SỰ HÌNH THÀNH VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA RỄ BẤT ĐỊNH TỪ NUÔI CẤY IN VITRO CỦA CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN

Phương phápSự phát sinh rễ ở các vị trí phiến lá khác nhau của cây ĐQNB in vitro dưới ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin khác nhau trong môi trường nuôi cấyMẫu cấy là phiến lá của chồi in vitro được nuôi cấy trước đó trên môi trường MS. Mỗi phiến lá được cắt thành 3 phần, mỗi phần được rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương. Môi trường nuôi cấy được bổ sung 30 gl đường sucrose, 8 gl agar, 6 mgl NAA và 1 mgl kinetin (Kin) với pH được điều chỉnh đến 5,8 và hấp vô trùng ở 121oC, 1 atm trong thời gian 20 phút. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu 2 yếu tố: (A) thành phần môi trường, có 2 mức độ: khoáng MS và vitamin Morel hoặc khoáng và vitamin Gamborg’s B5 4; và (B) là vị trí phiến lá mọc ở chồi in vitro, có 3 mức độ: lá mở 2, 3 hoặc 4 tính từ chồi ngọn xuống. Thí nghiệm có 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 5 bình (V = 130 ml), mỗi bình chứa 18 ml môi trường với 1 mẫu phiến lá được đặt hoàn toàn trong tối. Phòng nuôi cây có nhiệt độ 24 ± 2oC, độ ẩm tương đối 65 ± 5%. Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, thời gian thí nghiệm 42 ngày. Tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ, số rễmẫu, khối lượng tươi (KLT) và khô (KLK) của rễ, được xác định ở ngày thứ 42. Vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định trên mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB in vitroMẫu cấy là phiến lá thứ 2 của chồi in vitro được nuôi cấy trước đó trên môi trường MS. Mỗi phiến lá được cắt thành 3 phần, mỗi phần rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương. Thí nghiệm kế thừa kết quả của thí nghiệm trước, môi trường nuôi cấy với thành phần khoáng và vitamin Gamborg’s B5 có bổ sung 30 gl đường sucrose, 8 gl agar và 6 mgl NAA. Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức với 3 loại cytokinin, bao gồm N6benzyladenine (BA), Kin hoặc TDZ, được bổ sung vào môi trường trước khi khử trùng ở 3 mức nồng độ 0,1; 0,5 hay 1 mgl. Mỗi nghiệm thức có 3 bình (V = 130 ml), mỗi bình chứa 18 ml môi trường với 1 mẫu phiến lá. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Điều kiện nuôi cấy giống như thí nghiệm trên. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ, số rễmẫu, KLT rễ, tỷ lệ (%) KLT rễKLT mẫu, được xác định ở ngày thứ 42.Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định cây ĐQNB khi nuôi cấy trong môi trường lỏng có lắcCùng lúc với nghiên cứu tạo rễ bất định từ phiến lá, thí nghiệm khảo sát sự tăng trưởng của rễ bất định tách rời từ chồi cây ĐQNB khi nuôi cấy trên môi trường lỏng cũng được tiến hành nhằm hướng đến việc sản xuất sinh khối rễ trong hệ thống bioreactor sau này. Mẫu cấy là rễ bất định tách ra từ cây ĐQNB in vitro hình thành trong quá trình phát triển chồi thành cây hoàn chỉnh. Mỗi mẫu có trọng lượng tươi ban đầu là 500 mg được đặt vào trong bình tam giác (V = 370 ml) chứa 50 ml môi trường lỏng gồm khoáng MS, vitamin Morel, 30 gl đường sucrose và được bổ sung indole3butyric acid (IBA) với các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mgl. pH của môi trường được điều chỉnh là 5,8 trước khi hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút. Các bình môi trường lỏng chứa mẫu cấy được đặt trên máy lắc INNOVA (công ty New Brunswick Scientific, Hoa Kỳ), model 2100, với vận tốc 100 vòngphút trong điều kiện hoàn toàn tối. Phòng nuôi cấy có nhiệt độ 24±2oC, độ

