Khóa luận: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM COLLAGEN

CHƯƠNG 1: COLLAGEN 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ COLLAGEN 1.1.1 Khái quát về Collagen 2 v Collagen là một protein có cấu trúc bậc 4 điển hình, do các đơn vị tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có nhiều mức cấu trúc. Collagen là loại protein cấu trúc chính yếu, chiếm khoảng 25% 35% tổng lượng protein trong cơ thể ở các động vật có xương sống. Collagen được phân bố trong các bộ phận như da, cơ, gân, sụn, răng, hệ thống mạch máu của động vật và có mặt trong các lớp màng liên kết bao quanh các cơ và là thành phần chính của dây chằng và gân,... Khoảng 10% protein trong cơ ở động vật có vú là collagen, các protein ngoại bào (hơn 90% trong gân, xương và khoảng 50% trong da) có chứa collagen. v Trong thành phần của da, collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da và được phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da, tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như : sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm,... Nó đóng vai trò kết nối tế bào, kích thích quá trình trao đổi chất, tạo độ đàn hồi cho da. Sự suy giảm về số lượng và chất lượng collagen sẽ dẫn đến hậu quả lão hóa của cơ thể mà sự thay đổi trên làn da, khuôn mặt là dấu hiệu dễ nhận biết nhất: làn da bị khô, nhăn nheo bắt đầu từ các đường nhăn mảnh trên khóe mắt, khóe miệng, lâu dần thành nếp nhăn sâu, các đường nét khuôn mặt bị chùng nhão và chảy xệ. Tùy theo từng độ tuổi, điều kiện sống và tác động của môi trường, da có thể bị lão hóa hoặc tổn thương , khi đó sợi collagen sẽ mất dần tính đàn hồi và săn chắc do cấu trúc collagen bị phá hủy. Chính vì vậy mà collagen đóng vai trò là một trong những chất quan trọng hàng đầu của ngành thẩm mỹ, đặc biệt là chăm sóc da, phẫu thuật thẩm mỹ, phẫu thuật bỏng... v Collagen cũng được phân bố ở giác mạc, và tồn tại dưới dạng tinh thể. Trong mô cơ, collagen chiếm khoảng từ 1% đến 2%. Trong cơ thể người, collagen chiếm từ 20 – 25% protein của cơ thể.

CHƯƠNG 1: COLLAGEN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ COLLAGEN

1.1.1 Khái quát về Collagen [2]

 Collagen là một protein có cấu trúc bậc 4 điển hình, do các đơn vị tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có nhiều mức cấu trúc.Collagen là loại protein cấu trúc chính yếu, chiếm khoảng 25% - 35% tổng lượng proteintrong cơ thể ở các động vật có xương sống Collagen được phân bố trong các bộ phận như da,

cơ, gân, sụn, răng, hệ thống mạch máu của động vật và có mặt trong các lớp màng liên kếtbao quanh các cơ và là thành phần chính của dây chằng và gân, Khoảng 10% protein trong

cơ ở động vật có vú là collagen, các protein ngoại bào (hơn 90% trong gân, xương và khoảng50% trong da) có chứa collagen

 Trong thành phần của da, collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da và được phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da, tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của danhư : sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm, Nó đóng vai trò kết nối tế bào, kích thích quátrình trao đổi chất, tạo độ đàn hồi cho da Sự suy giảm về số lượng và chất lượng collagen sẽdẫn đến hậu quả lão hóa của cơ thể mà sự thay đổi trên làn da, khuôn mặt là dấu hiệu dễnhận biết nhất: làn da bị khô, nhăn nheo bắt đầu từ các đường nhăn mảnh trên khóe mắt,khóe miệng, lâu dần thành nếp nhăn sâu, các đường nét khuôn mặt bị chùng nhão và chảyxệ Tùy theo từng độ tuổi, điều kiện sống và tác động của môi trường, da có thể bị lão hóahoặc tổn thương , khi đó sợi collagen sẽ mất dần tính đàn hồi và săn chắc do cấu trúccollagen bị phá hủy Chính vì vậy mà collagen đóng vai trò là một trong những chất quantrọng hàng đầu của ngành thẩm mỹ, đặc biệt là chăm sóc da, phẫu thuật thẩm mỹ, phẫu thuậtbỏng

 Collagen cũng được phân bố ở giác mạc, và tồn tại dưới dạng tinh thể Trongmô cơ, collagen chiếm khoảng từ 1% đến 2% Trong cơ thể người, collagen chiếm từ 20 –25% protein của cơ thể

 Collagen là thành phần chính của mô liên kết, có chức năng tạo độ vững chắc và đàn hồi Collagen có tác dụng giống như một chất keo liên kết các tế bào lại với nhau đểhình thành các mô và cơ quan nền tảng trong cơ thể Collagen cung cấp cho các mô liên kếtnhững đặc tính nổi trội nhờ vào sự hiện diện rộng khắp và sự sắp xếp mang tính cấu trúc củanó Theo quan điểm y sinh, collagen đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, hàn gắn vếtthương, là thành phần hoạt hoá các tiểu cầu trong máu và sự hình thành mạch Thêm vào đósự phát triển của một số bệnh di truyền được xác định là do sự đột biến trong cấu trúc gencủa collagen Những rối loạn trong quá trình tổng hợp hoặc phân giải collagen đều được ghilại như là nguyên nhân của nhiều căn bệnh phức tạp như chứng viêm khớp, xơ gan, bệnh đáiđường và ung thư cũng như những bệnh có liên quan đến sự lão hoá Collagen phân bố khắpnơi trong cơ thể, từ chỗ gân nối bắp chân với gót chân cho tới giác mạc Trong gân và dâychằng, collagen có tác dụng truyền lực từ cơ sang xương và tích trữ năng lượng đàn hồi Chínhnhờ tính chất này mà cơ thể có thể di chuyển, vận động một cách nhịp nhàng và uyểnchuyển Collagen còn là chất nền hữu cơ có trong xương và men răng giúp chúng chống lại sựrạn nứt Nó là thành phần chính trong da, mạch máu, các cơ Bên cạnh các chức năng cơ học,

ở giác mạc, thủy tinh thể, trật tự cấu trúc của các sợi collagen tạo nên sự trong suốt duy trì thịlực

 Collagen được xem như một vật liệu mang tính xây dựng Sự linh hoạt của nólà nhờ vào cấu trúc cấp bậc phức tạp, tạo nên sự đa dạng trong tính chất nhằm phục vụ nhữngchức năng nhất định Xét về mặt kinh tế, nguồn nguyên liệu giàu collagen dùng để sản xuất

ra gelatine- chất có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau: thực phẩm, y học và

dược phẩm, mỹ phẩm, công nghệ nhiếp ảnh,

1.1.2 Lịch sử phát triển của Collagen

Theo tiếng Hy Lạp, collagen có nghĩa là “người sản xuất keo hồ”, nói đến quátrình nấu da và gân của ngựa cùng những loài động vật khác để thu được hồ Keo dán

collagen đã được người Ai Cập sử dụng cách đây 4000 năm và người Mỹ sử dụng nó cáchđây khoảng 1500 năm.

