Hoa cát tường có tên khoa học Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn có nguồn gốc từ miền tây nước Mỹ, có khả năng chịu lạnh tốt, với nhiều chủng loại và màu sắc đa dạng như: kem, tím, vàng, hồng, hồng phai, tím đậm, trắng viền tím…Cát tường không rực rỡ như hoa cúc và không lộng lẫy như hoa hồng nhưng lại thu hút khách bởi vẻ đẹp đơn sơ và bởi quan niệm cát tường là loài hoa mang lại nhiều may mắn.Hiện tại cát tường là giống hoa được người tiêu dùng rất ưa chuộng và đang được sản xuất làm hoa thương phẩm. Hoa cát tường được sản xuất nhiều ở Đà Lạt vì điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng nơi đây rất phù hợp với đặc điểm sinh trưởng của nó.Hoa Cát Tường là một loài hoa đẹp, có hiệu quả kinh tế cao, du nhập vào Việt Nam khoảng 10 năm trở lại, chủ yếu được trồng ở Đà Lạt. Hạt của hoa Cát Tường rất nhỏ, 1g hạt có khoảng 1.500 hạt nên khi gieo ngoài vườn ươm rất dễ thất thoát, tỷ lệ nảy mầm thấp nên việc tìm kiếm phương pháp nhân nhanh giống hoa Cát Tường có hiệu quả và chất lượng là rất cần thiết.Hiện nay phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được áp dụng trên loài hoa này với vật liệu nuôi cấy là lóng thân, đế hoa, chồi bên và đã thu được nhiều thành tựu đáng kể.Nuôi cấy lát mỏng tế bào đã được thử nhiệm trên hoa Cát Tường, với vật liệu là lát mỏng lóng thân và lát mỏng đế hoa và đã tạo được cây con hoàn chỉnh với hệ số nhân giống cao.Tuy nhiên việc khảo sát các nồng độ phytohoocmon phù h
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: Hoa cát tường có tên khoa học Eustoma grandiflorum (Raf.) Shinn có nguồn gốc từ miền tây nước Mỹ, có khả năng chịu lạnh tốt, với nhiều chủng loại và màu sắc đa dạng như: kem, tím, vàng, hồng, hồng phai, tím đậm, trắng viền tím… Cát tường không rực rỡ như hoa cúc và không lộng lẫy như hoa hồng nhưng lại thu hút khách bởi vẻ đẹp đơn sơ và bởi quan niệm cát tường là loài hoa mang lại nhiều may mắn. Hiện tại cát tường là giống hoa được người tiêu dùng rất ưa chuộng và đang được sản xuất làm hoa thương phẩm. Hoa cát tường được sản xuất nhiều ở Đà Lạt vì điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng nơi đây rất phù hợp với đặc điểm sinh trưởng của nó. Hoa Cát Tường là một loài hoa đẹp, có hiệu quả kinh tế cao, du nhập vào Việt Nam khoảng 10 năm trở lại, chủ yếu được trồng ở Đà Lạt. Hạt của hoa Cát Tường rất nhỏ, 1g hạt có khoảng 1.500 hạt nên khi gieo ngoài vườn ươm rất dễ thất thoát, tỷ lệ nảy mầm thấp nên việc tìm kiếm phương pháp nhân nhanh giống hoa Cát Tường có hiệu quả và chất lượng là rất cần thiết. Hiện nay phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được áp dụng trên loài hoa này với vật liệu nuôi cấy là lóng thân, đế hoa, chồi bên và đã thu được nhiều thành tựu đáng kể. Nuôi cấy lát mỏng tế bào đã được thử nhiệm trên hoa Cát Tường, với vật liệu là lát mỏng lóng thân và lát mỏng đế hoa và đã tạo được cây con hoàn chỉnh với hệ số nhân giống cao. Tuy nhiên việc khảo sát các nồng độ phytohoocmon phù hợp, nhằm rút ngắn thời gian và tăng hiệu suất nhân giống vẫn đang được tiếp tục. Từ thực tế trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: 1/22 Khào sát ảnh hưởng của Phytohoocmone lên sự phát sinh hình thái từ chồi bên trong nuôi cấy in vitro của cây hoa Cát (Eustoma grandiflorum). 