Công nghệ sản xuất Bacteriocin và ứng dụng của Bacteriocin trong công nghệ thực phẩm

Trong khi chất kháng sinh được định nghĩa là những chất do vi khuẩn prokariotes hay eukaryotes sản sinh, ở nồng độ thấp có khả năng ức chế những vi sinh vật khác thì bacteriocin được miê

MỤC LỤC

I Tổng quan về bacteriocin

1.1 Lịch sử phát triển

Bacteriocin được khám phá năm 1925, khi Gratia quan sát khả năng ức chế của E.Coli sinh ra một loại chất bền với nhiệt, với nồng độ rất nhỏ vẫn có thể ức chế sự phát triển trong môi trường lỏng

Năm 1948, loại chất này được đặt tên là Colicin và nó được chia thành 17 loại dựa trên

sự hấp phụ đặc hiệu của nó

Năm 1953, Jacod và các đồng sự phát hiện ra rằng các chất kháng khuẩn thuộc tuyp Colicin cũng có thể được sản sinh bởi các vi khuẩn không thuộc dạng trực khuẩn đường ruột, thuật ngữ “bacteriocin” ra đời Trong khi chất kháng sinh được định nghĩa là những chất do vi khuẩn (prokariotes hay eukaryotes) sản sinh, ở nồng độ thấp có khả năng ức chế những vi sinh vật khác thì bacteriocin được miêu tả là các ohân tử có chứa protein trong cấu trúc có hoạt tính kháng khuẩn đối với các loài vi khuẩn khác, nhất là các chủng trong cùng một loài

Nhiều nghiên cứu cho thấy, bacteriocin có thể được sinh ra bởi cả hai loại vi khuẩn gram dương và gram âm Các nghiên cứu về bacteriocin do vi khuẫn gram dương ngày càng nhiều nhờ tiềm năng rất lớn ứng dụng vào bảo quản thực phẩm hoặc ứng dụng để ngăn ngừa và giải quyết vấn đề nhiễm khuẩn trong y học

Trong bảo quản thực phẩm, đã có một số loại bacteriocin (Nisin, Natamysin) được chấp nhận như chất bảo quản ở Hoa Kì và hơn 20 quốc gia trên thế giới Như đã biết vi khuẩn lactic đóng vai trò rất quan trọng trong các loại thực phẩm lên men Một vài loại vi khuẩn lactic có khả năng ức chế rộng rãi sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm

1.2 Khái niệm Bacteriocin

Trong một quần thể, mỗi tế bào vi sinh vật đều có những cơ chế tự bảo vệ và cạnh tranh Hầu như tất cả các loại vi khuẩn trong quá trình sinh trưởng, phát triển, chúng đều có thể

tổng hợp các hợp chất có khả năng ức chế các vi khuẩn khác nhau và đôi khi ngay cả bản thân cũng bị ức chế Các loại phân tử này bao gồm:

• Độc tố vi khuẩn (Ví dụ: diphtheria, tetanus, cholera…)

• Các enzyme làm tan tế bào vi khuẩn như: lysostaphin, phospholipase A,

• Các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như acid hữu cơ, ammonia, diacetyl,

• Chất kháng sinh phổ rộng cổ điển như: glamicidin, valinomycin, bacitracin,…

• Bacteriocin và các hợp chất giống bacteriocin

Bacteriocin là những chất có bản chất protein có hoạt tính kháng khuẩn được sinh tổng hợp từ nhiều loại vi khuẩn Tuy nhiên trong công nghiệp bacteriocin chủ yếu được sản xuất từ vi khuẩn lactic nhờ tiềm năng sử dụng trong bảo quản thực phẩm như là chất bảo quản tự nhiên

So với các chất kháng sinh thì bacteriocin cũng có hoạt tính kháng khuẩn, nhưng khác với kháng sinh ở chổ bacteriocin có tính đặc hiệu như enzyme, chỉ tác động lên một số vi sinh vật, do đó khả năng kháng lai bacteriocin là rất cao

1.3 Phân loại Bacteriocin

Cho tới nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc phân loại chúng vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó đang là vấn đề tranh cãi

Bacteriocin được phân loại với nhiều tiêu chí khác nhau như: họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và trình tự chuỗi amino acide Bacteriocin được chia làm ba lớp