Từ hơn 2000 năm trước, con người đã biết sử dụng mô liên kết và sản phẩm củanó trong chế biến thực phẩm để tạo ra các sản phảm dạng gel, các chất dính Người Ai Cậpcổ đại đã sản xuất ra được collagen và những nghiên cứu cho thấy trong những thế kỉ tiếptheo đã thật sự xuất hiện collagen trong các bữa tiệc, ví dụ trong món cá hồi hay bánh hoaquả,

Năm 1682, một người Pháp tên Papin đã công bố một kết quả là đã thu được mộthỗn hợp giống jelly từ xương Từ năm 1700, thuật ngữ collagen trở nên thông dụng

Năm 1754, bài báo đầu tiên trong lĩnh vực chất dính được công nhận ở Anh vềviệc sản xuất chất dán của một người thợ làm đồ gỗ Các chất hồ dán tự nhiên được sản xuấttrên thành phần cơ bản là collagen và một vài chất khác

Năm 1850, công nghiệp sản xuất collagen xuất hiện tại Mỹ, nguồn nguyên liệuchính lúc này là xương

Năm 1871, một phát hiện quan trọng của bác sĩ người Anh Richard Leach Maddoxvề ứng dụng của collagen đã đưa đến bước đột phá trong ngành công nghiệp hình ảnh, vị bác

sĩ đã cải tiến “dry plate” với một lớp gelatin – bạc bromua và còn nhạy hơn khi so với “wetplate” Sau đó nghiên cứu của Charles Bennet đã tiếp tục hoàn thiện phương pháp dùng “dryplate” Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là giảm rất nhiều thời gian trong công nghiệpnhiếp ảnh

Cuối thế kỉ 19, khi ngành công nghiệp sản xuất collagen xuất hiện đã làm tăngthêm các ứng dụng của collagen trong các ngành công nghiệp khác và ổn định tính chất sảnphẩm

Năm 1930, ngành sản xuất collagen được phát triển mạnh mẽ khi da heo được xemnhư là một nguồn nguyên liệu thu nhận collagen Ngành công nghiệp sản xuất collagen ở

Châu Âu chỉ mới bắt đầu khoảng những năm 1930 nhưng Châu Âu lại trở thành khu vực sảnxuất collagen quan trọng nhất trên thế giới.

Năm 1950, công nghiệp sản xuất collagen có những bước phát triển đáng kể về kĩthuật, từ đó là nền tảng cho các tiêu chuẩn trong sản xuất và chất lượng sản phẩm ngày nay Ngày nay, sự hiểu biết về acid amin và protein nói chung, collagen cũng nhưgelatin nói riêng ngày càng nhiều Thêm vào đó là những tiến bộ trong kĩ thuật đã giúp sảnphẩm collagen đạt an toàn vệ sinh, chất lượng theo tiêu chuẩn quốc tế và yêu cầu nghiêm

ngặt của các yếu tố kĩ thuật

1.1.3 Nguồn gốc thu nhận Collagen

 Trong những năm trước đây, để đáp ứng nhu cầu trong công nghiệp, collagenđược trích ly chủ yếu từ da, xương của các loài gia súc và lợn Khoảng thời gian gần đây, sựbùng phát của các loại bệnh truyền nhiễm như bệnh bò điên (Bovine SpongiformEncephalopathy – BSE, Tranmissible Spongiform Encephalopathy – TSE) và bệnh lở mồmlong móng (Food and Mouth Disease – FMD) ở lợn và gia súc đã hạn chế phạm vi sử dụngcủa collagen có nguồn gốc từ những loài động vật trên bởi vì những bệnh truyền nhiễm cókhả năng lây truyền sang con người thông qua các mô của động vật Bên cạnh đó, ở một sốquốc gia, collagen trích ly từ lợn không được sử dụng vì rào cản tôn giáo Với những nguyênnhân trên, các nhà khoa học đang tập trung vào các nghiên cứu của họ để tìm ra những nguồncollagen thay thế Da, xương, vây, vảy của cả những loài cá nước ngọt, đặc biệt là cá da trơn:cá tra, cá ba sa, cá biển, da gà, da ếch, da mực,…có thể được sử dụng như những nguồn thaythế

 Trong số những nguồn thay thế, cá cung cấp một nguồn nguyên liệu thô tốt nhất vì:

- Dễ tìm, sẵn có để sử dụng

- Không có sự lây truyền bệnh

- Có khả năng thu được collagen với hiệu suất cao

Khoảng 70% tổng trọng lượng cơ thể của cá bị bỏ đi dưới dạng các phế phẩm như

da, xương, vây, đầu, vảy, ruột,…trong suốt quá trình chế biến Việc tận dụng những chất thải

này có thể nâng giá trị kinh tế của các loài cá lên

 Dựa vào thành phần % của tổng lượng collagen tính trên tổng lượng protein, các loài cá được chia thành 3 nhóm:

 Nhóm có hàm lượng collagen thấp: tổng lượng collagen chiếm đến 5 % so với tổng lượng protein

 Nhóm có hàm lượng collagen trung bình : tổng lượng collagenchiếm từ 5  10 % tổng lượng protein

 Nhóm có hàm lượng collagen cao: tổng lượng collagen trên

10 % tổng lượng protein

Thịt của những loài cá khác nhau chứa hàm lượng khác nhau của collagen hòa tan

trong acid (acid soluble collagen) và collagen không hòa tan (insoluble collagen) Hàm lượng

collagen tổng cộng dao động từ 0,3  2,99 % so với trọng lượng tươi của các mô, tương ứng

với phạm vi từ 1,58  13,39 % so với tổng lượng protein

Bảng 1.1 Thành phần collagen trong thịt cá

Loại cá Collagen hòa tan trong acid

(so với trọng lượng tươi) (so với trọng lượngtươi)Collagen không hòatan (so với trọng lượngtươi)Collagen tổng