1.2 Mục tiêu - Cố đinh được mẫu trong điều kiện invitro - Khảo sát ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự tạo thành cụm chồi từ chồi bên 1.3 Giới hạn Do thời gian thực tập chỉ trong một thời gian ngắn từ ngày 01/04 đến 15/06/2014, nên đề tài chỉ thực hiện việc nuôi cấy in vitro mẫu chồi bên cây hoa Cát Tường. Không tạo cây hoàn chỉnh và đem ra trồng sản xuất. CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 2.1. Địa điểm: phòng thí nghiệm mô và tế bào thực vật - Trường cao đẳng công nghiệp cao su 2.2. Thời gian thực tập: Từ 01/04 đến 15/06/2014 2.3. Nội dung và phương pháp 2.3.1 TN1: Khử trùng đoạn thân mang chồi bên Mẫu nuôi cấy đem khử trùng là đoạn thân mang chồi bên, được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó rửa sạch bằng nước lã, tráng qua một lần nước cất và xử lý trong nước javen (nồng 2/22 độ clor = 38g/l) với tỷ lệ khác nhau trong 20 phút. Sau đó lắc bằng cồn 9O o trong 30 giây, mẫu được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng và đưa vào nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy là môi trường Murashige-Skooge 1962 (MS) có bổ sung 30g/l đường saccaroze, agar 9g/l, pH = 5,7 được hấp vô trùng ở 121 o C trong 20 phút. Nhiệt độ trong suốt quá trình thực nghiệm là 26 o C ±2. Cường độ ánh sáng 2.000-2.200lux, thời gian chiếu sáng 16giờ/ngày. Khảo sát nồng độ javen: N/độ javen 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 NT NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 5, 10, 15 ngày sau cấy tiến hành quan trắc tỷ lệ nhiễm Tỷ lệ mẫu nhiễm = (số mẫu nhiễm \tổng số mẫu)*100 2.3.2 TN2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự phát sinh hình thái từ lát cắt mỏng và chồi bên 2.3.2.1 Vật liệu: lát cắt mỏng lá, đế hoa, lát cắt mỏng chồi bên và chồi bên. 2.3.2.2 Bố trí thí nghệm: Thí nghiệm được bố trí với 14 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức với 3 lần lặp lại, 1 lần lặp lại 3 chai, mỗi chai 3 mẫu. Các mẫu được nuôi cấy trên môi trường Murashige-Skooge 1962 (MS) có 30g/l đường saccaroze, agar 9g/l, 20% nước dừa già, pH = 5,7, bổ xung thêm BA, NAA với các nồng độ khác nhau và được hấp vô trùng ở 121 O C trong 20 phút. Nhiệt độ trong suốt quá trình thực nghiệm là 26 o C ±2. Cường độ ánh sáng 2.000 -2.200lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày. NT 1: Môi trường MS + 1,0 mg/ml NAA NT 2: Môi trường MS + 0,5 mg/ml BA + 1 mg/ml NAA NT 3: Môi trường MS + 1,0 mg/ml BA + 1 mg/ml NAA NT 4: Môi trường MS + 1,5 mg/ml BA + 1 mg/ml NAA NT 5: Môi trường MS + 2,0 mg/ml BA + 1 mg/ml NAA 3/22 NT 6: Môi trường MS + 2,5 mg/ml BA + 1 mg/ml NAA NT 7: Môi trường MS + 3,0 mg/ml BA + 1 mg/ml NAA NT 8: Môi trường MS + 1 mg/ml BA NT 9: Môi trường MS + 1,0 mg/ml BA + 0,5 mg/ml NAA NT 10: Môi trường MS + 1,0 mg/ml BA + 1,0 mg/ml NAA NT 11: Môi trường MS + 1,0 mg/ml BA + 1,5 mg/ml NAA NT 12: Môi trường MS + 1,0 mg/ml BA + 2,0 mg/ml NAA NT 13: Môi trường MS + 1,0 mg/ml BA + 2,5 mg/ml NAA NT 14: Môi trường MS + 1,0 mg/ml BA + 3,0 mg/ml NAA 2.3.2.3 Các chỉ tiêu theo dõi + Tỷ lệ số chồi/ mẫu : Số mẫu chồi = (Σmẫu phát sinh chồi/tổng số mẫu nuôi cấy)x100 + Chiều cao: Đo từ điểm phát sinh chồi trở lên. + Tỷ lệ hình thành mô sẹo: Tỷ lệ hình thành mô sẹo = (Σmẫu hình thành mô sẹo/tổng số mẫu nuôi cấy)x100 + Tỷ lệ phát sinh chồi trực tiếp: Tỷ lệ phát sinh chồi trực tiếp = (Σmẫu phát sinh chồi trực tiếp/tổng số mẫu nuôi cấy)x100 + Các hình thái khác. Sau 45 ngày nuôi cấy tiến hành quan trắc số chồi trên trên một chồi bên cấy của các nghiệm thức 4/22 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thí nghiệm 1: ảnh hưởng của nồng độ javen đến Tỷ lệ mẫu sau 15 ngày nuôi cấy N/đ javen chỉ tiêu NT1 (1:1) NT2 (1:2) NT (1:3) NT4 (1:4) NT5 (1:5) Tổng số Tỷ lệ (%) Tổng số Tỷ lệ (%) Tổng số Tỷ lệ (%) Tổng số Tỷ lệ (%) Tổng số Tỷ lệ (%) Mẫu nhiễm 2 13 2 13 5 33 3 20 13 87 Mẫu sống 0 0 2 13 10 67 12 80 2 13 5/22 Mẫu chết 13 87 11 74 0 6 0 0 0 0 Tổng 15 100 15 100 15 100 15 100 15 100 Việc khử mẫu đoạn thân mang chồi bên của cây hoa Cát tường bằng nước javen ở các nồng độ khác nhau, đã cho thấy được với nồng độ nước javen (1:4) thì cho kết quả thu được là tốt nhất. ở nồng độ này ta thu được tổng số mẫu sống không nhiễm là 80 %, mẫu nhiễm là 20 %, mẫu chết là 0 % trên tổng số mẫu là 100 %, và đạt tỷ lệ khử tốt nhất so với các nồng độ khác. Đối với các nồng độ (1:1) và (1:2) thì ta có thể thấy được tỷ lệ mẫu nhiễm là thấp nhất so với các nồng độ khác đạt 13 % trên tổng số mẫu là 100 %, nhưng trái lại ở nồng độ nay do nước javen quá đậm đặc làm cho mẫu hầu như chết hoàn toàn, tỷ lệ mẫu chết ở các nồng độ (1:1) là 87 %, (1:2) la 74 %, và tỷ tệ mẫu sống không nhiễm ở 2 nồng độ này là rất thấp, nồng độ (1:1) là 0 %, (1:2) đạt 13 % 3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên quá trình hình thành chồi từ chồi bên và hình thành mô sẹo trong nuôi cấy lát mỏng tế bào. Nhân chồi, hình thành mô sẹo là giai đoạn quan trọng quyết định đến số lượng cây của quá trình nuôi cấy mô thực vật, số lượng chồi, mô sẹo càng nhiều thì khả năng nhân giống càng lớn và ngược lại. Bên cạnh các yếu tố ảnh hưởng đến hệ số nhân giống như: yếu tố môi trường, thao tác của kỹ thuật viên, chất lượng nguồn vật liệu, điều kiện nuôi cấy…thì việc bổ sung các chất điều hòa sinh trường một cách thích hợp vào môi trường nuôi cấy được đánh giá là yếu tố quan trọng nhất. 6 Benzyl adenine (BA) có tác dụng kích thích sự hình thành chồi của mô nuôi cấy và thích hợp với nhiều loại cây. Naphthaleneacetic axit (NAA) có tác dụng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô. Việc kết hợp giữa BA và NAA trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thích hợp có thể đem lại hiệu quả cao hơn việc sử dụng riêng lẻ từng chất. 20 ngày sau khử mẫu chúng tôi tiến hành thí nghiệm với nguồn vật liệu lấy được sau quá trình khử mẫu. 6/22 3.2.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên quá trình hình thành chồi từ chồi bên. Bảng 1: Kết quả tạo cụm chồi bên sau 4 tuần nuôi cấy 7/22 Hình 1b: Vị trí cắt lát mỏng lóng thân Hình 1a: Sau 20 ngày khử mẫu BA và NAA là những hoocmone điều hòa sinh trưởng thực vất. Chúng có tác động khác nhau trên mô thực vật, BA ảnh hưởng rõ rệt trên sự phân hóa chồi trong nuôi cấy in vito còn NAA giúp mô thực vật tạo rễ. Tùy theo nồng độ và tỉ lệ các chất này mà cấy tạo chồi hay tạo rễ. Dựa vào bảng số liệu tôi nhận thấy trong môi trường NT1(1,0mg NAA) số chồi