tinh

Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết β-1,4-glucan Các chuỗi glucan kết hợp với nhau tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi tiếp tục kết hợp với nhau

tạo thành các bó sợi và được phun ra ngoài môi trường thông qua các lỗ trên bề mặt vi khuẩn (hình 2.6) Ảnh chụp kính hiển vi điện tử bề mặt tế bào cho thấy có khoảng 50 –

80 lỗ sắp xếp thành hang dọc chiều dài của tế bào (Ross et al., 1991) Các lỗ này chính

là các vị trí sinh tổng hợp cellulose trên bề mặt tế bào Đây là những lỗ có đường kính khoảng 3,5 nm sắp xếp song song theo đường thẳng dọc trục vi khuẩn Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10 nm chứa enzyme tổng hợp cellulose Mỗi tiểu phần 10 nm tạo ra các chuỗi glucan hình thành vi sợi 1,5 nm

Hình 6 Sự giải phóng callulose ra môi trường ngoài từ A.xylinum

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp cellulose

1.3.3.1 Kiểu nuôi cấy

Có hai kiểu nuôi cấy thường được sử dụng để sản xuất cellulose vi khuẩn, đó là nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo

a.Nuôi cấy tĩnh

Đối với nuôi cấy tĩnh, người ta chuẩn bị những khay nhựa đã chuẩn bị môi trường và tiến hành nuôi cấy chủng A xylinum ở điều kiện tĩnh.

Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, những thớ sợi thứ cấp liên tục được lộ ra từ lỗ sắp xếp thẳng hàng trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết thành những vi sợi, lắng sâu xuống môi trường sinh trưởng, sau đó dải cellulose chồng chập và xoắn với nhau tạo thành tấm cellulose trên bề mặt canh trường dinh dưỡng, ngay mặt phân cách pha lỏng khí giàu oxy

Dù vẫn được sử dụng để sản xuất cellulose nhưng nuôi cấy tĩnh cho sản lượng thấp và mang tính thủ công Do đó, để sản xuất công nghiệp, cần thiết để thiết lập hệ thống sản xuất hàng loạt sử dụng kĩ thuật nuôi cấy hiệu quả hơn (Edwards, 1995)

b.Nuôi cấy có khuấy đảo

Tiến hành nuôi cấy trong thiết bị lên men chứa dung dịch môi trường, có cánh khuấy, thổi khí oxy hoặc lắc Vi khuẩn phân bố đều trong toàn dung dịch và phát triển theo chiều sâu của môi trường Cellulose được tạo ra có dạng viên hình cầu, elip,…Đây là kỹ thuật nuôi cấy mong đợi sẽ đem lại hiệu quả tạo cellulose cao, có thể ứng dụng trong sản xuất cellulose vi khuẩn thương mại nhưng hiện nay cellulose vi khuẩn chỉ mới được sản xuất với sản lượng thấp Sản xuất cellulose từ A xylinum bằng phương pháp nuôi cấy có khuấy đảo gặp phải một số trở ngại, trở ngại lớn nhất cho đến nay là tính không ổn định khi nuôi cấy Tính không ổn định được thể hiện bởi

sự mất khả năng sản xuất cellulose và thay thế dần tế bào sản xuất cellulose bằng chủng đột biến không có khả năng sản xuất cellulose (Hai-Peng et al., 2002; Chao et al., 1997)

Từ việc quan sát thấy rằng cellulose tổng hợp nhanh khi tế bào A xylinum được gắn vào những phần tĩnh trong bình lên men như điện cực, cánh khuấy, màng ngăn, Vandamme et al (1998) đã giới thiệu “điểm dính đa chức năng” trong bình nuôi cấy bằng cách cung cấp vào môi trường những phần tử nhỏ không tan như diatonit, silicagel, cát biển, những hạt thủy tinh nhỏ, đất mùn, cellulose thực vật được giã nhỏ,