Collagen tổng (so với protein tổng) Cá chim

Cho đến nay, hầu hết các loại mỹ phẩm trên nền collagen đều có chứa proteinchiết xuất từ gia súc Bởi sự bộc phát của bệnh bò điên BSE (Bovine SpongiformEncephalopathy – mad cow disease), collagen từ gia súc đang dần rút khỏi phạm vi sử dụng,thay vào đó là nguồn collagen được trích từ cá, đặc biệt là cá da trơn: cá tra, cá ba sa Nguồncollagen được chiết tách từ nguồn nguyên liệu này có nhiều đặc điểm tốt hơn cho việc ứngdụng trong thực phẩm, y học và mỹ phẩm Trong công nghệ sản xuất mỹ phẩm, mỹ phẩmtrên nền collagen từ gia súc có tốc độ hấp thụ rất chậm trên da người Đối mặt với vấn đềnày, liệu pháp tiêm collagen vào da được giới thiệu Tuy nhiên, những bất lợi của cách thứcnày là đắt tiền, đau đớn và đi kèm với nó là những rủi ro nguy hiểm cho con người Hiện nay,các nhà khoa học Phần Lan đã phát triển một tiến trình trích ly collagen từ cá Không giống

độ sâu và áp suất khác nhau Điều này có nghĩa là collagen trích từ da cá có một sức chốngchịu đặc biệt với các phá hủy lý và hóa học

Đối với các thuốc hay thức uống có chứa collagen, collagen từ cá cũng được chứngminh là có tốc độ hấp thụ vào máu nhanh hơn gấp 1,5 lần so với collagen từ lợn

Hình 1.1 Đồ thị so sánh khả năng hấp thụ vào máu của collagen

trích ly từ cá và từ lợn

 Việt Nam là một nước đang phát triển, có nền nông nghiệp với các sản phẩm phong phú Trong đó, các sản phẩm từ cá chiếm một phần lớn trong kim ngạch xuất khẩu.Những năm gần đây, việc nuôi cá da trơn : cá tra, cá ba sa rất phát triển, đặc biệt ở Đồngbằng sông Cửu Long Trong quá trình chế biến cá, song song với những chính phẩm dùng choviệc xuất khẩu (chủ yếu là fillet) là một khối lượng lớn các phụ phẩm như da, xương, vây,…Đây là những nguồn giàu collagen, có thể sử dụng thay thế cho những nguồn cung cấp

So sánh khả năng hấp thụ vào máu giữa collagen từ cá và

Collagen cổ điển như da, xương từ lợn, bò Việc tận dụng những nguồn này sẽ góp phần làmtăng giá trị kinh tế của các loài cá da trơn ở nước ta

1.2 CẤU TẠO COLLAGEN

1.2.1 1.2.1 Thành phần hóa học của Collagen [1]

 Thành phần protein trong collagen có gần đầy đủ các loại acid amin, bao gồmtất cả 20 loại acid amin ( Schrieber và Gareis,2007) Thành phần acid amin có thể thay đổitùy theo nguồn gốc của collagen, nhưng vẫn tồn tại một vài tính chất chung và duy nhất chotất cả collagen

Trong thành phần collagen không chứa cystein và trytophan, nhưng chứa mộtlượng lớn glycine (Gly), chiếm khoảng 33% và proline (Pro), chiếm tỉ lệ 12% vàhydroxyproline (Hyp), chiếm tỉ lệ 22% (Theo Balian và Bowes 1977) Collagen là một trongsố ít những protein có chứa hydroxylysine (Hyl), ngoài ra trong thành phần Collagen còn chứakhoáng, chiếm tỉ lệ 1%

Bảng 1.2 So sánh thành phần các acid amin trong collagen và các loại protein khác

(số gốc/1000 gốc)

 Hydroxyproline là một acid amin đặc trưng của collagen mà các loại protein khác không có Hydroxyproline được hình thành sau quá trình điều chỉnh proline khi được kếthợp vào vị trí Y trong chuỗi Gly-X-Y Hydroxyproline có công thức phân tử là C5H9NO3, khácvới proline, trong công thức cấu tạo của Hyp có gắn nhóm OH nằm ở vị trí cacbon gamma,acid amin này có vai trò quan trọng trong sự ổn định cấu trúc của collagen, là dẫn xuất củaproline trong quá trình hình thành chuỗi collagen có sự xúc tác của enzyme hydroxylaseproline và sự có mặt của Vitamin C để giúp bổ sung thêm Oxy, thiếu vitamin C sẽ làm chậmquá trình tổng hợp hydroxyproline, ảnh hưởng đến quá trình xây dựng cấu trúc protein gây ranhững rối loạn trong cơ thể.

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của hydroxyproline

 Phân tử collagen bao gồm 3 chuỗi xoắn lại với nhau tạo thành collagen helix tạo thành cấu trúc 3D- một mô hình lý tưởng cho các liên kết hydro giữa các chuỗi ( TeNijenhuis, 1997) Mỗi chuỗi trong triple- helix quay theo chiều kim đồng hồ Triple-helix dàixấp xỉ 300nm và chuỗi có khối lượng phân tử khoảng 105 kDa (Papon, Leblon và Meijer,2007) Triple-helix được ổn định bởi liên kết hydro nội giữa các chuỗi Trong cấu trúc phân tửcollagen, do tương tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kỵ nước vàvùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước làm trương nở collagen Sự biếntính collagen làm cho các cầu nối bị tách một phần hoặc hoàn toàn gây nên sự tách rời cácchuỗi do phá hủy các liên kết hydro, chính điều này làm mất đi cấu trúc triple-helix Mô hình

triple-“ triple-helice” của collagen dựa trên những nghiên cứu về hiện tượng nhiễu xạ sợi Chuỗinhiễu xạ sợi thể hiện trên mức trung bình của toàn bộ phân tử collagen , và mô hình đặc trưngthể hiện đó là sự sắp xếp lặp đi lặp lại của các chuỗi polypeptid, thông thường là Gly-Pro-Hyp

 Một đặc điểm đặc trưng của collagen là sự sắp xếp đều đặn của các amino acidtrong mỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc collagen này Mỗi sợi collagen này được cấu tạotừ ba chuỗi polypeptid nối với nhau giống như sợi dây thừng Cấu trúc của collagen tương tựnhư hình xoắn ốc, mỗi một chuỗi polypeptid trong collagen được cấu tạo từ các acid amintheo một trật tự, thông thường là Gly – Pro – Y, hoặc Gly – X – Hyp