Lớp I: Lantibiotics là những peptide nhỏ có trọng lượng phân tử (< 5kDa) ổn định nhiệt

hoạt động theo những cấu trúc màng tế bào Lantibiotic bacteriocin lớp I được chia thành hai lớp phụ

Lớp Ia: bao gồm một cách tương đối hình thon dài, nói chung nó hoạt động bằng việc tạo những lỗ trong màng tế bào chất của loài nhạy cảm Nisin thuộc vào nhóm này

Lớp phụ Ib: là những peptit đặc trưng hình cầu,không linh động, tích điện âm hoặc không tích điện chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây nhiễu đối với những phân tử enzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm Đại diện: Mersacidin…

Bacteriocin lớp I (a):Nisin; (b): Mersacidin

Lớp II: Non-Lantibiotics là những peptide có trọng lượng phân tử biến thiên, nhưng

thông thường nhỏ (< 10 kDa), ổn định nhiệt, chứa những aminoaxít thông thường Nhóm này được chia cắt vào trong ba nhóm nhỏ:

Lớp IIa: là lớp lớn nhất gồm những peptide hoạt động chống Listeria, đại diện đặc trưng cho nhóm này là pediocin PA-1 Leucocin A và Sakacin P Các bacteriocin nhóm này hứa hẹn có những ứng dụng nhiều trong công nghiệp nhờ vào hoạt động kháng Listeria mạnh của chúng Thậm chí chúng còn được chú ý hơn nhiều so với bacteriocin lớp I (nisin) vì chúng không có phổ ức chế rộng vì vậy chúng không tiêu diệt các giống khởi động

Leucocin A

Lớp IIb:được hình thành bởi phức hợp của hai peptide riêng biệt, những peptide này ít hoặc không hoạt động Bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là: Lactococcin G, Plantaricin EF và Plantaricin JK

Plantaricin

Lớp IIc: là những peptide nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacteriocin không đồng nhất nên phương thức hoạt động của chúng cũng khác nhau.Trong phân lớp này chỉ tìm thấy các bacteriocin như Divergicin A và Acidocin B

Lớp III: lớp này bao gồm các peptide lớn có trọng lượng phân tử lớn > 30 kDa, không

tan, không bền nhiệt Nhóm này bao gồm các enzyme ngoại bào kháng lại các vi khuẩn

có thể bắt chước các hoạt động sinh lí của bacteriocin Các bacteriocin lớp III cho đến nay chỉ được phân lập từ các thành viên giống Lactobacillus Đại diện: Acidofilicin A và Lactacins A,B

1.4 Bản chất hóa học

Protein

Tất cả các bacteriocin đều có chứa protein hoặc các peptid trong phân tử Protein hoặc peptid đóng vai trò quan trọng trong chức năng diệt khuẩn của bacteriocin Một số loại bacteriocin chứa tổ hợp nhiều phân tử protein liên kết lại với nhau

Các amino acid bất thường trong phân tử một số loại bacteriocin giúp tạo nên một cấu trúc phân tử vững bền hơn, hoặc làm tăng hoạt tính sinh học của phân tử

Một số loại bacteriocin còn có chứa các amino acid chưa bão hòa trong phân tữ như didehydroalamine Các amino acid này là sản phẩm của phản ứng dehydrate hóa các hydroxyl amino serine và threonine

Các thành phần khác

Một số bacteriocin không chỉ nhạy cảm vớ protease mà còn lipase, phospholipase, amylase Điều này chứng tỏ bacteriocin còn chứa nhiều thành phần khác như: lipid, glucid, phospholipid Ví dụ: Lactocin 27 được cấu tạo từ phức hợp lipocarbohydrate protein Caseicin LSH và Leuconocin 3 là các glycoprotein

Sự hiện diện của cầu nối –S – S – hoặc thioether trong cầu trúc cũng ảnh hưởng đến độ bền và hoạt tính của bacteriocin