… Nồng độ phần tử nhỏ đưa vào được tối ưu tùy theo mức độ khuấy, cũng như mức

độ lắc của khay (Yoshinaga et al., 1997)

Sự lựa chọn kỹ thuật nuôi cấy phụ thuộc vào mục đích thương mại của polymer sinh học, hơn nữa cấu trúc cellulose và đặc tính cơ lý của nó bị ảnh hưởng rất lớn của phương pháp nuôi cấy (Hai-Peng et al., 2002) Trong điều kiện nuôi cấy bề mặt, màng cellulose dày được tạo thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy Trong khi dưới điều kiện nuôi cấy chìm, cellulose lại được sản xuất dưới dạng huyền phù thớ sợi, những khối không đều, dạng viên kết hay dạng cầu kích thước từ 10 µm đến 1000 µm.

Hình 7 Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy thủy tĩnh (trái) và có

khuấy đảo (phải)Hình 8 thể hiện sự khác biệt về cấu trúc của cellulose khi nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo

Những phần tử hình cầu mịn của cellulose nuôi cấy chìm (Agitated bacterial cellulose – Ag-BC) có cấu trúc mắt lưới tương tự cấu trúc mắt lưới của màng mỏng cellulose thu được khi nuôi cấy bề mặt (Static bacterial cellulose – St-BC) Tuy nhiên

có vài sự khác biệt về hình thái trong những sợi nhỏ và trong cấu trúc này giữa St-BC

và Ag-BC Sợi cellulose của St-BC duỗi thẳng trong khi sợi của Ag-BC cong và rối, làm cấu trúc mắt lưới dày hơn so với cấu trúc St-BC Bên cạnh đó, chiều rông sợi Ag-

BC mỏng hơn so với St-BC, mặc dù rất khó xác định chính xác kích thước của mỗi sợi Hình thái này có được có thể do dòng chảy rối loạn và áp lực do dịch chuyển

không ngừng của môi trường khi nuôi cấy dưới điều kiện có khuấy đảo Những thay đổi về hình thái học có liên quan đến những thay đổi trong cấu trúc vi mô như trọng lượng phân tử, độ kết tinh, thành phần Iα, bảng 2.2 cho thấy rõ điều này.

Hình 8 Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh (a) và nuôi cấy có khuấy đảo (b)

Do những khác biệt về cấu trúc mà St-BC và Ag-BC có những tính chất có liên quan tới những ứng dụng thương mại cũng khác nhau như trình bày ở bảng 2.3

Khả năng giữ nước của cellulose vi khuẩn là khối lượng nước được giữ lại trên một đơn vị khối lượng của sợi cellulose, lượng nước này được giữ trên bề mặt và trong những phần tử tạo nên sợi cellulose.

Giá trị của chức năng duy trì lọc được định nghĩa là lượng phân tử CaCO3 bị giữ trên tờ giấy cellulose Phân tử nhỏ hơn và phân tán hơn của Ag-BC bị phân hủy có hiệu quả hơn phân tử của St-BC trong việc giữ lại các hột nhỏ vì phân tử của Ag-BC bị phân hủy có bề mặt hiệu dụng rộng hơn suốt quá trình lọc trong sản xuất giấy Trong trường hợp của chất ổn định nhũ tương, phân tử Ag-BC bao phủ bề mặt của những giọt dầu rộng hơn và nhũ tương chứa trong Ag-BC ổn định hơn

Do đó, Ag-BC thể hiện nhiều đặc tính phù hợp hơn cho những ứng dụng công nghiệp hơn St-BC (Watanabe et al., 1998)