Hình 1.3 Trình tự sắp xếp các acid amin trong phân tử Collagen

Trong đó X, Y là những đơn vị aminoacid khác nhau, có thể là proline (Pro) vàhydroxyproline ( Hyp) chiếm khoảng 1/6 chiều dài chuỗi Glycine chiếm gần 1/3 trong tổngsố các amino acid và nó được phân bố một cách đều đặn tại vị trí mỗi 1/3 xuyên suốt trongphân tử collagen Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của nó cho phép cácchuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau hình thành nên một đường xoắn ốc với khoảngtrống nhỏ ở phần lõi Tổng cộng chỉ riêng proline, hydroxyproline và glycine đã chiếm ½chuỗi Collagen Các acid amin còn lại chiếm ½

Bảng 1.3 Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide

hoặc disaccharide glucosylgalactose, liên kết với phần dư hydroxylysine thông qua nhómhydroxyl chức năng của amino acid Tỷ lệ của mono/disaccharide phụ thuộc vào loại collagenvà tình trạng sinh học Chức năng của các đơn vị carbohydrate vẫn chưa được hiểu biết đầyđủ, nhưng ảnh hưởng của chúng trong việc gắn kết phần bên phân tử collagen hình thành nênsợi và bán kính của sợi đang được nghiên cứu

Ngoài ra, trong phân tử collagen có những vùng gồm khoảng 9  26 aminoacid tại các điểm đầu mút amino hay carboxyl của chuỗi Các vùng này không sáp nhập vớicấu trúc xoắn ốc và được gọi là telopeptide

1.2.2 Cấu trúc phân tử Collagen [1]

 Phân tử collagen là một protein hình trụ, có cấu trúc bậc 4, do các đơn vịtropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có nhiều mứccấu trúc Đơn vị cơ bản của collagen là “Tropocollagen”, liên kết với nhau tạo thành nhữngsợi nhỏ Tropocollagen là một cấu trúc dạng sợi hình ống chiều dài khoảng 300nm, đườngkính 1.5nm, gồm ba sợi polypeptide (còn gọi là 3 chuỗi α) cuộn lại với nhau, mỗi chuỗi cuộn thành đường xoắn ốc theo hướng từ phải sang trái với 3 gốc trên một vòng xoắn, haycòn gọi là proline I ( xoắn trái với 3.3 gốc aminoacid/ vòng, liên kết peptid có hình thể cis ),

ba chuỗi này xoắn lại với nhau theo hướng từ trái sang phải tạo thành đường bộ ba xoắn ốc(triple helix) hay còn gọi là proline II ( xoắn trái với 3 gốc aminoacid/ vòng, liên kết peptidcó hình thể trans), khoảng cách giữa hai gốc tính từ hình chiếu của chúng lên các trục là0,31nm Hai cấu trúc này có thể chuyển đổi cho nhau và thường thì dạng II trong môi trườngnước thì bền hơn

Hình 1.4 Cấu trúc của Tropocollagen ( triple helix )

Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc liên kết với nhau bằng cácliên kết ngang tạo thành các sợi theo chu kỳ nhất định Chúng được sắp xếp so le nhau mộtkhoảng 67nm và có 1 khoảng trống 40nm ở giữa những phân tử liền kề nhau Nhờ vào cấutrúc có trật tự, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợi collagen, cungcấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng Vì thế collagen rất chắc,dai và bền

Hình 1.5 Liên kết ngang giữa các phân tử Tropocollagen

Các tropocollagen sẽ liên kết ngang với nhau theo kiểu cộng hóa trị và chính nhờvào liên kết này mà các phân tử tropocollagen hình thành nên sợi collagen Các sợi collagenrất dài và mảnh, chúng sắp xếp tạo thành mạng collagen

Hình1.6 Cấu trúc của procollagen và sự chuyển từ procollagen sang tropocollagen

Các bước hình thành nên collagen:

Bước 1: Tổng hợp chuỗi alpha, giai đoạn trước procollagen trên riboxom và trong

 Bước 2: Sự tổ hợp 3 chuỗi alpha hình thành procollagen.

 Sự hình thành cầu nối disulphide giữa các phần của chuỗi polypeptide tạiđầu C-

 Ba chuỗi alpha liên kết lại, hình thành chuỗi xoắn ốc, tạo procollagen

Đầu C Đầu N

s s s

s s s

Đầu C Đầu N

 Bước 5: Quá trình tự sắp xếp của collagen phân tử hình thành nên sợi collagen

 Bước 6: Tạo các liên kết ngang giữa các phân tử collagen đứng cạnh nhau

Hình 1.7 Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử và giữa các chuỗi polypeptide

Mỗi chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử khoảng 100 kDa, tạo nên tổng khối

lượng phân tử của collagen khoảng 300 kDa Chuỗi  được cấu tạo bởi khoảng 1000 aminoacid Các chuỗi  khác nhau (1, 2 và 3) ở thành phần amino acid Sự phân bố của cácchuỗi 1, 2 và 3 trong các phân tử collagen khác nhau tùy thuộc vào sự khác nhau về gene

1.2.3 Cấu trúc sợi của collagen [3]

 Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng sợi, baogồm những sợi mảnh, nhỏ Thông qua quá trình tạo sợi, các phân tử collagen tổ hợp với nhauhình thành nên các vi sợi (microfibril) bao gồm từ 4  8 phân tử collagen hoặc với số lượngnhiều hơn sẽ tạo thành các sợi (fibril) Những sợi này có đường kính từ 10  500 nm tùythuộc vào loại mô và giai đoạn phát triển Các sợi collagen sẽ thiết lập nên các sợi lớn hơn(fiber) và cao hơn nữa là các bó sợi (fiber bundle)

Hình 1.8 Cấu trúc sợi của collagen

 Sợi collagen là các tổ hợp có cấu trúc bán kết tinh của các phân tử collagen.Các vi sợi kết hợp tạo nên sợi lớn hơn Các sợi lớn hơn sẽ kết hợp với nhau tạo thành nhữngbó sợi collagen Các sợi collagen được sắp xếp với những cách thức kết hợp và mức độ tậptrung khác nhau trong các mô khác nhau để cung cấp các đặc tính khác nhau của mô

Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc tạo thành các sợi vớitính chu kỳ nhất định Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67 nm và có một khoảngtrống khoảng 40 nm giữa những phân tử liền kề nhau

Nhờ vào cấu trúc có thứ bậc, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc đượcchuyển sang các sợi collagen, tạo cho các mô có được độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính

cơ học riêng biệt

Có vài liên kết bên trong mỗi chuỗi triple helix và một số lượng biến thiêncác liên kết ngang giữa các chuỗi để hình thành nên những tổ hợp có trật tự (như sợicollagen) Các bó sợi lớn hơn được tạo nên nhờ vào sự trợ giúp của một vài loại protein (baogồm những loại collagen khác nhau), glycoprotein và proteolycan để hình thành các loại mô