của mẫu rất ít từ 2-3 chồi / mẫu, mẫu cấy tạo rễ và NT2 (0,5mg BA : 1,0mg NAA) số chồi từ 3-4 chồi /mẫu. Ngược lại chiều cao của mẫu cấy hai NT1 và NT2 là rất cao từ 4,9 cm đến 5,8 cm. Khi tăng nồng độ BA lên và vẫn giữ nguyên nồng đô NAA tôi thấy số chồi tăng lên rất nhiều ở các NT 3, NT4, NT5, tăng lên từ 5 chồi/ mẫu – 10 chồi / mẫu và chiều cao chồi cũng giảm xuống chỉ còn khoảng từ 1,2-2,5 cm. Tỷ lệ NT BA (mg) NAA (mg) Số chồi hình thành/mẫu Chiều cao (cm) Ghi chú NT1 0,0 1,0 1,3 4,9 Có sẹo dưới, ra rễ NT2 0,5 1,0 1,7 5,8 Có sẹo dưới, tạo PLB NT3 1,0 1,0 0,9 1,2 NT4 1,5 1,0 3,8 2,5 Có sẹo dưới, tạo PLB NT5 2,0 1,0 8,7 2,0 Tạo cụm chồi NT6 2,5 1,0 19,5 1,3 Có sẹo dưới NT7 3,0 1,0 16,5 1,5 NT8 1,0 0,0 3,5 1,5 NT9 1,0 0,5 3,3 0,6 NT10 1,0 1,0 3,7 1,6 NT11 1,0 1,5 2,4 2,5 NT12 1,0 2,0 2,9 2,8 NT13 1,0 2,5 2,5 1,3 NT14 1,0 3,0 3,8 1,0 8/22 Riêng ở NT2(0,5mg BA : 1,0mg NAA) và NT4(1,5mg BA : 1,0mg NAA) có sẹo dưới của chồi và tái tạo PLB (protocorm like body). Dụa vào bảng kết quả, tôi nhận thấy trong môi trường NT6 (2,5mg BA : 1,0mg NAA) và môi trường NT7(3,0mg BA : 1,0mg NAA) số chồi / mẫu rất cao từ 23 chồi / mẫu cấy đến 41 chồi / mẫu, tuy nhiên chiều cao của chồi trong hai môi trường này giảm xuống vì BA không có tác dụng kéo dài tế bào. Dựa vào bảng kết quả, khi ta giữ nguyên nồng độ BA và tăng dần lên nồng độ NAA với các NT8, NT9, NT10, NT11, NT12, NT13, NT14 thì số 4 chồi / mẫu rất ít từ 8 chồi / mẫu. Chiều cao chồi dao dộng từ 1,0 đến 2,8 cm. 9/22 Hình 2: Cụm chồi hoa Cát tường được tạo thành từ chồi bên của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT1 (MS có 0 mg BA và 1mg NAA). Hình 3: Cụm chồi hoa Cát tường được tạo thành từ chồi bên của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT2 (MS có 0,5 mg BA và 1mg NAA). 10/22 2 [...].. .Hình 4: Cụm chồi hoa Cát tường được tạo thành từ chồi bên của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT3 (MS có 1,0 mg BA và 1,0 mg NAA) Hình 5: Cụm chồi hoa Cát tường được tạo thành từ chồi bên của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT4 (MS có 1,5 mg BA và 1,0 mg NAA) 11/22 Hình 6: Cụm chồi hoa Cát tường được tạo thành từ chồi bên của cây con trong. .. chồi hoa Cát tường được tạo thành từ chồi bên của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT13 (MS có 1,0 mg BA và 2,5 mg NAA) Hình 15: Cụm chồi hoa Cát tường được tạo thành từ chồi bên của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT14 (MS có 1,0 mg BA và 3,0 mg NAA) 3.2.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên quá trình hình thành mô sẹo trong nuôi cấy. .. 9: Cụm chồi hoa Cát tường được tạo thành từ chồi bên của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT8 (MS có 1,0 mg BA và 0 mg NAA) 13/22 Hình 10: Cụm chồi hoa Cát tường được tạo thành từ chồi bên của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT9 (MS có 1,0 mg BA và 0,5 mg NAA) Hình 11: Cụm chồi hoa Cát tường được tạo thành từ chồi bên của cây con trong ống nghiệm... ngày nuôi cấy trên môi trường NT5 (MS có 2,0 mg BA và 1,0 mg NAA) Hình 7: Cụm chồi hoa Cát tường được tạo thành từ chồi bên của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT6 (MS có 2,5 mg BA và 1,0 mg NAA) 12/22 Hình 8: Cụm chồi hoa Cát tường