Đặc điểm

o Bacteriocin thuộc nhóm các sản phẩm trao đổi chất bậc 2, do bacteriocin khi sinh ra không tham gia vào quá trình trao đổi chất của chính tế bào sinh tổng hợp ra nó

o Bacteriocin có khả năng chống lại một số vi khuẩn gram dương, là những tế bào có mối quan hệ gần gũi hoặc cùng họ với loại tế bào đã sinh tổng hợp ra bacteriocin Ngoài ra còn có một số loại bacteriocin có khả năng chống lại các vi khuẩn gram âm như Listeria, E.Coli hay Samonella…

o Bacteriocin là nhửng cấu trúc chịu nhiệt tốt có chứa protein và hoạt tính hoạt động tốt ở

pH acid hoặc trung tính, mất hoạt tính ở pH >8 Hầu hết bacteriocin mang điện dung kỵ nước mạnh mẽ và điểm đẳng điện lớn

o Bacteriocin có khả năng gắn đặc hiệu với cơ quan thụ cảm trên bề mặt tế bào

o Khả năng tổng hợp bacteriocin hay khả năng miễn dịch của tế bào đối với bacteriocin của chính nó được quyết định bởi các gen nằm trên plasmid, nhiễm sắc thể hoặc transposons

o Nồng độ bacteriocin cao có thể giết chất chính tế bào vi khuẩn sản sinh ra nó

o Bacteriocin bị mất hoạt tính bởi các enzyme như: trypsin, pepsin, …

1.5 Nisin - Một đại diện của Bacteriocin

1.5.1 Giới thiệu Nisin

- Nisin do Rogers phát hiện lần đầu tiên vào năm 1928

- Năm 1959 mới được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm ở Anh

- Năm 1969 FAO, WHO đã công nhận nisin là một phụ gia thực phẩm an toàn và được phép sử dụng cho người ở 50 quốc gia trên thế giới bao gồm các nước trong liên minh Châu Âu và một số nước ở Châu Á, Châu Phi

- Ở Mỹ, nisin cũng đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) công nhận là an toàn, được coi là chất bảo quản có nguồn gốc sinh học và dùng như một phụ gia thực phẩm từ năm 1988 cho đến nay

- Với khả năng kháng khuẩn tốt, khi bổ sung vào thực phẩm nisin không làm làm ảnh hưởng đến các chất dinh dưỡng cũng như màu, mùi vị, hay trạng thái của thực phẩm đồng thời lại an toàn với sức khỏe cong người nên nisin được sử dụng rộng rãi như một phụ gia bảo quản

- Trong công nghiệp, nisin được thu bằng cách nuôi Lactoccus lactis trong sữa, hoặc trong dung dịch đường dextrose Quá trình sản xuất được tuân theo các điều kiện

vệ sinh rất nghiêm ngặt và đáp ứng được các tiêu chuẩn khắt khe nhất đối với thực phẩm

1.5.2 Cấu tạo Nisin

- Nisin là đại diện điển hình lớp Ia của các bacteriocin, là một peptide có khả năng kiềm hãm nhiều loại vi khuẩn Gram dương, chúng dễ bị phân hủy bởi các enzyme đường tiêu hóa và không độc với người

- Nisin có hoạt tính kháng vi sinh vật, là một tác nhân kháng khuẩn tự nhiên và không thể tổng hợp nhân tạo

- Nisin là một peptit kháng khuẩn đa vòng, được cấu tạo từ 34 gốc axit amin do các chủng vi khuẩn lactic sinh ra (Lactococcus lactic, Steptococcus)

- Trong thành phần của nisin có chứa các axit amin như: Leucin, Valin, Alanin, Methionin, Glycin, Prolin, Histidin, Lyzin, acid Glutamic, acid Aspartic, Serin, Lanthionine (Lan), Methyllanthionin (MeLan), Didehydrolanine (DHA) và acid didehydroaminobutyric (Dhb)

Cấu tạo của nisin

1.5.3 Tính kháng khuẩn của Nisin

Nisin có hiệu quả trong việc kiểm sóat một loạt các vi khuẩn gram dương và các bào

tử của chúng bao gồm: Listeria, Enterococus và Clotridium (gây ngộ độc thực phẩm bằng cách sinh độc tố) Nếu các vi khuẩn này hiện diện với số lượng lớn hay khi chúng phát triển mạnh trong thực phẩm, sẽ sản sinh lượng độc tố đủ mạnh có thể gây

ra ngộ độc thực phẩm cấp tính Với các biểu hiện nôn mửa, tiêu chảy, đau quặn bụng, nhức đầu xảy ra sau khi ăn thực phẩm bị ô nhiễm khoảng 2 - 48 giờ, nặng hơn có thể dẫn đến tử vong, đặc biệt ở nhóm đối tượng có sức đề kháng yếu, phụ nữ mang thai, người già và trẻ em.