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165-173 SỰ HÌNH THÀNH VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA RỄ BẤT ĐỊNH TỪ NUÔI CẤY IN VITRO CỦA CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN (ANGELICA ACUTILOBA KITAGAWA) Nguyễn Thị Quỳnh*, Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Lê Anh Thư Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *qtnguyen_vn@yahoo.com TÓM TẮT: Cây Đương quy nhật bản (ĐQNB) là cây thuốc quí, đầu vị trong nhiều bài thuốc cổ truyền, với dược tính chủ yếu đến từ bộ rễ. Trong nghiên cứu này, sự hình thành và tăng trưởng rễ của cây ĐQNB in vitro đã được thực hiện trong điều kiện tối với nhiệt độ phòng nuôi 24 ± 2 o C, độ ẩm tương đối 65 ± 5%. Phiến lá ở ba vị trí khác nhau của chồi in vitro được nuôi cấy trên môi trường khoáng MS kết hợp với vitamin Morel hay khoáng và vitamin Gamborg’s B5. Tỷ lệ mẫu tạo rễ đạt 100% cũng như khối lượng tươi của rễ (132,7 mg/mẫu) lớn nhất khi phiến lá ở vị trí thứ hai tính từ chồi ngọn được nuôi cấy trên môi trường Gamborg’s B5. Khi phiến lá được nuôi cấy trên môi trường Gamborg’s B5 có bổ sung các cytokinin bao gồm BA, Kin hoặc TDZ ở các nồng độ 0,1; 0,5 hay 1 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi của rễ cũng như tỷ lệ khối lượng tươi rễ/khối lượng tươi mẫu lớn nhất ở nồng độ 0,1 mg/l BA. Trong môi trường lỏng gồm khoáng MS, vitamin Morel, và bổ sung IBA ở các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mg/l, rễ bất định của cây ĐQNB in vitro khi được nuôi trên máy lắc ở tốc độ 100 vòng/phút đã gia tăng sinh khối theo sự gia tăng nồng độ IBA và theo thời gian nuôi cấy. Ở ngày thứ 28, rễ bất định của cây ĐQNB trong môi trường bổ sung 1 mg/l IBA có khối lượng tươi (2423,7 mg/bình) lớn nhất và tăng gần 5 lần so với khối lượng rễ ở ngày nuôi cấy ban đầu (500 mg/bình). Từ khóa: Angelica acutiloba, auxin, cytokinin, rễ bất định. MỞ ĐẦU Cây Đương quy nhật bản (Angelica acutiloba (Sieb. & Zucc.) Kitagawa) là cây thuốc quí, đầu vị và không thể thiếu trong y học cổ truyền đối với việc điều trị bệnh phụ nữ và bồi bổ khí huyết, đồng thời còn là thuốc trị bệnh như thuốc chữa thiếu máu, đau đầu, kháng viêm, tăng cường miễn dịch. Dược tính của cây Đương quy đến từ bộ phận rễ nơi có chứa rất nhiều hợp chất thứ cấp, bao gồm 47 hợp chất khác nhau, trong đó ligustilide (22,8%) và butylidenephthalide (19,5%) là hai hợp chất chính. Cây Đương quy nhật bản từ lúc trồng đến lúc thu hoạch rễ phải mất từ 2-3 năm, dẫn đến chi phí công lao động và chăm sóc trên đồng ruộng gia tăng khiến giá thành sản phẩm tăng theo rất cao [3]. Cây Đương quy nhật bản (ĐQNB) đã được du nhập vào trồng ở Việt Nam với diện tích mở rộng từ Tây Bắc đến khu vực sông Hồng gần Hà Nội [14]. Cây ĐQNB ưa khí hậu ẩm mát, vì vậy việc gieo hạt và sinh trưởng của cây cần trùng với thời gian có nhiệt độ thấp trong năm. Thời gian gieo hạt ở Việt Nam tốt nhất là đầu tháng 10. Việc gieo hạt vào thời điểm muộn hơn (tháng 11 đến tháng 2) sẽ dẫn đến tỷ lệ nẩy mầm giảm đáng kể do nhiệt độ giảm mạnh ở thời điểm này. Ngoài ra, hạt Đương quy dễ mất khả năng nảy mầm khiến việc sử dụng hạt để nhân giống gặp nhiều khó khăn. Nhu cầu rễ cây ĐQNB rất lớn trên thế giới, khoảng 450 tấn năm 2005 trong khi cung chỉ đạt được xấp xỉ 197 tấn, vì vậy cần tìm phương pháp nhân nhanh hữu hiệu cây Đương quy mà vẫn đảm bảo sự đồng nhất về mặt di truyền. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật từ khi ra đời đã đem đến khả năng làm tăng hệ số nhân giống của thực vật chỉ trong một thời gian ngắn, đồng thời việc nuôi cấy các cơ quan hay mô, tế bào thực vật đã giúp các nhà nghiên cứu thu nhận được các hợp chất thứ cấp có giá trị trong y dược với hiệu suất cao khi không thể sản xuất từ tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hoá học. Công trình nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào cây ĐQNB tại Việt Nam chưa nhiều. Hoàng Ngọc Nhung và nnk. (2012) [13] đã chứng minh sự tạo chồi trực tiếp của cây ĐQNB bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng cắt ngang của chồi đỉnh cây in vitro trên môi trường khoáng MS, vitamin Gamborg’s B5, bổ 165 Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu sung 0,1 mg/l α-naphthaleneacetic acid (NAA), 1 mg/1 thidiazuron (TDZ), 30 g/l đường sucrose, 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l adenine. Trong bài này, ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin khác nhau trong môi trường nuôi cấy, cũng như vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định từ mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB in vitro đã được khảo sát, đồng thời nghiên cứu bước đầu về sự tăng trưởng của rễ bất định khi được tách rời khỏi mẫu và nuôi cấy trong môi trường lỏng được trình bày. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Chồi in vitro cây ĐQNB có nguồn gốc từ cây nảy mầm từ hạt (do Đại học Chiba, Nhật Bản cung cấp) khi được nuôi cấy trên môi trường khoáng MS [12] kết hợp với vitamin Morel [11] có bổ sung 30 g/l đường sucrose (công ty Đường Biên Hòa), 8 g/l agar (công ty Cổ phần Đồ hộp Hạ Long). pH của môi trường trước khi khử trùng là 5,8. Môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 121 o C, 1 atm trong 20 phút. Phương pháp Sự phát sinh rễ ở các vị trí phiến lá khác nhau của cây ĐQNB in vitro dưới ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin khác nhau trong môi trường nuôi cấy Mẫu cấy là phiến lá của chồi in vitro được nuôi cấy trước đó trên môi trường MS. Mỗi phiến lá được cắt thành 3 phần, mỗi phần được rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương. Môi trường nuôi cấy được bổ sung 30 g/l đường sucrose, 8 g/l agar, 6 mg/l NAA và 1 mg/l kinetin (Kin) với pH được điều chỉnh đến 5,8 và hấp vô trùng ở 121 o C, 1 atm trong thời gian 20 phút. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu 2 yếu tố: (A) thành phần môi trường, có 2 mức độ: khoáng MS và vitamin Morel hoặc khoáng và vitamin Gamborg’s B5 [4]; và (B) là vị trí phiến lá mọc ở chồi in vitro, có 3 mức độ: lá mở 2, 3 hoặc 4 tính từ chồi ngọn xuống. Thí nghiệm có 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 5 bình (V = 130 ml), mỗi bình chứa 18 ml môi trường với 1 mẫu phiến lá được đặt hoàn toàn trong tối. Phòng nuôi cây có nhiệt độ 24 ± 2 o C, độ ẩm tương đối 65 ± 5%. Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, thời gian thí nghiệm 42 ngày. Tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi (KLT) và khô (KLK) của rễ, được xác định ở ngày thứ 42. Vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định trên mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB in vitro Mẫu cấy là phiến lá thứ 2 của chồi in vitro được nuôi cấy trước đó trên môi trường MS. Mỗi phiến lá được cắt thành 3 phần, mỗi phần rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương. Thí nghiệm kế thừa kết quả của thí nghiệm trước, môi trường nuôi cấy với thành phần khoáng và vitamin Gamborg’s B5 có bổ sung 30 g/l đường sucrose, 8 g/l agar và 6 mg/l NAA. Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức với 3 loại cytokinin, bao gồm N6-benzyladenine (BA), Kin hoặc TDZ, được bổ sung vào môi trường trước khi khử trùng ở 3 mức nồng độ 0,1; 0,5 hay 1 mg/l. Mỗi nghiệm thức có 3 bình (V = 130 ml), mỗi bình chứa 18 ml môi trường với 1 mẫu phiến lá. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Điều kiện nuôi cấy giống như thí nghiệm trên. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, KLT rễ, tỷ lệ (%) KLT rễ/KLT mẫu, được xác định ở ngày thứ 42. Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định cây ĐQNB khi nuôi cấy trong môi trường lỏng có lắc Cùng lúc với nghiên cứu tạo rễ bất định từ phiến lá, thí nghiệm khảo sát sự tăng trưởng của rễ bất định tách rời từ chồi cây ĐQNB khi nuôi cấy trên môi trường lỏng cũng được tiến hành nhằm hướng đến việc sản xuất sinh khối rễ trong hệ thống bioreactor sau này. Mẫu cấy là rễ bất định tách ra từ cây ĐQNB in vitro hình thành trong quá trình phát triển chồi thành cây hoàn chỉnh. Mỗi mẫu có trọng lượng tươi ban đầu là 500 mg được đặt vào trong bình tam giác (V = 370 ml) chứa 50 ml môi trường lỏng gồm khoáng MS, vitamin Morel, 30 g/l đường sucrose và được bổ sung indole-3-butyric acid (IBA) với các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mg/l. pH của môi trường được điều chỉnh là 5,8 trước khi hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 20 phút. Các bình môi trường lỏng chứa mẫu cấy được 166 TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165-173 đặt trên máy lắc INNOVA (công ty New Brunswick Scientific, Hoa Kỳ), model 2100, với vận tốc 100 vòng/phút trong điều kiện hoàn toàn tối. Phòng nuôi cấy có nhiệt độ 24±2 o C, độ ẩm tương đối 65±5%. Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức tương ứng với 3 nồng độ IBA, mỗi nghiệm thức 3 bình, được lặp lại 3 lần. Thời gian thí nghiệm là 28 ngày. Khối lượng tươi của rễ được đo ở các ngày nuôi cấy thứ 7, 14, 21, 28 và 35. Số liệu các thí nghiệm được phân tích ANOVA, một hoặc hai yếu tố, bằng phần mềm thống kê MSTATC, phiên bản 2.1, của Đại học bang Michigan, Hoa Kỳ và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sự phát sinh rễ ở các vị trí phiến lá khác nhau của cây ĐQNB in vitro dưới ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin khác nhau trong môi trường nuôi cấy Sự cảm ứng tạo rễ bất định và dinh dưỡng khoáng có mối quan hệ mật thiết với nhau. Trong thí nghiệm này, thành phần khoáng và vitamin có ảnh hưởng rõ rệt lên khối lượng tươi của rễ bất định ở các vị trí mẫu khác nhau vào ngày kết thúc thí nghiệm (bảng 1, hình 1). Tất cả các mẫu phiến lá cấy trên môi trường khoáng và vitamin Gamborg’s B5 đều cho KLT cao hơn các mẫu cấy trên môi trường có thành phần khoáng MS kết hợp với vitamin Morel. Mẫu cấy ở công thức B2 cho rễ có KLT cao nhất 132,7 mg/mẫu, trong khi mẫu cấy có KLT của rễ thấp nhất là ở công thức M2 (3,0 mg/mẫu). Hai loại môi trường MS và Gamborg’s B5 đều tương đồng về chủng loại và hàm lượng các thành phần khoáng vi lượng. Vì vậy, sự phát sinh rễ bất định của cây ĐQNB trong nuôi cấy này có thể do sự khác biệt về thành phần và hàm lượng của khoáng đa lượng hay vitamin. Schwambach et al. (2005) [17] chứng minh Ca, Zn và N trong môi trường nuôi cấy đã có ảnh hưởng đáng kể đến số lượng rễ hình thành trên đối tượng Eucalyptus globulus Labill. Trong thành phần khoáng đa lượng của môi trường Gamborg’s B5, NH 4 + hiện diện chỉ bằng 8% so với môi trường MS ((NH 4 ) 2 SO 4 /NH 4 NO 3 ), nên tính đối kháng giữa sự đồng hoá đạm và hấp thu các cation đa lượng không cao, vì thế sự cảm ứng tạo rễ bất định của mẫu cấy phiến lá cây ĐQNB trên môi trường khoáng Gamborg’s B5 đạt hiệu quả lớn hơn (bảng 1). Nghiên cứu của Nguyễn Thị Liễu và nnk. (2010) [8] cũng cho thấy thành phần khoáng đa lượng và vi lượng trong môi trường Gamborg’s B5 là phù hợp cho sự tạo rễ bất định từ mô sẹo có nguồn gốc từ rễ của cây Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Gurshv.) khi môi trường có bổ sung 7 mg/l NAA. Bảng 1. Ảnh hưởng của thành phần khoáng, vitamin và vị trí phiến lá của cây ĐQNB lên tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi (KLT) và khối lượng khô (KLK) của rễ ở ngày thứ 42 Công thức z Tỷ lệ mẫu tạo rễ Số rễ/mẫu KLT rễ KLK rễ M2 73,6 4,3 3,0 e x 0,9 M3 44,4 4,5 5,4 de 0,8 M4 55,6 14,3 16,5 d 4,1 B2 100,0 39,5 132,7 a 17,6 B3 90,0 36,4 71,4 c 11,9 B4 88,9 42,5 103,4 b 14,1 ANOVA y Khoáng - Vit (A) ** ** ** ** Vị trí lá (B) * * ** NS A x B NS NS ** NS z M hoặc B bên trái đại diện cho khoáng MS kết hợp với vitamin Morel hoặc khoáng và vitamin Gamborg’s B5, các số bên phải đại diện cho vị trí lá thứ 2, 3 hoặc 4; y NS, *, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý 167 Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu nghĩa ở p ≤ 0,05 hoặc 0,01; x Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Range Test. Trong thành phần vitamin, thyamine đóng vai trò quan trọng trong sự chuyển hoá carbohydrate và trực tiếp tham gia vào quá trình sinh tổng hợp một số loại acid amin, cho nên thyamine cần được cung cấp liên tục trong quá trình nuôi cấy [15]. Thyamine hiện diện trong vitamin Gamborg’s B5 với hàm lượng cao gấp 10 lần so với trong vitamin Morel. Vì vậy, có thể thyamine cũng đã ảnh hưởng đến việc làm gia tăng số lượng rễ bất định của cây ĐQNB. Chée (1995) [1] cũng đã chứng minh thyamine cần thiết cho quá trình cảm ứng tạo rễ bất định ở loài Taxus sp Hình 1. Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin trong môi trường nuôi cấy lên sự hình thành rễ ở các vị trí khác nhau của mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB M hoặc B bên trái đại diện cho khoáng MS và vitamin Morel hoặc khoáng và vitamin Gamborg’s B5, các số bên phải đại diện cho vị trí lá thứ 2, 3 hoặc 4. Môi trường nuôi cấy là yếu tố tác động chính gây cảm ứng ở mô nuôi cấy, tuy nhiên, tuổi sinh lý của mô cấy cũng cần quan tâm do ảnh hưởng của nó liên quan đến sự phát sinh hình thái ở thực vật nuôi cấy như sự tạo mô sẹo, tạo chồi hay rễ bất định. Ở ngày thứ 42, tỷ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo ở vết thương và tạo rễ giảm dần ở các vị trí phiến lá càng xa chồi