1.3.3.2 Ảnh hưởng của thiết bị đến năng suất tạo thành cellulose vi khuẩn

Phương pháp sản xuất cellulose vi khuẩn truyền thống là nuôi cấy tĩnh, nhưng phương pháp này đòi hỏi phải có diện tích lên men lớn và thời gian lên men dài Do đó một số phương pháp khác được khảo sát để thay thế cho phương pháp nuôi cấy tĩnh.Thùng lên men khuấy trộn được dùng rộng rãi trong sản xuất cellulose vi khuẩn, nuôi cấy liên tục có bổ sung ethanol làm tăng tốc độ tổng hợp cellulose gấp 2 lần so với nuôi cấy mẻ Hơn nữa trong điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo, dễ dàng kiểm soát các yếu tố môi trường Tuy nhiên, khó khăn của quá trình nuôi cấy lắc là cellulose sinh

ra tích lũy trong môi trường làm cho môi trường có độ nhớt cao dẫn đến khó kiểm soát

quá trình khuấy trộn và sục khí Các viên huyền phù cellulose có độ giữ nước cao, nhanh chóng choáng hết thể tích môi trường, gây khó khăn cho vi sinh vật phát triển tạo cellulose (Klemm et al., 2001; Yoshinaga et al., 1997).

Một số thiết bị lên men sản xuất cellulose vi khuẩn:

a.Ajinomoto

Được đặt tên theo tên một công ty, phương pháp này sử dụng môi trường bề mặt nhằm cải thiện sự tổng hợp của cellulose Các tế bào đầu tiên được nhân giống trong thiết bị có sục khí trước khi được cho vào các khay tĩnh Sau 3 ngày trong thiết bị sục khí, mật độ tế bào vào khoảng 2x107 (tế bào/ml) Lúc này, dịch lên men được chuyển vào các khay có sục khí So sánh với quá trình lên men thông thường tạo cellulose thì thiết bị này cho năng suất cao hơn 140% Sản phẩm có khả năng giữ nước thấp và chứa khoảng 10% lượng sucrose ban đầu (Okiyama et al., 1992)

b Weyerhauser

Được đặt tên theo tên của một công ty Mỹ phát minh ra, một quá trình được phát triển để sản xuất sợi có kích thước nhỏ, khoảng 1/300 kích thước của bột gỗ Sử dụng các chất gây đột biến đổi hóa học để thay đổi các mức độ tác động của enzyme, chủng A.xylium được phân lập để làm giảm lượng chất phụ sinh ra trong quá trình sản xuất, bao gồm gluconic acid với việc điều chỉnh pH thấp hơn Rõ ràng hơn, chủng vi sinh vật được phân lập để sản xuất cellulose khi khuấy đảo Trước đây, khuấy đảo một dịch lên men để cung cấp oxy, và sự trao đổi chất, tổng hợp cellulose không ngừng Tuy nhiên, sản phẩm tạo ra từ phương pháp này là một dịch huyền phù sệt, nhớt, tên thương mại là Cellulon (Black et al., 1990)

c ICI

ICI (Imperial Chemical Industry) bao gồm 4 bước và sản xuất một chất sệt giống với hệ thống Weyerhauser Bước đầu tiên là bước tích lũy Khi đó vi khuẩn được phép phát triển trong một thiết bị phản ứng có khuấy đảo đến khi nguồn carbon được tiêu thụ hết Sau đó bổ sung nguồn carbon với tốc độ phù hợp cho sự tổng hợp cellulose

Bước cuối cùng là loại đi các huyền phù từ thiết bị phản ứng và say đó tách các tế bào

vi sinh vật ra khỏi sản phẩm (Serafica et al., 1998)

d Gengiflex®, Biofill® và BASYC®

Chủng A xylinum thích hợp được đưa vào một thiết bị, trong đó tạo điều kiện tối

ưu cho chúng phát triển Các điều kiện tối ưu cho sự sản xuất cellulose sau đó được áp dụng cho dịch lên men Tất cả các quy trình đều được phát triển trên môi trường cơ bản của Schramm và Hestrin (1954)

Gengiflex® được áp dụng trong công nghiệp nha khoa, cụ thể là được áp dụng để giúp hồi phục lại mô bao quanh răng (Novaes et al., 1997)

