- Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi (3 điểm) lên bề mặt MT Ủ trong tủấm 300C trong 34 ngày.
2.2.3.3. Phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng sinh [21]
a. Nguyên tắc
Chất kháng sinh do nấm sợi sinh ra sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định làm cho VSV khơng phát triển được xung quanh lỗ khoan chứa dịch kháng sinh hay khối thạch chứa nấm tạo thành vịng vơ khuẩn trong suốt.
b. Cách tiến hành
- Cấy nấm sợi trên MT YEA khơng cĩ thạch, rồi ủ ba ngày ở nhiệt độ
phịng. Ly tâm 3000 vịng/ 10 phút, thu dịch kháng sinh.
- Dùng khoan nút chai khoan các khối thạch của MT cĩ chứa VSV kiểm định (E.coli, Bacillus subtilis).
- Dùng pipet vơ trùng nhỏ 0,1ml dịch kháng sinh vào các lỗ khoan. - Để trong tủ lạnh 40C trong 8 giờ để dịch kháng sinh khuếch tán vào trong thạch. Sau đĩ chuyển sang tủ ấm 300C. Kiểm tra vịng ức chế sau 24h.
c. Kiểm tra kết quả
Nếu nấm nghiên cứu sinh ra chất kháng sinh sẽ cĩ một vịng trong suốt xung quanh khối thạch do các chất kháng sinh đã ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vịng trịn trong suốt (vịng vơ khuẩn) xung quanh lỗ khoan. Khả năng sinh kháng sinh được đáng giá bằng hiệu số (D-d, mm).
Quy ước:
D-d ≥ 25mm : hoạt tính kháng sinh rất mạnh.
D-d ≤ 20mm : hoạt tính kháng sinh mạnh.
D-d= 15 ÷18mm : hoạt tính kháng sinh trung bình.
D-d < 15mm : hoạt tính kháng sinh yếu.
2.2.3.4. Phương pháp kiểm tra khả năng phân giải dầu[29]
Cấy nấm sợi trong bình tam giác 100 ml cĩ chứa 50 ml MT khống (MT 10). Sau 15 ngày nuơi cấy tĩnh ở nhiệt độ phịng, sau đĩ đo sinh khối của nấm sợi, quan sát sự phân bố các giọt dầu và mùi dầu để đánh giá khả năng
phân giải dầu của nấm sợi.
Cách đo sinh khối nấm sợi: Khi cho bào tử nấm sợi vào bình tam giác,
đo khối lượng của bình tam giác bằng cân phân tích điện tử. Sau khi nuơi cấy 15 ngày, cân lại bình tam giác để biết được sinh khối của nấm sợi.
2.2.3.5. Phương pháp xác định ảnh hưởng yếu tố MT đến sinh
trưởng và phát triển của nấm sợi
Phương pháp thử khả năng đồng hĩa nguồn cacbon, nitơ [21]
- Để xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự sinh trưởng của nấm sợi nghiên cứu, chúng tơi sử dụng MT1 trong nước biển, glucose lần lượt
được thay bằng các nguồn cacbon: lactose, sucrose, maltose, sorbitol,
galactose. Trọng lượng các chất thay thế được lấy đúng bằng hàm lượng cacbon trong MT1. Mẫu đối chứng là MT1.
- Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ, dùng MT1. Nguồn NaNO3 lần lượt được thay bằng các nguồn nitơ khác: Bột đậu, cao thịt, cazêin, gelatin, urea, NH4NO3 với hàm lượng tương tự.
Mẫu đối chứng là MT 1.
Cấy chấm điểm các nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt các MT tương ứng, sau đĩ để trong tủ ấm trong 3 ngày, đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon, nitơ bằng mức độ phát triển của các KL bằng cách đo đường kính KL d (mm).