ngọn dù cấy trên loại môi trường nào, cùng với số mẫu phiến lá hóa nâu đen và chết tăng dần. Ở mẫu phiến lá thứ 4 tuy cho lượng rễ nhiều, nhưng tỷ lệ mẫu không tạo rễ cao. Mẫu nuôi cấy trên môi trường khoáng và vitamin Gamborg’s B5 có tỷ lệ tạo rễ ở phiến lá thứ 2 lên đến 100% mặc dù không khác biệt về phương diện thống kê so với các nghiệm thức còn lại (bảng 1). Mẫu cấy càng già, khả năng phản biệt hoá bị suy giảm khiến khiến khả năng tái biệt hoá thành rễ bất định theo con đường trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua mô sẹo cũng bị ảnh hưởng. Vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định trên mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB in vitro Mỗi loại mẫu cấy đều chứa một lượng auxin 168 TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165-173 và cytokinin nội sinh nhất định. Auxin sẽ cảm ứng mẫu cấy tạo mô sẹo và hình thành sơ khởi rễ khi phối hợp với cytokinin theo một tỷ lệ thích hợp. Khi môi trường nuôi cấy có bổ sung auxin và cytokinin ngoại sinh, tùy vào tỷ lệ auxin tổng: cytokinin tổng mà mẫu cấy sẽ có những đáp ứng khác nhau, nếu tỷ lệ auxin: cytokinin lớn thì kích thích sự ra rễ. Trong thí nghiệm này, phiến lá cây ĐQNB được nuôi cấy trong môi trường có 6 mg l -1 NAA và khi bổ sung thêm Kin hoặc BA đều có sự hình thành rễ bất định (bảng 2). Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu tạo rễ ở các công thức có sự hiện diện của BA cao hơn so với các nghiệm thức có Kin, đồng thời tỷ lệ mẫu tạo rễ và số rễ/mẫu giảm dần khi nồng độ BA tăng từ 0,1 lên 1 mg/l. Gaspar et al. (1996) [5] cho rằng việc bổ sung cytokinin có thể gây ức chế một số hoạt tính của auxin. Vì vậy, KLT của rễ cùng với tỷ lệ KLT rễ/KLT mẫu giảm dần khi nồng độ BA bổ sung vào môi trường tăng dần. Tuy nhiên, tùy theo loại cytokinin mà sự phối hợp với auxin trong môi trường đem đến sự khác biệt về tỷ lệ mẫu tạo rễ, số lượng rễ hay khối lượng rễ, tương tự như thí nghiệm ở cây đậu (Phaseolus vulgaris), kinetin ức chế sự hình thành rễ trên trụ hạ diệp [6], trong khi lại kích thích hình thành rễ bất định ở trụ hạ diệp và cuống lá của Pinus radiata [18], hay của cây hoa hồng [21]. Tương tự trong thí nghiệm này, tỷ lệ mẫu tạo rễ và số rễ, đồng thời KLT rễ cùng với tỷ lệ KLT rễ/KLT mẫu tăng cùng với sự tăng nồng độ Kin trong môi trường nuôi cấy (bảng 2, hình 2). Bảng 2. Ảnh hưởng của cytokinin lên tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ, khối lượng tưới (KLT) và tỷ lệ khối lượng tươi rễ/khối lượng tươi mẫu (KLT rễ/KLT mẫu) của rễ bất định trên mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB ở ngày thứ 42 Nghiệm thức z Tỷ lệ mẫu Số rễ/mẫu KLT rễ KLT rễ/KLT B0,1 74,1 a x 26,4 a 137,30 a x 34,63 a B0,5 74,1 a 22,3 a 91,59 a 15,60 b B1 29,6 bc 1,7 b 3,62 b 1,92 c K0,1 7,4 c 0,7 b 0,76 b 0,25 c K0,5 25,9 bc 5,1 b 14,29 b 5,43 bc K1 44,4 ab 20,8 a 92,71 a 28,32 a T0,1 0,0 c 0,0 b 0,00 b 0,00 c T0,5 0,0 c 0,0 b 0,00 b 0,00 c T1 0,0 c 0,0 b 0,00 b 0,00 c ANOVA y Loại cyt. (A) ** ** * ** Nồng độ cyt. (B) NS NS NS NS A x B ** ** ** ** z B, K, hoặc T bên trái đại diện cho BA, Kin hoặc TDZ; các số bên phải đại diện cho nồng độ (0,1; 0,5 hoặc 1 mg l -1 ); y NS, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở p ≤ 0,01; x Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Range Test. 169 Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu Hình 2. Ảnh hưởng của BA, Kin hay TDZ ở các nồng độ khác nhau lên sự hình thành rễ của mẫu cấy phiến lá cây ĐQNB Chữ B, K hoặc T bên trái đại diện BA, Kin hoặc TDZ; các số bên phải đại diện cho nồng độ (0,1; 0,5 hoặc 1 mg l -1 ). Sự hiện diện của TDZ trong môi trường nuôi cấy đã không cảm ứng mẫu cấy tạo rễ bất định như BA hay Kin mà chỉ cảm ứng tạo mô sẹo có màu vàng trắng nơi có vết thương. Điều này chứng tỏ TDZ kết hợp với auxin nội sinh trong mô cấy đã cảm ứng sự tăng sinh tế bào, nhưng hoạt tính tạo sơ khởi rễ bất định có thể đã bị TDZ ức chế nên không hình thành sơ khởi rễ bất định. Theo Mok et al. (1982) [10], cấu trúc phân tử của TDZ có 2 nhóm chức năng là nhóm phenyl và nhóm thidiazon. Do đó, tùy theo sự hoạt động của hai nhóm này mà kết quả cảm ứng của mô nuôi cấy sẽ khác nhau. Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định cây ĐQNB khi nuôi cấy trong môi trường lỏng có lắc Việc bổ sung các auxin như IBA vào môi trường nuôi cấy ở nhiều loài thực vật dẫn đến sự cảm ứng tạo rễ bất định [9]. Trong thí nghiệm này, sự gia tăng sinh khối rễ theo thời gian nuôi cấy chịu ảnh hưởng rõ rệt bởi sự hiện diện và sự gia tăng nồng độ của IBA (hình 3 và 4). Khối lượng tươi của rễ gia tăng khi nồng độ IBA trong môi trường nuôi cấy tăng. Ở các ngày nuôi cấy thứ 14, 21, 28 khối lượng tươi của rễ đều gia tăng nhanh, gấp đôi hay gấp ba khi nồng độ IBA bổ sung ở mức 0,5 hay 1 mg/l so với rễ nuôi trong môi trường có bổ sung IBA 0,2 mg/l (hình 3). Ở ngày nuôi cấy thứ 28, sự gia tăng sinh khối rễ ở nghiệm thức bổ sung IBA 1 mg/l là lớn nhất (1923,7 mg/bình) với khối lượng tươi trung bình của nghiệm thức này là 2423,7 mg/bình. Sự gia tăng khối lượng tươi rễ bất định ở bất kỳ nồng độ IBA nào của cây ĐQNB theo thời gian nuôi cấy đã thể hiện động học tăng trưởng rễ điển hình (hình 3). Từ ngày nuôi cấy đầu tiên đến ngày nuôi cấy thứ 7, khối lượng rễ gia tăng tương đối chậm (lag phase - pha tiềm tàng). Từ ngày nuôi cấy thứ 7 đến ngày nuôi cấy thứ 21, khối lượng rễ gia tăng nhanh ở tất cả các nghiệm thức (log/exponential phase - pha tăng trưởng). Sự tăng trưởng của rễ trở nên chậm, tương đối ổn định từ ngày nuôi cấy 21 đến ngày 28 (stationary phase - pha ổn định), và có khuynh hướng đi vào trạng thái suy thoái, không tăng trưởng thêm từ ngày 28 vào ngày thứ 35 (diminishing growth phase - pha suy thoái) (hình 3). Từ kết quả này, việc nuôi cấy rễ bất định cây ĐQNB trên môi trường lỏng có bổ sung IBA nên dừng ở ngày thứ 28 để thu sinh 170 TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165-173 khối, hoặc môi trường mới cần được bổ sung cho chu kỳ nuôi cấy rễ tiếp theo. Hình 3. Sự biến thiên sinh khối rễ cây ĐQNB theo thời gian nuôi cấy Chữ I đại diện cho IBA, các số bên phải của chữ I đại diện các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mg/l. Sự không tăng sinh khối tươi rễ ở tất cả các công thức khi kéo dài thời gian nuôi cấy từ ngày 28 đến ngày thứ 35 có lẽ do sự giảm pH của môi trường nuôi cấy thông qua việc hấp thu dinh dưỡng khoáng của các tế bào rễ. Sau 35 ngày nuôi cấy, pH của môi trường bổ sung IBA 0,2; 0,5 hay 1 mg/l lần lượt là 4; 3,9 hay 3,8. pH của môi trường giảm càng mạnh, chứng tỏ tế bào hấp thu lượng dinh dưỡng khoáng từ môi trường càng lớn. Rễ cây luôn có sự hấp thu tích cực và chọn lọc các chất dinh dưỡng thông qua quá trình trao đổi chất của tế bào. Để hấp thu các chất dinh dưỡng dưới dạng cation, rễ cây phải tiết ra các ion H + để trao đổi với môi trường xung quanh. Ion H + tích lũy dần trong vùng rễ, làm cho pH của môi trường giảm dần. Mặt khác sự hấp thu tích cực cũng dẫn đến tiêu hao nhiều năng lượng của tế bào, vì vậy rễ hô hấp mạnh và thải ra nhiều khí CO 2 vào môi trường hệ rễ. Lượng khí CO 2 này kết hợp với nước tạo ra một lượng acid carbonic, tích lũy ngày càng nhiều dẫn đến việc làm giảm pH của môi trường [20]. Tuy nhiên, Dilorio et al. (1992) [2] đã chứng minh sự gia tăng khí CO 2 trong bình nuôi cấy do sự hô hấp của rễ cùng với sự thiếu hụt O 2 đã kích thích rễ tơ tăng trưởng mạnh hơn. Hình 4. Rễ cây ĐQNB trên các môi trường nuôi cấy khác nhau Chữ I đại diện cho IBA, các số bên phải chữ I đại diện các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mg/l. Trong thí nghiệm này, rễ tăng trưởng còn nhờ vào nguồn carbon hữu cơ có mặt trong môi trường nuôi cấy, chủ yếu là của đường sucrose. Rễ cây ĐQNB thông qua hô hấp sẽ tiêu thụ carbon đồng hóa để có năng lượng cần thiết cho sự duy trì và gia tăng sinh khối, vì vậy tiến trình này cần thiết phải có sự hiện diện của oxy. Theo Yu et al. (2000) [22], sự thông khí của hệ thống nuôi cấy là yếu tố quan trọng trong sự hình thành rễ bất định. Soffer và Burger (1988) [19] cũng đã chứng minh rằng oxy hòa tan thiết yếu cho sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất định. Do bình nuôi cấy rễ bất định của cây ĐQNB là bình kín, không có sự trao đổi khí với 171 Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu bên ngoài, lượng oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy sẽ giảm dần trong giai đoạn tăng trưởng nhanh của rễ từ ngày 14 đến ngày 28. Vì vậy, ở ngày thứ 35, hoạt động phân chia của tế bào rễ có thể đã giảm dẫn đến sinh khối của rễ ở tất cả các công thức đều giảm. Rễ bất định ở ngày đầu tiên nuôi cấy không có sự hiện diện của các rễ thứ cấp. Sau 35 ngày nuôi cấy, các rễ thứ cấp được hình thành từ rễ sơ cấp ban đầu ở tất cả các công thức khảo sát (hình 4). Tuy nhiên, sự gia tăng nồng độ IBA trong môi trường nuôi cấy đã làm gia tăng số lượng rễ thứ cấp. Kim et al. (2003) [7] cũng chứng minh IBA có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự hình thành rễ thứ cấp sau 7 ngày nuôi cấy rễ bất định của cây sâm Panax ginseng; San José et al. (2012) [16] cũng đã chứng minh sự hiện diện của IBA 0,1 mg/l trong môi trường nuôi cấy đã làm sự hình thành rễ thứ cấp của cây Alnus glutinosa gia tăng rõ rệt so với đối chứng trên môi trường không có IBA. KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu đã cho thấy tính khả thi của việc tạo rễ bất định từ nuôi cấy phiến lá cây ĐQNB in vitro trên môi trường thạch cũng như việc nuôi cấy rễ bất định trong môi trường lỏng với sự hỗ trợ của máy lắc để làm tăng sinh khối rễ. Các nghiên cứu sâu hơn về nuôi cấy rễ cần được tiến hành để có thể hoàn thiện quy trình nuôi rễ bất định đồng thời cần triển khai các nghiên cứu về sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong rễ in vitro của cây ĐQNB. Lời cảm ơn: Nghiên cứu nhận được sự hỗ trợ về nguồn hạt giống cây ĐQNB của GS Toyoki Kozai, Đại học Chiba, Nhật Bản, kỹ thuật của Trịnh Thị Thanh Vân và Phạm Minh Duy, phòng Công nghệ Tế bào Thực vật và trang thiết bị của Phòng Thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ tế bào thực vật phía Nam, Viện Sinh học nhiệt đới. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chée P., 1995. Stimulation of adventitious rooting of Taxus species by thiamine. Plant Cell Rep., 14: 753-757. 2. Dilorio A. A., Cheetham R. D., Weathers P. 3. J., 1992. Carbon dioxide improves the growth of hairy roots cultures on solid medium and in nutrient mists. Appl. Microbiol. Biotechnol., 37: 463-467. 4. Fukuda K., Murata K., Matsuda H., Taniguchi M., Shibano M., Baba K., Shiratori M., Tani T., 2009. Quality of Angelica acutiloba roots cutivated ang processed in Sichuan provice of China, J. Trad. Med., 26: 169-178. 5. Gamborg L., Miller A., Ojima K., 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., 50: 151-158. 6. Gaspar T., Kevers C., Greppin H., Reid M., Thrope A., 1996. Plant hormones and plant growth regulators in plant tissue culture. In vitro Cell Dev. Biol. Plant, 32: 272-289. 7. Humphries E.C., 1960. Inhibition of root development on pertioles and hypocotyls of dwarf bean (Phaseolus vulgaris) by kinetin. Physiol. Plant, 13: 659-663. 8. Kim J. S., Hahn E. J., Yeung E. C., Paek K. Y., 2003. Lateral root development and saponin accumulation as affected by IBA or NAA in adventitious root cultures of Panax ginseng C. A. Meyer. In-Vitro Cel.Dev. Biol. Plant, 39(2): 245-249. 9. Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết, 2010. Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong nuôi cấy in vitro. Tạp chí khoa học Đại học quốc gia Hà Nội, Khoa học tự nhiên và Công Nghệ, 27: 30-36. 10. Ludwig-Muller J., 2000. Indole-3-butyric acid in plant growth and development. Plant Growth Reg., 32: 219-230. 11. Mok M. C., Mok D. W. S., Amstrong D. J., 1982. Cytokinin activity of N-phenyl-N’- 1,2,3-thidiazon-5-ylurea (TDZ). Phytochem., 21: 1509-1511. 12. Morel G., Wetmore R., 1951. Tissue culture of monocotyledons, American Jour. Bot., 38(2): 138-140. 13. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised 172 TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165-173 14. medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 15(3): 473-497. 15. Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Vũ Ngọc Anh, Nguyễn Lê Anh Thư, Kozai T., 2012. Nghiên cứu sự phát sinh cơ quan từ lớp mỏng tế bào cây đương quy Nhật Bản - Angelica acutiloba nuôi cấy in vitro. Tạp chí Sinh học, 34(3SE): 196- 204. 