Chuỗi polypeptide

Phân tử collagen

Vi sợi Sợi

Bó sợi

khác nhau từ sự sắp xếp luân phiên của những thành phần trên Sự không hòa tan củacollagen là một trở ngại cho việc nghiên cứu nó cho tới khi người ta phát hiện tropocollagencó thể được trích ly từ những động vật còn non do chưa xảy ra liên kết ngang hoàn toàn Tuynhiên, sự phát triển của kỹ thuật hiển vi (Electron Microscopy (EM) và Atomic ForceMicroscopy (AFM)) và sự nhiễu xạ tia X đã cho phép các nhà nghiên cứu thu được nhữnghình ảnh chi tiết về cấu trúc của collagen Những tiến bộ này có ý nghĩa quan trọng trongviệc hiểu được cách thức mà collagen tác động lên mạng lưới tế bào, sự xây dựng, phát triển,phục hồi, thay đổi của mô trong quá trình phát triển.

1.3 PHÂN LOẠI COLLAGEN [4]

 Tính đến thời điểm hiện tại, có 42 loại chuỗi polypeptide được nhận dạng.Chúng được mã hóa bởi 41 loại gene khác nhau, tạo thành 27 loại collagen Họ collagen đượcphân loại thành những phân họ khác nhau dựa vào sự tổ hợp của các siêu phân tử Sự phânbố trong các mô của những loại protein khác nhau thể hiện tính đa dạng và phạm vi đáng chú

ý, từ những loại collagen riêng biệt như collagen II, X có trong sụn đến những loại collagendạng sợi phân bố rộng khắp như collagen I và V Những loại collagen khác nhau thực hiệnnhững chức năng chuyên dụng trong các mô và có phương thức sắp xếp riêng biệt của cácsiêu phân tử Một số loại được cấu tạo từ một tam phân (homotrimer), trong khi đó những loạikhác được cấu tạo từ nhiều tam phân Loại collagen phong phú nhất là những collagen dạngsợi hình thành những nền tảng cấu trúc của da, gân, xương, sụn và những loại mô khác

Hình 1.10 Một vài dạng sinh học của collagen

Dựa theo cấu trúc và cách tổ chức sắp xếp các phân tử trong chuỗi, collagen đượcphân chia thành 7 nhóm chính : collagen dạng hình sợi, FACIT collagen, collagen dạng mạng,collagen dạng giữ chặt, collagen chuyển màng, collagen màng nền và các loại collagen cóchức năng duy nhất khác Những loại collagen này khác nhau về chiều dài của chuỗi xoắn ốccũng như bản chất và kích cỡ của những phần không xoắn ốc

Bảng 1.4 Phân loại và vị trí phân bố các loại collagen

Collagen dạng sợi

chằng, giác mạc,

lưới sọi của cámô( phổi, gan, lách,

xương,

XI α1(XI)α2(XI)α3(XI) Sụn, thủy tinh thể,

biểu bì - da, niêmmạc miệng, Dạng mạng lưới lục

FACIT collagen

máu, phổi, cơ vân,

con người

phôi da, xương ứcsụn, gân,

Collagen chuyển

màng

ruột, sụn bào, phổi,gan,

biểu bì – da,

té bào cơ trơn, thận,

tụy,

phiến keratin,

Collagen loại I là phổ biến nhất và thường ở trong các mô liên kết như da,xương, gân Collagen loại II hầu như tồn tại ở các mô sụn Collagen loại III lại phụ thuộc rấtlớn vào độ tuổi của động vật, da heo còn trẻ chứa tới 50%, theo thời gian tỷ lệ này giảm 5÷10% Những loại colagen khác chỉ hiện diện với lượng rất nhỏ và chỉ ở một vài cơ quan đặcbiệt

Hơn 90% collagen trong cơ thể là các collagen loại I, II, III và IV Những bệnh tậtliên quan đến collagen là do sự khuyết tật về gene ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp, sự sắpxếp cũng như các quá trình khác trong sự sản sinh collagen một cách bình thường

1.3.1 Collagen dạng sợi

Collagen dạng sợi cổ điển bao gồm các loại I, II, III, V, XI Những loại collagennày có khả năng kết hợp tạo thành một tổ hợp cấu trúc siêu phân tử được định hướng cao, đólà chuỗi sợi so le bậc 4 với đường kính từ 25 – 400nm Dưới kính hiển vi điện tử, những sợinày được xác định bởi một mô hình đặc trưng với một dải chu kỳ khoảng 70nm ( được gọi làchu trình D) dựa vào sự sắp xếp so le của mỗi đơn phân collagen riêng biệt

 Loại I Collagen loại I là collagen chiếm thành phần và được nghiên cứu nhiều

nhất Nó chiếm hơn 90% khối lượng của xương và là thành phần chính của mô liên kết tronggân, da, dây chằng, giác mạc, chiếm thành phần rất ít trong sụn, thủy tinh thể,

Cấu trúc triple_helix của collagen loại I bao gồm hai chuỗi xoắn α1 giống hệtnhau và một chuỗi α2 Trong cơ thể sinh vật, hầu hết chuỗi xoắn α3 được kết hợp vào hỗnhợp có chứa loại III collagen ( có trong da và lưới sợi) hoặc loại IV collagen ( có trong xương,gân và giác mạc) Trong hầu hết các cơ quan đặc biệt là trong gân, collagen loại I có chứcnăng tạo nên độ giãn, chắc Trong xương, nó tham gia xây dựng cấu trúc của xương, đảm bảokhả năng chịu tải trọng, độ cứng chắc của xương

 Loại II

Collagen loại II là thành phần đặc trưng và chiếm hàm lượng cao trong sụn trong suốt Tuy nhiên, hàm lượng collagen loại II này ngày càng chiếm tỉ lệ lớn trong tổng sốcollagen ( khoảng 80%) khi được tìm thấy trong các cơ quan như : thủy tinh thể, các biểu môgiác mạc, dây sống, Cấu trúc triple_helix của collagen loại II được đặc trưng bởi ba chuỗixoắn α1 hình thành một phân tử “ homotrimeric” tương tự nhau về kích thước và cả chứcnăng sinh học như của collagen loại I

Những sợi collagen khác trong sụn đóng vai trò kết hợp với collagen loại II, cũngnhư loại XI và IX nhằm để giới hạn đường kính trong khoảng từ 15 – 50nm Khác với

collagen loại I , chuỗi xoắn collagen loại II chứa hàm lượng hydrolysine khá cao, cân bằngnồng độ của proteoglycan – một thành phần đặc trưng ở dạng ngậm nước của sụn trong suốt.

