Một số chế phẩm enzym cellulase trên thế giới và Việt Nam
Ngày nay, trên thế giới và cả Việt Nam, các chế phẩm sinh học chứa các VSV cĩ khả năng sinh các loại enzym được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi và phổ biến trong các lĩnh vực chăn nuơi, trồng trọt,…. Điều này giúp giảm bớt giá thành sản xuất, hạn chế được tình trạng ơ nhiễm MT. Enzym cellulase kỹ thuật chủ yếu được thu nhận từ Trichoderma reesei, Aspergillus niger…và gần đây là các chủng vi khuẩn [30].
Ở Đan Mạch, hãng Novo Nordisk cĩ chế phẩm “Celluclast” dùng trong thức ăn gia súc [40].
Ở Pháp, hãng Lyven dùng “Cellulases” từ T. reesei và từ A. niger trong cơng nghiệp thực phẩm [40].
Ở Nhật, hãng Amano hàng năm đã sản xuất trên 8000 tấn chế phẩm
enzym các loại để dùng trong nơng nghiệp. Enzym “Panxenlase” chứa
cellulase, hemicellulase, protease và amylase, hoạt tính dùng trong chăn nuơi. Chế phẩm “Cellubrix”, “Cellusoft”, “Onozuka” dùng trong cơng nghiệp làm mềm vải, trong thức ăn gia súc [40].
Ở Canada, hãng Logen sử dụng “Cellulase” trong thức ăn gia súc, cơng nghiệp giấy, chế biến hạt, sản xuất ethanol [77].
Ở Liên Xơ, chế phẩm “Cellolignorin” được sử dụng trong chăn nuơi, hoạt tính 1-50 đơn vị/g, chứa cellulase, hemicellulase, pectinase [77].
sản xuất: Cellulaset và Novozyme 234 [NO], Econase C15 [AO], Rohament CT [RM], Avizyme [FR], Sumizyme c [SN], Meicelase MC [MJ], Cellulase TAP [AM], Cytolase [GR] [74].
Ở Việt Nam, Viện Sinh học nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm BioI, BioII, BioIII … cĩ dạng bột, chứa các enzym amylase, protease, cellulase và các VSV dùng bổ sung vào thức ăn cho bị, heo, cá. Chế phẩm cĩ tác dụng phịng chống các chứng rối loạn tiêu hĩa, kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy những thức ăn thừa và khí thải ởđáy ao…[78]
Trung tâm Cơng nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh sản xuất chế phẩm
Trichotech chứa vi nấm Trichoderma, chế phẩm này cĩ dạng rắn, tơi xốp, nhẹ, màu xám nâu đậm, giúp cây trồng chống được các loại nấm bệnh….[82].
Cơng ty TNHH TM và sản xuất Mai Xuân (TP. Hồ Chí Minh) sản xuất chế phẩm TRICHO-MX chứa vi nấm Trichoderma, cĩ dạng bột. Cĩ tác dụng hạn chế nấm hại, cải tạo đất, ủ phân bĩn cho cây trồng.
Cơng ty TNHH TM và sản xuất thuốc thú y- thuốc thủy sản Minh Dũng (Bình Dương) đã sản xuất nhiều chế phẩm chứa vi nấm Aspergillus sinh enzym cellulase, dùng xử lý nước ao nuơi tơm cá, kích thích tiêu hĩa, ở gia súc…như: MD-Bio-Zemix, Biofat, Bio vitamin, Biolaczym…..
Ứng dụng của enzym cellulase
Enzym cellulase thu hút được sự chú ý của các nhà cơng nghệ vì chúng cĩ thể được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực sau:
Ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose
Các chất thải hữu cơ chứa cellulose thường là những chất rất khĩ phân hủy. Trong điều kiện tự nhiên thời gian phân hủy rất lâu (trên 8 tháng), ở điều kiện khí hậu nhiệt đới. Thời gian phân hủy các chất thải này càng lâu càng gây ơ nhiễm đất, nước, khơng khí. Các chất thải này cũng khĩ tham gia vào dây chuyền chuyển hố vật chất của thiên nhiên, gây mất cân bằng sinh thái. Để
khắc phục tình trạng này, các nhà khoa học đã đưa vào khối ủ chế phẩm VSV giàu cellulase, kết quả là các chất thải bị phân hủy trong thời gian dưới 1 tháng, gĩp phần hạn chế MT [38].
Ứng dụng trong sản xuất sản phẩm thực phẩm, thực phẩm gia súc
Các sản phẩm thực phẩm được sản xuất từ các nguyên liệu thực vật chứa nhiều cellulose gây ra hiện tượng khĩ tiêu hĩa ở người. Người và những
động vật khơng nhai lại thường thiếu VSV phân giải cellulose trong đường tiêu hĩa. Do đĩ, việc chế biến thực phẩm nhất là một số sản phẩm đồ hộp bằng chế phẩm cellulase cĩ ý nghĩa làm tăng hiệu suất sử dụng thức ăn. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc thêm chế phẩm cellulase vào thực phẩm gia súc làm tăng trọng đàn lợn và tăng chất lượng thịt [38].