16. Ninh T. P., Nojima H., Tashiro T., 2009. Effect of pretreatment of seeds by gibberellin (GA 3 ), kinetin and temperatures on germination and seedling growth of Angelica acutiloba Kitagawa. J. Sci. Dev., 7 (Eng.Iss.2): 217-224. 17. Polikarpochkina R. T., Gamburg K. Z., Khavin E.E., 1979. Cell-suspension culture of maize (Zea mays L.). Z.P. flanzenphysiol., 95: 57-67. 18. San José M. C., Romero L., Janeiro L.V., 2012. Effect of indole-3-butyric acid on root formation in Alnus glutinosa microcuttings. Silva Fennica, 46(5): 643-654. 19. Schwambach J., Fadanelli C., Fett-Neto A.G., 2005. Mineral nutrition and adventitious rooting in microcutting of Eucalyptus globules. Tree Physiol., 25: 487- 494. 20. Smith D. R., Thorpe T. A., 1975. Root initiation in cuttings of Pinus radiata seedlings. II. Growth regulator interactions. J. Exp. Bot., 26: 193-202. 21. Soffer H., Burgur D. W., 1988. Effects of dissolved oxygen concentrations in aero hydroponics on the formation and growth of adventitious roots, J. Am. Soc. Hort. Sci., 113: 218-221. 22. Thorpe T., Stasolla C., Yeung E. C., de Klerk G. J., Roberts A., George E. F., 2008. The components of plant tissue culture media II: Organic additions, osmotic and pH effects, and support systems. In: Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition, Vol. 1: The Background, George E.F., Hall M.A., de Klerk G.J. (eds.), Springer, Dordrecht, The Netherlands, 115-174. 23. Vries D. P., Dubois L. A. M., 1988. The effect of BAP and IBA on sprouting and adventitous root formation of ‘Amanda’ rose single - node softwood cuttings, Sci. Hortic., 34: 115-121. 24. Yu T. A., Yeh S. D., Cheng Y. H., Yang J. S., 2000. Efficient rooting for establishment of papaya plantlets by micropropagation, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 61(1): 29-35. FORMATION AND GROWTH OF ADVENTITIOUS ROOTS FROM IN VITRO ANGELICA ACUTILOBA KITAGAWA TISSUE CULTURE Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu Institute of Tropical Biology, VAST SUMMARY Japanese touki is considered of high and prior value in many traditional remedies due to medicinal properties in the root system. In this study, root formation and growth of Japanese touki cultured in vitro were carried out in the dark condition of a culture room having temperature of 24 ± 2 o C and RH of 65 ± 5%. Leaf blades from three different positions of the in vitro touki shoot were cultured either on basal mineral MS medium supplemented with Morel vitamins or Gamborg’s B5 medium. Percent of root formation was 100% as well as root fresh weight (132.7 mg explant -1 ) was the greatest when the second leaf blade was cultured on the Gamborg’s B5 medium. Percent of root formation, root number, root fresh weight and root fresh 173 Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu weight/explant fresh weight were the greatest when the leaf blade was cultured on the Gamborg’s B5 medium supplemented with 0.1 mg/l BA. In the MS liquid medium including Morel vitamin, shaked at 100 ppm, and supplemented with different IBA concentrations (0.2, 0.5 or 1 mg/l), adventitious roots of in vitro touki plants grew and increased their biomass over time with the increase in IBA concentrations. On day 28, touki roots had the greatest fresh weight (2423.7 mg/vessel) in the medium supplemented with 1 mg/l IBA, almost 5 times higher than that (500 mg/vessel) at the first day of culture. Keywords: Angelica acutiloba, adventitious rout, auxin, cytokinin. Ngày nhận bài: 30-6-2013 174 . TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165-173 SỰ HÌNH THÀNH VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA RỄ BẤT ĐỊNH TỪ NUÔI CẤY IN VITRO CỦA CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN (ANGELICA ACUTILOBA KITAGAWA) Nguyễn. (KLK) của rễ, được xác định ở ngày thứ 42. Vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định trên mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB in vitro Mẫu cấy là phiến lá thứ 2 của chồi in vitro được nuôi cấy trước. Soffer và Burger (1988) [19] cũng đã chứng minh rằng oxy hòa tan thiết yếu cho sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất định. Do bình nuôi cấy rễ bất định của cây ĐQNB là bình kín, không có sự trao