được tạo thành từ chồi bên của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT7 (MS có 3,0 mg BA và 1,0 mg NAA) Hình 9: Cụm chồi. .. ngày nuôi cấy trên môi trường NT10 (MS có 1,0 mg BA và 1,0 mg NAA) 14/22 Hình 12: Cụm chồi hoa Cát tường được tạo thành từ chồi bên của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT11 (MS có 1,0 mg BA và 1,5 mg NAA) Hình 13: Cụm chồi hoa Cát tường được tạo thành từ chồi bên của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT12 (MS có 1,0 mg BA và 2,0 mg NAA) 15/22 Hình. .. ươm - Tiếp tục khảo sát các dãy nồng độ chất điều hòa sinh trưởng khác trong nuôi cấy mô hoa Cát Tường - Thử nghiệm các nguồn vật liệu khác nhau như cánh hoa, đế hoa, bầu nhụy trong nuôi cấy mô hoa Cát Tường - Tiếp tục theo dõi sự hình thành chồi bên và mô sẹo từ lát mỏng tế bào của các NT 2, 5, 6, 7 21/22 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Dương Công Kiên, 2006 Nuôi cây mô tập III Đại học Khoa học Tự nhiên 2 https://www.google.com.vn... thân của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT2 (MS có 0,5 mg BA và 1,0 mg NAA) Bảng 3: Kết quả phát sinh hình thái từ lát mỏng lá sau 4 tuần nuôi cấy Tỷ lệ Tổng số mẫu Mẫu chết Mẫu phát sinh Mẫu phát Mẫu không mô sẹo sinh chồi phát sinh 18/22 NT hình thái Tổng số Tỷ lệ Tổng (%) số Tỷ lệ Tổng (%) số Mẫu tạo PLB Tổng Tỷ lệ Tổng Tỷ số (%) số lệ (%) NT 1 5 100 1 20 3 - - 0 1... nhất cho tạo sẹo từ nuôi cấy lát mỏng lóng thân là BA 0,5mg/ml; NAA 1,0mg/ml (NT2) - Nồng độ thích hợp nhất cho tạo sẹo từ nuôi cấy lát mỏng lá là BA 2,0mg/ml ; NAA 1,0mg/ml (NT6) và BA 2,5mg/ml; NAA 1,0mg/ml (NT7) - Đối với sự hình thành chồi từ mô sẹo lá và cụm chồi từ chồi ngủ thì NT 6 cho kết quả tốt nhất 2 Đề nghị - Tiếp tục quá trình nuôi cấy để đánh giá khả năng sinh trưởng của chồi, khả năng... 0,5mg/ml; NAA 1,0mg/ml) ta thấy rõ được sự hình thành mô sẹo rất tốt, mô sẹo hình thành sau 30 ngày nuôi cấy đã tạo PLB (protocorm like body) Hình 16: Mô sẹo được tạo thành từ lóng thân của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT1 (MS có 0 mg BA và 1,0 mg NAA) Hình 16: Mô sẹo được tạo thành từ lóng thân của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT2 (MS có 0,5... thích hợp nhất cho tạo sẹo từ nuôi cấy lát mỏng lóng thân ở thí nghiệm này là BA 0mg/ml; NAA 1,0mg/ml và BA 0,5mg/ml; NAA 1,0mg/ml 19/22 Hình 19: Mô sẹo được tạo thành từ lát mỏng lá của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT6(MS có 2,0 mg BA và 1,0 mg NAA) Hình 19: Mô sẹo được tạo thành từ lát mỏng lá của cây con trong ống nghiệm sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường NT6(MS có . hưởng của Phytohoocmone lên sự phát sinh hình thái từ chồi bên trong nuôi cấy in vitro của cây hoa Cát (Eustoma grandiflorum). 1.2 Mục tiêu - Cố đinh được mẫu trong điều kiện invitro - Khảo sát ảnh. số mẫu nuôi cấy) x100 + Tỷ lệ phát sinh chồi trực tiếp: Tỷ lệ phát sinh chồi trực tiếp = (Σmẫu phát sinh chồi trực tiếp/tổng số mẫu nuôi cấy) x100 + Các hình thái khác. Sau 45 ngày nuôi cấy tiến. NAA). Bảng 3: Kết quả phát sinh hình thái từ lát mỏng lá sau 4 tuần nuôi cấy Tỷ lệ Tổng số mẫu Mẫu chết Mẫu phát sinh mô sẹo Mẫu phát sinh chồi Mẫu không phát sinh 18/22 NT hình thái Tổng số Tỷ lệ (%) Tổng số Tỷ