Ứng dụng làm phân bĩn VSV
Các chế phẩm VSV cĩ khả năng tổng hợp cellulase mạnh, khi được bĩn vào đất trồng cĩ nhiều chất hữu cơ chứa cellulose sẽ phân hủy nhanh các chất hữu cơ tạo thành mùn, giúp cây trồng phát triển nhanh [29], [38].
Ứng dụng trong kỹ thuật di truyền
Enzym cellulase sẽ phá vỡ thành tế bào thực vật để tạo tế bào trần, rất cần thiết trong quá trình chuyển gen của tế bào thực vật [38].
Ứng dụng trong cơng nghệ bột cellulose và giấy, cơng nghệ sợi dệt, cơng nghiệp chất tẩy rửa
Đây là hướng được các nhà sản xuất quan tâm nhiều trong những năm gần đây. Sử dụng enzym cellulase để tách mực khỏi giấy báo và tạp chí cũ, cải thiện tính chất quang học cũng như độ bền cơ lý của giấy sản xuất từ bột khử mực. Ở Mỹ, hơn 40%, ở Nhật Bản khoảng 55% tổng lượng giấy sử dụng là bắt nguồn từ giấy loại.
Trong cơng nghệ sợi dệt, enzym này được sử dụng để xử lý quần áo bị, làm bĩng vải bơng, vải sợi nhân tạo giúp vải mềm mại hơn, độ hút ẩm tăng
lên, bề mặt vải đẹp hơn.
Trong cơng nghiệp chất tẩy rửa, các chất tẩy rửa chứa enzym cellulase làm sạch các chất bẩn trong lịng xơ bơng tốt hơn sử dụng phương pháp tẩy rửa thơng thường [54].
Chương 2:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Đối tượng nghiên cứu
- Nấm sợi sinh enzym cellulase phân lập từ RNM Cần Giờ.
- Các VSV kiểm định: E. coli, Bacilllus subtilis được cung cấp từ
Viện Pasteur.
Hĩa chất
- Các hĩa chất cĩ nguồn gốc từ Việt Nam: Glucose, dầu DO, pepton, cazêin, kitin, tinh bột tan, agar, cồn đốt, nước cất, nước biển.
- Các hĩa chất cĩ nguồn gốc từ Trung Quốc: K2HPO4 , KH2PO4., KCl, NaCl,NaOH, NaNO3, MgSO4. 7H2O, FeSO4.7H2O, HgCl2, Na-acetate, lugol, lactophenol, xanh metylen Loeffler….
- Hĩa chất cĩ nguồn gốc từ Đức: thuốc thử DNS, Yeast extract, …. - Hĩa chất cĩ nguồn gốc từ Nhật Bản: CMC, muối Tartrat K Natri…
Cách pha chế thuốc thử DNS (2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid) [32]. - Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic: Cân 10g DNS cho vào becher (cốc thủy tinh) 1000ml, thêm 400ml nước cất, đặt becher vào nước 800C, khuấy đều. Thêm dung dịch NaOH (16g NaOH trong 150 ml nước cất) từ từ vào dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800C.
Thêm 300g muối Tartrat K Natri vào dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ
800C, làm lạnh đến nhiệt độ phịng vào bình định mức 1000ml, thêm nước cất
đến vạch và lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai màu nâu cĩ nắp. - Dung dịch lactose: Hịa tan 0,12g lactose với 80ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều.
Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị
Nồi hấp vơ trùng Autoclave (Đài Loan) Tủ cấy vơ trùng (Việt Nam)
Tủ sấy Memmert (Đức) Tủ ấm Sanyo (Nhật) Tủ giữ mẫu Sanyo (Nhật) Kính hiển vi Olympus (Nhật Bản) Tủ lạnh National (Tokyo, Nhật Bản) Máy đo pH Hana (Nhật)
Máy li tâm Heraeus (Đức) Cân điện Sartorius (Đức)
Cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ) Máy chụp ảnh kỹ thuật số Olympus (Nhật) Máy nghiền mẫu (Đức)
Máy đo độẩm Sartorius (Đức) Máy lắc Gerhardt (Đức)
Máy li tâm Hettich (Đức)
Máy đo quang phổ UV/ Visible Spectrophometer (Nhật)
Các dụng cụ thí nghiệm
Thước đo KL, lị điện, cốc thủy tinh, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, diêm quẹt, que trang, que cấy, giấy quỳ, giấy lọc, giấy báo cũ, lame, lammel, bơng mỡ, bơng thấm nước….