Quy ước: * d = 0 mm : khơng mọc * d =1÷ 2mm : mọc yếu * d = 2,1 ÷ 5mm : mọc trung bình * d = 5,5 ÷ 10mm : mọc tốt * d = 11 ÷ 30mm : mọc rất tốt Phương pháp thử khả năng chịu mặn của nấm sợi[21] - Chuẩn bị MT YEA (MT3), cĩ bổ sung các nồng độ muối NaCl từ 3%,
5%, 7%, 10%.
- Cấy 3 điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu lên trên bề mặt các MT nghiên cứu cĩ nồng độ muối khác nhau.
- Nuơi trong tủ ấm trong 3 ngày.
- Dựa vào đường kính KL d (mm) của các chủng nấm sợi nghiên cứu
đểđánh giá khả năng chịu mặn.
- Mẫu đối chứng nuơi trên MT khơng cĩ nước biển.
Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH [21]
Sử dụng MT1 trong nước biển, điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hoặc HCl 10% để cĩ các giá trị pH khác nhau: 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0. Thanh trùng MT rồi cấy chấm điểm các giống nấm sợi nghiên cứu, sau đĩ để trong tủ ấm trong 3 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng của các chủng nấm sợi dựa vào đường kính KL d (mm) theo quy ước như 2.2.3.3.
Phương pháp thử khả năng chịu nhiệt của nấm sợi [21] Sử dụng MT 1, cấy chấm điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu. sau đĩ ủ ở các nhiệt độ khác nhau: 250C, 300C, 400C, 500C trong 3 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm sợi dựa vào đường kính KL d (mm).
Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian [21]
Sử dụng MT 1, cấy chấm điểm các giống nấm sợi nghiên cứu. Sau đĩ
ủ trong tủ ấm. Mỗi ngày đo đường kính KL để biết tốc độ sinh trưởng của nĩ.
2.2.3.6. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng của MT đến
khả năng sinh enzym cellulase của nấm sợi[3], [22].
Ảnh hưởng nguồn cacbon
Để xác định ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đĩng vai trị là chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase, ta tiến hành nuơi các chủng nấm sợi trên MT bán rắn với tỉ lệ cacbon khác nhau như sau:
- 6 cám: 4 bã mía (6C:4BM) - 6 cám : 4 giấy lọc (6C:4GL) - 6 cám : 4 mạt dừa (6C:4MD) - 6 giấy lọc : 4 cám (6GL:4C) Mẫu đối chứng là MT xốp cơ sở (MT 11).
Ảnh hưởng nguồn nitơ
Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ vơ cơ và hữu cơ đến quá trình sinh tổng hợp cellulase, ta tiến hành nuơi trên MT 11 cĩ bổ sung thêm 0,5% Urê. 0,5% (NH4)2SO4, 0,5% NaNO3, 0,5% pepton, 0,5% cao thịt, 0,5% cao nấm men, 0,5% cao malt [3].
Ảnh hưởng pH
Để xác định ảnh hưởng pH đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase của các chủng nấm sợi nghiên cứu, tiến hành nuơi trên MT 11. Dùng HCl 5% NaOH 5% điều chỉnh pH MT về các độ pH 3, 4, 5, 6, 7, 8.
Ảnh hưởng độẩm
Để xác định ảnh hưởng độ ẩm đến sinh tổng hợp enzym cellulase ta cũng nuơi trên MT 11 điều chỉnh độ ẩm bằng nước biển vơ trùng về các độ
ẩm 50%, 55%, 60%, 65%, 70%.
Ảnh hưởng độ mặn
Để xác định ảnh hưởng của độ mặn đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase, ta cũng nuơi trên MT 11 với các nồng độ muối khác nhau 0%, 3%, 5%, 10%, 20%.
Ảnh hưởng nhiệt độ
Để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ ta cũng nuơi trên MT 11 và ủ ở các nhiệt độ khác nhau 250C, 300C, 400C, 500C.
Ảnh hưởng thời gian
gian khác nhau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ.
Sau khi nuơi ủ, ly trích enzym cellulase theo phương pháp 2.2.2.6 và
đánh giá khả năng sinh enzym cellulase theo phương pháp 2.2.3.1.