Khi sử dụng riêng lẻ nisin không có hiệu quả trên vi khuẩn gram âm (như E.coli), nấm men và nấm mốc Trong trường hợp bình thường, các vi khuẩn gram âm có khả năng kháng nisin chủ yếu là do màng không thấm nước bên ngoài của chúng Tuy nhiên, nisin có thể được hiệu quả chống lại các vi khuẩn gram âm nếu được sử dụng kết hợp với các tác nhân gây mất ổn định màng tế bào bên ngoài như khi xử lý ở các điều kiện làm lạnh, nhiệt độ cao, trong môi trường pH thấp (pH 2-6), hay khi sử dụng kết hợp với chất bảo quản khác như lysozyme (từ lòng trắng trứng), enterocin (một

chất kháng khuẩn mới được phân lập từ Enterococcus faecium)…

1.5.4 Cơ chế hoạt động

Nisin có thể bám dính lên thành tế bào vi khuẩn mà không cần các thụ thể (khả năng bám dính phụ thuộc vào pH môi trường do độ bền và độ hòa tan của nisin biến đổi phụ thuộc vào pH của môi trường: chúng tan tốt ở pH axit, tan kém ở pH trung tính và không tan ở pH kiềm) Sau đó, nisin tại các lỗ tạm thời làm mất áp suất thẩm thấu, các ion di chuyển qua màng tế bào một cách tự do dẫn đến sự rối loạn trong việc vận chuyển các chất dinh dưỡng qua màng tế bào, ảnh hưởng đến sự tổng hợp ATP Ngoài

ra, nisin còn ức chế quá trình tổng hợp peptidoglycan nên chỉ có tác động lên vi khuẩn Gram dương Nisin có hiệu quả trong việc kiểm sóat một loạt các vi khuẩn gram

dương và các bào tử của chúng bao gồm: Listeria, Enterococus và Clotridium .

1.5.4 Nisin trong chế biến và bảo quản thực phẩm

Cũng như bất kỳ chuỗi axit amin và các protein khác, nó được phân hủy trong quá trình tiêu hóa trong ruột và không gây ra ảnh hưởng cho sức khỏe Thêm vào đó, các công trình nghiên cứu ứng dụng nisin cho thấy nisin có khả năng tiêu diệt một số loại

vi khuẩn bằng cách tấn công vào thành tế bào của vi khuẩn có hại nhưng lại không gây ảnh hưởng đến nhiều loại vi khuẩn có lợi dùng trong công nghệ lên men và trong

hệ tiêu hóa của người và không độc đối với người

Với khả năng kháng khuẩn tốt, khi bổ sung vào thực phẩm nisin không làm làm ảnh hưởng đến các chất dinh dưỡng cũng như màu, mùi vị, hay trạng thái của thực phẩm đồng thời lại an toàn với sức khỏe cong người nên nisin được sử dụng rộng rãi như một phụ gia bảo quản

Những năm gần đây, mối quan tâm về tính an toàn và chất lượng của thực phẩm đã thôi thúc các nhà khoa học khám phá và phát triển phương pháp mới trong bảo quản thực phẩm, đặc biệt là các bacteriocin Tuy nhiên đến nay, tác dụng của các bacteriocin trong thực phẩm chủ yếu là trên thí nghiệm

Hiện nay, chỉ có hai bacteriocin được thương mại là nisin từ Lactococcus lactis và

pediocin PA-1/AcH từ Pediococcus acidilactici, chúng đều được sử dụng trong công

nghiệp thực phẩm Nisin và pediocin PA-1/AcH có tên thương mại tương ứng là Nisaplin, ALTA

Tại Việt Nam, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam là cơ quan đầu tiên khởi xướng những nghiên cứu về nisin Trong khuôn khổ đề tài cấp Viện KHCNVN, các nhà khoa học Viện Công nghệ Sinh học đã tiến hành nghiên cứu công nghệ lên men và thu hồi nisin từ vi khuẩn Lactococcus lactis Nội dung nghiên cứu bao gồm: lựa chọn môi trường, thành phần môi trường, tác động của pH đối với sinh trưởng và tổng hợp nisin của chủng Lactococcus lactis 145, nghiên cứu thiết lập mô hình lên men và công nghệ thu hồi nisin Kết quả đã thiết lập được quy trình lên men điều khiển và quy trình thu hồi bằng hấp phụ tế bào, nhờ đó năng suất tổng hợp nisin của chủng tăng lên gần hai lần và sản phẩm nisin thu được có độ tinh sạch rất cao

