2.2.3.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzym carboxymethyl
cellulase (CMCase)[28], [40]
a. Nguyên tắc
Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzym cần thiết để giải phĩng ra đường khử (như glucose) khi thủy phân CMC ở tốc độ 1µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng.
Phương pháp này dựa vào sự thủy giải cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) bằng enzym carboxymethyl cellulase (CMCase) ở pH 5,0 và 400C. Sau phản ứng sẽ tạo ra một lượng đường khử, đường khử sẽ phản ứng với 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid tạo thành phức màu đỏ sậm và được xác định bằng máy đo mật độ quang ở bước sĩng 540nm.
Các hĩa chất cần chuẩn bị:
- Dung dịch cơ chất CMC 1%: Cân chính xác 1,0g CMC, hịa tan
trong 80 ml dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH 5, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch đệm đến vạch và lắc đều.
- Dung dịch enzym: Pha lỗng dịch enzym với dung dịch đệm Na- acetate 50 mM, pH 5,0 đến độ pha lỗng thích hợp.
- Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS). - Dung dịch lactose.
- Dung dịch DNS-lactose.
* Dựng đường glucose chuẩn
Hịa tan 100 mg glucose với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều, ta được dung dịch glucose nồng độ 1mg/ml.
Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng sau đây:
Số thứ tự các ống/ nồng độ glucose (mg/ml) 1/0 2/0,1 3/0,2 4/0,3 5/0,4 6/0,5 7/0,6 - dd glucose 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - dd CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 - dd DNS- lactose 2 2 2 2 2 2 2 Các ch ấ t b ổ sung (ml) - Nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4
Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sơi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phịng trong một chậu nước mát. So màu trên máy quang phổ UV/Visible Spectrophometer, bước sĩng 540 nm.
dựng đường biểu diễn sự biến thiên của OD và nồng độ glucose chuẩn.
Đường này là một đường thẳng đi qua gốc tọa độ.
* Tiến hành phản ứng
- Hút 1ml dung dịch enzym cho vào ống nghiệm thử thật (ống TN), thay 1 ml dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH 5 đối với ống đối chứng (ĐC) - Đặt vào bể ổn nhiệt 400C/5 phút. Đồng thời ta cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 400C/5 phút.
- Sau đĩ, thêm 1 ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzym
và lắc đều. Để phản ứng ở 400C chính xác 10 phút.
-Thêm 2 ml dung dịch DNS-lactose, lắc đều để phản ứng enzym.
- Đem đun sơi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phịng trong một chậu nước mát.
- So màu ở bước sĩng 540nm, dựa theo đường glucose chuẩn tính được nồng độ glucose của mẫu thí nghiệm.
c. Tính kết quả
-Giá trị hệ số glucose trung bình (F):
F = (0,1/AG0,1 + 0,2/AG0,2 +….+0,6/AG0,6)/6
- Hoạt tính enzym :
CMCase (IU/g) = ( AT – AB) x F x (1.000/180) x (1/10phút) x (1/1.0 ml) x (1/C)
Trong đĩ:
F : Hệ số glucose (mg/ml)
AG : Độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn.
AT : Độ hấp thụ của dung dịch cĩ phản ứng enzym (ống TN)
AB : Độ hấp thu của dung dịch khơng cĩ phản ứng enzym (ống ĐC). 1.000: Hệ số chuyển đổi mg thành µg.
180 : Trọng lượng phân tử của glucose, đổi từ µg sang µmol. 10 phút: Thời gian phản ứng.
1.0 : Thể tích dung dịch enzym (ml). C: Nồng độ dung dịch mẫu (g/ml).
2.2.3.2. Phương pháp xác định hoạt độ enzym ngoại bào của nấm sợi
bằng cách đo đường kính vịng thủy phân[47]
a. Nguyên tắc
Cho enzym tác dụng lên cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy,
độ đục MT giảm, MT trở nên trong suốt. Độ lớn của phần MT trong suốt phản ánh hoạt động của enzym.
Phương pháp này chỉ định tính enzym, chỉ đánh giá sơ bộ chứ chưa nghiên cứu sâu.
b. Tiến hành thí nghiệm
* Phương pháp cấy chấm điểm
- Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thử hoạt tính enzym ngoại bào với các cơ chất tương ứng MT 6, MT7, MT8, MT9, MT10.
- Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi (3 điểm) lên bề mặt MT. - Ủ trong tủ ấm 300C trong 3-4 ngày.