 Loại III

Giống như loại II, collagen loại II cũng được tạo thành từ 3 chuỗi xoắn α1.Collagen loại III được phân bố rộng rãi trong các mô ngoại trừ xương Nó là thành phần quantrọng của những sợi lưới trong các mô hở ở phổi, gan, lá lách, Phân tử “Homotrimeric”thường kết hợp với collagen loại I tạo thành một thành phần phong phú trong các mô đànhồi

Bảng 1.5 Sự phân bố acid amin của 3 chuỗi α trong collagen loại I và loại III

α1 ( loại I) α2 ( loại I) α1 ( loại III)

Collagen loại V và XI như là một phân nhóm nhỏ trong collgen dạng sợi,cấutrúc của hai loại collagen này là một “heterotrimer” đặc trưng bởi 3 chuỗi xoắn α1 , va α2ø, α3khác nhau Điều đáng chú ý là chuỗi xoắn α3 trong cấu trúc loại collgen XI được mã hóa bởicác gen tương tự như chuỗi α1 trong cấu trúc collagen loại II, chỉ khác ở kích thước củaglycosylation và hydroxylation Sự kết hợp giữa sự giống và khác nhau của cấu trúc hai loạicollagen này xuất hiện khá nhiều trong các mô

Theo những nghiên cứu trước đây cho thấy, collagen loại V là một hình thứcđặc thù của collagen loại I và loại III ở trong xương, giác mạc và nằm xen kẽ trong cơ bắp,gan , phổi Collagen loại XI cũng phân phối rộng trong cơ sụn như loại II Một lượng lớn phíacuối đầu amino non- collagen của chúng chỉ được tổng hợp một phần và sự hợp nhất của hailoại collagen để tạo thành cấu trúc “heterotrimer” được cho là để kiểm soát khả năng lắpráp, sinh trưởng và đường kính của chúng Kể từ đó, cấu trúc triple helix được cho là một mànche trong các mô, chúng được đặt ở trung tâm hơn là trên bề mặt Do vậy, collagen loại V cóchức năng như là một cấu trúc sợi cốt lõi cùng với loại I và III xung quanh trục trung tâm.Tương tự như mô hình này, collagen loại XI được cho hình thức cốt lõi của những sợi collagenloại II

1.3.2 “Fibril – Associated Collagens with Interrupted Triple helices”:FACIT

collagen

Cấu trúc cơ bản của những loại collagen này được đặc trưng bởi những phần thuộccollgen bị gián đoạn bởi những chuỗi ngắn không xoắn và những phân tử “ trimer” hóa cóliên quan đến bề mặt của các sợi khác nhau

 Loại IX

Collagen loại IX được phân bố trong sụn và thủy tinh thể như collagen loại II.Collagen này thuộc loại “ heterotrimeric”, cấu trúc bao gồm 3 chuỗi xoắn α1, α2 và α3 khácnhau tạo thành ba đoạn xoắn hai bên hình cầu Phân tử collagen loại IX được đặt dọc theo bề

mặt của sợi collagen loại II theo hướng đối song với nhau Sự tương tác này được ổn định bởiliên kết cộng hóa trị từ lysine đến đầu amino của collagen loại II

 Loại XII và XIV

Collagen loại XII và loại XIV có cấu trúc gồm 3 chuỗi xoắn α1 kết hợp với nhau,các loại collagen này được phân bố chủ yếu trong xương da, gân phổi, thành mạchmáu, cũng như collagen loại XIX và XX, chức năng của các collagen này vẫn chưa dược tìmhiểu rõ

1.3.3 Collagen vi sợi

Collagen loại VI được tạo thành từ 3 chuỗi xoắn α1, α2 và α3 khác nhau với cấutrúc xoắn mở rộng và kéo dài dạng hình cầu Chuỗi xoắn α3 gần như là dài gấp đôi các chuỗikhác vì chiều dài đầu amino và cacboxyl khá lớn Những sợi ban đầu kết hợp bên trong tếbào theo hướng đối song với nhau, từng cặp chồng chéo lên nhau, sau đó sắp xếp bốn phầnsong song nhau Trong mạng lưới ngoại bào, chúng tập hợp thành những tổ hợp sợi và hìnhthành mạng lưới vi sợi độc lập trong hầu hết các mô liên kết, ngoại trừ trong xương

1.3.4 Collagen chuỗi ngắn

Collagen loại X là thành phần đặc trưng của sụn trong xương sườn, xương sống,…,nó được tạo thành từ 3 chuỗi xoắn α3 giống nhau, cấu trúc mạng lưới hình lục giác với đầucacboxyl lớn và đầu amino ngắn Chức năng của collagen loại X vẫn chưa được tìm hiểu sâu,các nhà nghiên cứu vẫn đang thảo luận về vai trò của nó trong quá trình hóa xương sụn vàvôi hóa

Collagen loại VIII có cấu trúc giống như collagen loại X nhưng có sự phân phốikhác biệt nhau, vì thế mà chức năng của nó cũng khác Quá trình hình thành mạng lưới trongcollagen này được thực hiện bằng các nội mô tế bào hình thành nên cấu trúc hình lục giác

1.4 TÍNH CHẤT CỦA COLLAGEN

Collagen là một protein cấu trúc Chính vì vậy collagen cũng có đầy đủ các tínhchất hóa lý của một protein

1.4.1 Tác dụng với nước

 Collagen không hòa tan trong nước mà nó hút nước để nở ra, nguyên nhân là do tương tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kỵ nước và vùng phâncực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước làm trương nở collagen Cứ 100g collagenkhô có thể hút được khoảng 200g nước Collagen kết hợp với nước nở ra trong nước, độ dàytăng lên chừng 25% nhưng độ dài tăng lên không đáng kể, tổng thể tích của phân tử collagentăng lên 2 – 3 lần

 Do nước phân cực tác dụng lên liên kết hydro trong liên kết phối trí của collagenlàm giảm tính vững chắc của sợi collagen từ 3 – 4 lần Khi nhiệt độ tăng lên cao, tính hoạtđộng của mạch polypeptide tăng mạnh, làm cho mạch bị yếu và bắt đầu đứt thành nhữngmạch polypeptide tương đối nhỏ Khi nhiệt độ tăng lên trong khoảng 60 – 650C collagen hútnước bị phân giải Nhiệt độ phân giải của collagen trong nguyên liệu chưa xử lý tương đốicao Khi nguyên liệu đã khử hết chất khoáng, thì nhiệt độ phân giải của nguyên liệu sẽ giảmxuống

