Nấm sợi sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo khuẩn lạc (KL) khổng lồ theo các bước sau:
- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vơ trùng.
- Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào
ống nghiệm. Lắc đều tạo dung dịch huyền phù.
- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chĩng chấm
điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2,3 hộp.
- Ủ ấm trong một tuần để tạo KL.Hàng ngày lấy ra quan sát. Dùng kính lúp ba chiều soi mơ tả các đặc điểm:
+ Kích thước KL để biết tốc độ phát triển của nĩ.
+ Hình dạng KL.
+ Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc. + Màu sắc của MT do sắc tố nấm sợi tạo ra.
+ Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT. + Đặc điểm của mép KL.
+ Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL…….
2.2.2.4. Phương pháp quan sát vi thể nấm sợi[6]
Phương pháp cấy khối thạch của J.T.Dunean
- Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri.
- Dùng khoan nút chai vơ trùng cĩ d = 8 mm, khoan các khối thạch. - Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bơng thấm nước, nước cất vơ trùng.
- Đặt 1 hoặc 2 khối thạch trên mỗi phiến kính. Cấy một ít bào tử lên bề
xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vơ trùng lên trên bề mặt các khối thạch. - Các phiến kính cĩ khối thạch cấy nấm sợi nghiên cứu được đặt trong
các hộp petri cĩ sẳn một ít bơng thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vơ
trùng. Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 3-4 ngày.
- Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch cĩ một giọt thuốc nhuộm lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất.
- Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên là ta được tiêu bản thứ hai.
- Dùng kính hiển vi (KHV) quan sát, vẽ và mơ tả các đặc điểm: + Hình dạng cuống sinh bào tử.
+ Hình dạng thể bình. + Hình dạng các thể bọng.
+ Sợi nấm cĩ hay khơng cĩ sự phân nhánh và vách ngăn. + Đặc điểm bào tửđính.
+ Màu sắc, kích thước bào tử…
- Chụp hình trên KHV quang học ởđộ phĩng đại 400-1000 lần.
2.2.2.5. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzym cellulase
[3], [22], [29], [34],[36], [40], [42]
a. Nguyên tắc
Nấm sợi sử dụng chất dinh dưỡng cĩ sẳn trong MT để sinh trưởng tạo thành một lượng lớn enzym ngoại bào lẫn trong MT, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn enzym thơ.
b. Cách tiến hành
Nấm sợi được nuơi cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng chứa MT PGA
ủ trong tủ ấm trong thời gian 4-5 ngày. Rửa bào tử từ bề mặt thạch nghiêng với dung dịch chứa Tween 80 0,1%, thu được huyền phù bào tử của từng chủng.
Cho vào bình tam giác chứa 30g MT 11 đã làm ẩm và hấp khử trùng ở
Sau khi nuơi đủ thời gian, thu lấy MT đem sấy nhẹ, cĩ quạt giĩ ở nhiệt
độ 400C để đạt độ ẩm 8- 12%, nghiền nhỏ, bảo quản trong chai, lọ sứ thuỷ
tinh. Chế phẩm này gọi là chế phẩm enzym thơ [40], [29], [14].
2.2.2.6. Phương pháp ly trích enzym cellulase [29]
a. Nguyên tắc
Dựa trên khả năng hịa tan trong nước của các enzym trong nước cất tạo thành dịch enzym.
b. Cách tiến hành
Chế phẩm enzym thơ thu được đem sấy khơ ở 400C, nghiền mịn, cho nước cất vào với tỉ lệ 1: 3, lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vịng /phút/ 1 giờ. Sau đĩ ly tâm với tốc độ 3000 vịng/ phút/ 15 phút, thu dịch trong, làm lạnh.
Để giảm ảnh hưởng của đường tự do cĩ trong mơi trường lên men, đem tủa dịch lọc bằng cồn 960đã làm lạnh theo tỉ lệ (1:3). Thu tủa và hịa lại bằng dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH5, ta được dịch enzym sử dụng dần.