Nhóm chúng em xin trình bày về quy trình này:

2.5 Quy trình sản xuất Nisin

Giống vi sinh vật

Tế bào L.Lactis

Lên men

Hấp phụ tế bào

Thu hồi Nisin Dịch sau lên men

Xử lí Môi trường lên men

2.6 Môi trường lên men

Môi trường CM có nguồn cacbon là sacaroza cho năng suất sinh tổng hợp nisin của chủng tốt hơn so với các môi trường MRS và M17 Trong công thức môi trường CM,

hàm lượng sacaroza 40g/l, K2HPO4 10g/l đựơc xác định là có ảnh hưởng rất mạnh, trong khi nguồn thay thế cho pepton và cao malt là sữa đậu nành 20% cũng rất thích hợp để

lựa chọn cho lên men ở thể tích lớn

Thành phần môi trường CM (g/l): Sacaroza 40g/l, cao nấm men 10 g/l, peptn (soy)

10g/l, K2HPO4 10g/l, NaCl 2g/l, MgSO4.7H2O 0.2 g/l, pH 6.5-6.8

2.7 Vi sinh vật sử dụng

Chủng vi sinh vật: Chủng Lactococcus lactis 145 có đặc tính sử dụng sacaroza làm

nguồn cacbon là một đặc điểm quan trọng được lựa chọn

2.8 pH

pH là một yếu tố có ảnh hưởng quan trọng đặc biệt đối với lên men vi khuẩn lactic

nói chung và tổng hợp nisin nói riêng Việc giảm pH trong các quá trình lên men lactic là một quy luật và có tác động đặc biệt đến sinh tổng hợp nisin của chủng L.lactis 145

Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp của chủng 145 phản ánh những biến diễn cũng

như tác động của việc giảm pH đối với quá trình sử dụng cơ chất sacaroza, sinh trưởng

và tổng hợp nisin

2.9 Mô hình lên men cố định pH và bổ sung Cacbon

Mô hình lên men cố định pH và bổ sung nguồn cacbon

Trong mô hình lên men cố định pH và bổ sung nguồn cacbon, quá trình sinh tổng

hợp nisin đạt cực đại ở mức cao hơn rất nhiều so với hai mô hình trước Hoạt tính tổng

hợp nisin đạt cực đại là 3450 IU/ml ở giờ thứ 10 so với 1960 IU/ml ở lên men thông

thường và 2750 IU/ml ở lên men cố định pH Thời gian tổng hợp nisin ở mức cao, từ

3100 đến 3500- 3450 -3200 IU/ml diễn ra từ giờ thứ 8 đến giờ thứ 18 của quá trình lên

men Bằng việc bổ sung thành phần dinh dưỡng liên tục kết hợp điều khiển cố định pH = 6.5 không chỉ nâng cao năng suất sinh tổng hợp nisin lên 179% mà còn kéo dài thời gian đạt năng suất cực đại

Sơ đồ quy trình sản xuất Nisin

Kết quả: Quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp Nisin ở chủng Lactococcus lactis

145 bị ảnh hưởng rất nhiều bởi sự thay đổi pH, giảm nguồn dinh dưỡng và nguồn năng lượng trong môi trường Lên men theo mẻ (batch fementation) là mô hình thường được lựa chọn để sản xuất Nisin Tuy nhiên mô hình này bị tác động do sự biến đổi pH cũng như suy giảm dinh dưỡng Thiết lập mô hình lên men theo đó pH được điều khiển cố định tại 6.5 và nguồn cacbon sacaroza được cung cấp liên tục đạt nồng độ 40g/l trong suốt quấ trình đã cải thiện đáng kể hoạt tính tổng hợp nisin của chúng Trong mô hình lên men điều khiển này năng suất đã tăng lên 179% và thời gian đạt năng suất cực đại cũng kéo dài hơn so với mô hình thường