1.4.2 Tác dụng với acid và kiềm

Collagen có thể tác dụng với acid và kiềm, do trên mạch của collagen có gốccarboxyl và amin Hai gốc này quyết định hai tính chất của nó Trong điều kiện có acid tồntại, ion của nó tác dụng với gốc amin, điện tích trên carboxyl bị ức chế (hình thành acid yếucó độ ion hóa thấp) Trái lại gốc amin bị ion hóa tạo NH3+

Môi trường H+

NH3+…Cl

3 +…Cl-

ra acid và kiềm có thể làm cho collagen biến đổi như sau:

 Cắt đứt mạch muối (liên kết giữa –NH3+…COO-) làm đứt mạch peptide trongmạch chính

 Làm đứt liên kết hydrogen giữa gốc –CO…NH– của mạch xung quanh nó

 Làm acid amin bị phân hủy giải phóng amoniac

Cùng với những biến đổi đó, điểm đẳng điện của collagen hạ xuống thấp, (vì những

COONH3 + +H

-3N

+H

3N NH3+OOC

biến đổi đó mang tính chất thủy phân làm cho các nhóm gốc có tính hoạt động tăng lênnhiều).

Acid và kiềm đều có thể phân hủy collagen, nhưng sự phân hủy của collagen cho tớinay vẫn chưa có khái niệm chính xác Để biểu thị sự biến đổi chính xác của collagen dưới tácdụng của acid, kiềm nói chung đều dùng độ keo phân giải làm chỉ tiêu Độ keo phân giải làchỉ số keo sinh thành sản phẩm có thể tan trong nước (thường là trong điều kiện đun nóng),những sản phẩm này dưới nồng độ tương ứng tiến hành làm lạnh có thể biến thành keo Theo kết quả nghiên cứu tác dụng của vôi đối với collagen có thể làm tăng độ phângiải của nó rất mạnh, trong điều kiện nhiệt độ thường thời gian dài có thể xúc tiến sự phângiải của collagen (tùy độ phân giải của nó rất thấp) lúc nhiệt độ tăng lên hoặc xử lý bằngkiềm thì độ phân giải tăng lên

Collagen phân giải biến thành gelatin, căn cứ vào giả thuyết của Hofmeister phảnứng sẽ tiến hành như sau:

Lúc xử lý ở nhiệt độ cao trong nước, keo dễ tiếp tục thủy phân thành:

C102 H151N31 O39 + 2H2O C55 H85 N17O22 + C47 H70O19 + 7N2

dụng cơ học, ) thì nó có tác dụng phân giải, với điều kiện thích hợp nhất là ở nhiệt độ 370C,

Sau khi bị biến tính Collagen thường có các tính chất sau :

 Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ H2O vốn ở bên trong phân tử protein Tức là khi collagen chưa biến tính, các acidamin có các nhóm kỵ nước nằm bêntrong phân tử collagen Khi bị biến tính, phân tử Collagen lúc này chỉ là trình tự sắpxếp các acidamin mạch thẳng, làm cho các nhóm kỵ nước lộ ra ngoài nên độ hòatan cả collagen bị giảm đi

 Khả năng giữ nước giảm, cấu trúc bậc bốn giúp cho collagen có khả năng hydrat hóa tạo thành màng hydrat bao quanh Khi biến tính mất đi cấu trúc bậc bốnthì khả năng hydrat hóa không còn, vì thế nên collagengiữ õnước kém

 Hoạt tính sinh học ban đầu mất đi Điều này là hiển nhiên vì hoạt tính sinh họccủa một protein được quyết định bởi các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn Khicấu trúc này mất đi, protein chỉ là các polypeptid, và không có hoạt tính sinh học

 Hoạt tính sinh học ban đầu mất đi Điều này là hiển nhiên vì hoạt tính sinh họccủa một protein được quyết định bởi các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn Khicấu trúc này mất đi, protein chỉ là các polypeptid, và không có hoạt tính sinh học

 Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme protease do làm xuất hiện các liên kết peptide ứng với trung tâm hoạt động của protease

 Tăng độ nhớt hiện tại

 Mất khả năng kết tinh, collagen có khả năng kết tinh trong các môi trường muốihoặc cồn Ở các điều kiện pH nhất định dung dịch collagen không bền và kết tinh gọi là pH đẳng điện Khi bị biến tính điểm đẳng điện của protein không còn vàchúng khó có thể kết tinh

1.4.4 Tính kỵ nước

Do các gốc kỵ nước của acidamin trong chuỗi polypeptid của collagen hướng rangoài, các gốc này liên kết với nhau tạo liên kết kỵ H2O Độ kỵ nước có thể giải thích là docác acidamin có chứa gốc R-không phân cực nên nó không có khả năng tác dụng với nước.Tính kỵ nước sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến tính tan của collagen

1.4.5 Tính chất của dung dịch keo

Khi hòa tan protein thành dung dịch keo thì nó không đi qua màng bán thấm Haiyếu tố đảm bảo độ bền của dung dịch keo là :

 Sự tích điện cùng dấu của các protein

 Lớp vỏ hydrat bao quanh phân tử protein

Khi dung dịch keo không bền, sẽ có hai dạng kết tủa : kết tủa thuận nghịch và kếttủa không thuận nghịch

 Kết tủa thuận nghịch: sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thìprotein vẫn có thể trở lại trạng thái dung dịch keo bền như ban đầu

 kết tủa không thuận nghịch: sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thìprotein không trở về trạng thái dung dịch keo bền vững như trước nữa

Dung dịch collagen có độ nhớt cao trong khoảng pH = 2 -5 , trong đó pH = 2 cho độnhớt cao nhất, điều này giúp cho việc nghiên cứu, tách chiết collagen

1.4.6 Tính chất Hydrat hóa của collagen

Trong quá trình hydrat hóa, protein tương tác với nước qua các nối peptid hoặc cácgốc R ở mạch bên nhờ liên kết hydro Nồng độ protein, pH, nhiệt độ, thời gian, lực ion, sự có

và protein – nước Khi nồng độ protein tăng thì lượng nước hấp thụ tống số tăng, pH thay đổidẫn đến thay đổi mức độ ion hóa và sự tích điện trên bề mặt phân tử Collagen, làm thay đổilực hút và lực đẩy giữa các phân tử này và khả năng liên kết với nước