Biofill®, được sử dụng như là một dãy băng, có thể được ứng dụng băng các vết thương trong trường hợp bị phỏng hay bị loét Biofill® được sử dụng như da nhân tạo cho con người Mặt hạn chế lớn nhất của sản phẩm là bị giới hạn bởi tính co giãn khi ứng dụng để làm các vết băng tai những vùng có cường độ vận động cao Ngược lại,

ưu điểm của nó là giúp hồi phục nhanh chóng vết thương, và khả năng chống nhiễm trùng tốt Cellulose trong suốt cho phép kiểm tra, theo dõi vết thương dễ dàng trong khi Biofill® sẽ tách ra khi vết thương hổi phục Với việc rút ngắn thời gian và chi phí điều trị, Biofill® được đánh giá rất cao (Fontana et al., 1990)

Một nhóm các nhà hóa học, sinh vật học và giải phẫu học đã phát triển một sản phẩm gọi là BASYC® (Bacterial Synthesised Cellulose) BASYC® là một sản phẩm dạng ống dùng thay cho các mạch máu Các ống có đường kính trong khoảng 1mm và dài 5mm, được sử dụng thay thế cho mạch máu Công dụng khác của loại sản phẩm này là bề mặt trong của ống BASYC® nhẵn và trơn hơn các vật liệu tổng hợp khác khi

sử dụng cùng mục đích (Klemm et al, 2001)

e Thiết bị thu nhận cellulose liên tục

Thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm Sử dụng một dụng cụ có độ sâu không lớn để lượng môi trường cần thiết là tối thiểu, các sợi cellulose được thu bởi một trục quay liên tục với tốc độ 35mmh-1 Sau một thời gian thu nhận cellulose thì đem cellulose đi xử lý Ưu điểm lớn nhất của dạng thiết bị này là cellulose có thể được

thu nhận liên tục và môi trường mới được bổ sung sau mỗi 12 giờ (Sakairi et al., 1997).

f Thiết bị phản ứng có sục khí tuần hoàn và khuấy đảo

Trong một trường tĩnh, thời gian nhân đôi số lượng tế bào là từ 8 – 10 giờ, trong khi trong điều kiện có lắc đảo, thời gian này là 4 – 6 giờ (Canon và Anderson, 1991) Bằng cách tăng khuấy đảo và cung cấp oxy cho môi trường nuôi cấy, tốc độ sinh trưởng tế bào cũng tăng lên Do đó, khả năng sản xuất với tỷ lệ lớn là có thể, thiết bị lên men có khuấy đảo và có sục khí được nghiên cứu và mong muốn tạo ra cellulose dạng II Độ nhớt cao của môi trường và sức cản mạnh là trở ngại của phương pháp

Với phương pháp này thì sợi cellulose tạo ra có cấu trúc không bình thường (Kouda et al., 1997).

1.3.3.3 Ảnh hưởng của áp suất O2 đến quá trình tổng hợp cellulose vi khuẩn

Sự hình thành cellulose diễn ra tại vị trí mặt phân cách giữa không khí và lớp màng cellulose chứ không phải tại mặt phân cách giữa môi trường và cellulose Do đó

oxy là nhân tố quan trọng cho quá trình tổng hợp cellulose (Borzano & Desouza et al.,

1995)

Watanabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy ảnh hưởng đến cả sự hình thành cellulose cũng như sức sản xuất màng Cellulose tăng trưởng dưới áp suất oxy thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với cellulose tăng trưởng trong điều kiện áp suất cao hơn Điều này có thể ảnh hưởng trực tiếp đến tính dai của lớp màng Hơn nữa, với áp suất oxy là 10% tính sản xuất cellulose cao hơn 25% mà không ảnh hưởng đến

sự tăng trưởng của tế bào Sự tổng hợp cellulose tại áp suất 10% và 15% cao hơn so với đều kiện áp suất khí quyển Tuy nhiên, hàm lượng oxy cao trên 50% lại hạn chế

khả năng tổng hợp cellulose của vi sinh vật (Yamanaka & Watanabe et al., 1995).

1.3.3.4 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sản phẩm cellulose vi khuẩn