Mơi trường
MT phân lập, nuơi cấy và giữ giống, định danh nấm sợi
MT1: MT Czapek- Dox cải tiến [29], [58]
- K2HPO4 : 1,5 g - MgSO4.7H2O : 0,5 g - KCl : 0,5 g - FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết) - Glucoza : 20 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000ml - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút MT 2: MT D [20], [58] - Glucoza : 0,05 g - Peptone : 0,05 g - Yeast extract : 0,05 g - Agar : 30 g - Nước biển : 1000 ml - pH = 6,5. Khử trùng 1atm trong 30 phút
MT 3: MT cao men agar-Yeast extract agar (YEA) [20], [58]
- Cao nấm men : 4 g
- Glucoza : 20 g
- Agar : 20 g
- Nước biển : 1000 ml
- pH = 5,5 – 6,0. Khử trùng 1atm trong 30 phút
MT 4: MT Potato glucose agar (PGA) [7] - Nước chiết khoai tây : 200 ml
- Glucoza : 20g
- Agar : 20 g
- Nước biển : 1000 ml
* Cách chế nước chiết khoai tây
Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch. Cân 200g, xắt lát, thêm 1 lít nước cất, đun sơi trong 30 phút. Lọc lấy dịch trong.
MT thử hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
MT 5: MT thử hoạt tính cellulase [47] - NaNO3 : 3,5 g - K2HPO4 : 1,5 g - MgSO4.7H2O : 0,5 g - KCl : 0,5 g - FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết) - CMC : 10 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000ml - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút MT 6: MT thử hoạt tính protease [10] - NaNO3 : 3,5 g - K2HPO4 : 1,5 g - MgSO4.7H2O : 0,5 g - KCl : 0,5 g - FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết) - Cazêin : 15 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000ml - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút MT 7: MT thử hoạt tính amylase [47] - NaNO3 : 3,5 g - K2HPO4 : 1,5 g
- MgSO4.7H2O : 0,5 g - KCl : 0,5 g - FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết) - Tinh bột tan : 15 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000ml - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút MT 8: MT thử hoạt tính kitinase [22] - NaNO3 : 3,5 g - K2HPO4 : 1,5 g - MgSO4.7H2O : 0,5 g - KCl : 0,5 g - FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết) - Bột kitin : 10 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000ml - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút * Cách chiết kitin từ vỏ, đầu tơm
- Vỏ, đầu tơm rửa sạch, sấy khơ.
- Xử lý tách protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 70-750C/ 4 giờ, sau đĩ rửa sạch bằng nước cất.
- Tách khống bằng dung dịch HCl 8% ở 26- 300C/ 16 giờ, rửa sạch. - Sấy khơ, xay nhuyễn thành dạng bột, bảo quản trong lọ thủy tinh.
MT 9: MT phát hiện khả năng phân giải dầu [29]
- KH2PO4 : 0,3 g
- MgSO4 : 0,4g
- Na2HPO4 : 0,7 g - Nước biển : 1000ml - Dầu DO : 5ml - pH = 5,5- 6,0. Khử trùng ở 1atm/ 30 phút MT nuơi cấy nấm sợi tạo enzym MT 10: MT xốp cơ sở [18], [30] - Cám : 60% - Bột đậu nành : 30% - Bột ngơ : 10% - Trấu : bổ sung thêm 25% - Độẩm : 60% - pH = 5,0 – 5,5. Khử trùng 1atm/ 60 phút MT nuơi cấy giữ giống vi khuẩn kiểm định
MT 11 : MT Meat pepton agar (MPA) [27]
- Pepton : 5g - NaCl : 5g - Cao thịt : 5g - Agar : 20g - Nước cất : 1000 ml - pH= 7,5. Khử trùng 1atm/ 30 phút 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ[58] Tiến hành lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Cần Giờ: xã Bình Khánh, xã
Tam Thơn Hiệp, xã An Thới Đơng, xã Long Hịa, xã Bình Khánh, Lâm
Viên….Đi sâu vào các rừng già, cách biển khoảng 2 km, các điểm lấy mẫu cách nhau khoảng 200m. Vị trí lấy mẫu theo những vị trí chấm đỏ trên bản đồ
một lần. Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ cĩ độ mặn 30‰, nhiệt độ khoảng 290C, pH 7,6.
Hình 2.1. Vị trí lấy mẫu ở RNM Cần Giờ
Lấy các mẫu đất mặt, đất cách bề mặt 5- 10 cm, lá vàng sắp rụng, lá rụng bị mục, thân cành chết khơ cịn trên cây, thân cành chết đang bị phân hủy trên mặt đất.
Cách lấy: Dùng dao, kéo vơ trùng cắt khoảng 20g mẫu cho vào túi nilon vơ trùng buộc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng nước đá vận chuyển về PTN và giữ ở tủ giống 40C. Các mẫu
được phân lập ngay khơng giữ quá 24 giờ.