Khi nhiệt độ tăng thì khả năng giữ nước của Collagen giảm do làm giảm các liênkết hydro Ngoài ra, bản chất và nồng độ các ion gây ảnh hưởng đến lực ion trong môi trườngvà sự phân bố điện tích trên bề mặt phân tử Collagen nên cũng ảnh hưởng đến khả nănghydrat hóa Người ta nhận thấy có sự cạnh tranh của phản ứng giữa nước, muối và các nhómngoại của acid amin Khi nồng độ muối thấp, tính hydrat hóa của protein có thể tăng do sựđính thêm các ion giúp mở rộng mạng lưới protein Tuy nhiên khi nồng độ muối cao, cácphản ứng muối – nước trở nên nổi trội hơn, làm giảm liên kết protein – nước và protein bị

“sấy khô”

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ VÀ PHÂN TÍCH COLLAGEN

Có nhiều phương pháp đánh giá và phân tích collagen : phân tích độ nhớt, độ ẩm,hàm lượng tro, xác định khối lượng phân tử, vi sinh, phân tích thành phần protein trongcollagen (Xác định tổng nitơ bằng phương pháp Kjeldahl), phân tích thành phần axit amin

1.5.1 Phương pháp điện di trên gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) để xác định trọng lượng phân tử collagen

Điện di theo phương pháp SDS- PAGE của phương pháp của Kittiphattanabawon,Benjakul, Visessanguan, Nagai, Tanaka, (2005), sử dụng Buffer System là máy điện di đứng,loại mini- PROTEAN Tetra cell của hãng BIORAD

Mẫu collagen được hòa tan trong dung dịch acid acetic 0,5M đến nồng độ 2,5 mg/ml Chỉnh pH của dung dịch collagen bằng sodium phosphate 0,2 M đến giá trị pH 4,4 Sau đó, hòa dung dịch mẫu này vào hổn hợp chứa 1% SDS (sodium dodecyl sunfate) và urea 3,5M (pH 7,2), khuấy trộn liên tục ở nhiệt độ phòng Hỗn hợp được ly tâm để loại bỏ tạp

chất không tan Dung dịch này được trộn theo tỉ lệ 1/1(v/v) với dung dịch đệm (0,5M tris-HCl,

Dung dịch collagen 0,03 % trong acetic acid 0,1N, được khuấy đều cho tan hết.Tiến hành đo độ nhớt trong một bể điều nhiệt Nhiệt độ được gia tăng rất chậm khoảng

1oC/ph Bắt đầu đo ở 33oC và kết thúc ở 50oC Một phút lấy giá trị một lần

Độ nhớt của dung dịch collagen được xác định tương ứng ở các mức nhiệt độ Độnhớt tương đối được tính như sau:

ht: độ nhớt đo được tại mỗi mức nhiệt độ

hmax: độ nhớt lớn nhất

hmin: độ nhớt nhỏ nhất

Đường cong biến tính nhiệt được xây dựng bằng cách vẽ đồ thị độ nhớt tương đốitheo nhiệt độ Nhiệt độ biến tính chính là nhiệt độ mà tại đó độ nhớt tương đối giảm đi mộtnửa

Hình 1.11 Đường cong biến tính nhiệt của 2 loại collagen thu được từ da cá và da lợn

trong axit axetic 0,1N và nồng độ collagen là 0,03%

1.5.3 Phân tích hàm lượng hydroxyproline

Hydroxyproline là một acid amin đặc trưng của collagen Chúng không có trongbất kỳ một loại protein nào khác, ngoại trừ một lượng nhỏ trong elastin Do đó, có thể địnhlượng collagen thông qua định lượng hydroxyproline và nhân với hệ số chuyển đổi 14,7(Sadowska, Kolodziejska, & Niecikowska, 2003)

Quy trình xác định hydroxyproline được thực hiện theo phương pháp củaIgnat’eva, Danilov, Averkiev, Obrezkova, Lunin, Sobol, 2005

Cấu trúc của hydroxyproline có chứa vòng pyrrolidine, nó có thể bị oxy hóa đểhình thành vòng pyrrole Vòng pyrrole này tác dụng với tác chất Ehrlich, 4–(N,N–dimethylamino) benzaldehyde tạo thành hợp chất quinoid có màu (màu sắc phụ thuộc vàonhóm thế và thay đổi từ màu cam đến màu hoa cà) Thực hiện phương pháp so màu để tínhhàm lượng hydroxyproline

1.5.4 Đo phổ hồng ngoại infrared (IR) spectroscopy.

Phổ hồng ngoại IR là một trong những kỹ thuật phổ được sử dụng rộng rãi nhất,là phương pháp đo độ hấp thụ của mẫu thử ở các bước sóng khác nhau của tia hồng ngoại.Mục đích chính của việc phân tích phổ IR là xác định các nhóm chức hóa học có trong mẫuthử Những nhóm chức khác nhau sẽ hấp thụ những bước sóng riêng biệt Với nhiều thiết bịphụ tùng, máy phổ hồng ngoại có thể làm việc với nhiều dạng mẫu từ khí, lỏng đến rắn Phântích phổ IR là một công cụ phổ biến và quan trọng để làm sáng tỏ cấu trúc và xác định cáchợp chất

hiện ở peak có cường độ 3330 cm-1, nhóm amide B được thấy ở peak có cường độ 3080 cm-1.Trên quang phổ còn thấy xuất hiện sự dao động của amide bậc I ở 1650 cm-1, amide bậc II ở

1545 cm-1 và amit bậc III ở 1237 cm-1 Cấu trúc của protein và amide bậc III chứng minh sựtồn tại của kết cấu có hình xoắn ốc (Surewicz và Mantsch, 1988, Muyonga, 2004)

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT COLLAGEN

Trong các công trình nghiên cứu, qui trình thu nhận collagen gồm 3 giai đoạn chính :

 Giai đoạn phá vỡ tế bào:

- Các phân tử collagen không có khả năng đi qua màng tế bào, vì vậy cần phá vỡ cấu trúc tế bào để chuyển collagen vào dung dịch Các biện pháp được sử dụng có thểlà các biện pháp cơ học như tiến hành ngiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, sau đó tiếnhành đồng hóa (homogenizator) Thiết bị này có chày thủy tinh gắn với motor quay và có thểđiều chỉnh tốc độ quay theo yêu cầu Các tế bào nằm giữa chày thủy tinh và thành cối sẽ bịphá vỡ

- Sử dụng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone kết hợp với các chất tẩyrửa Các hóa chất này giúp cho việc phá vỡ các bào quan của tế bào

 Giai đoạn tách chiết collagen:

- Sau khi phá vỡ cấu trúc tế bào, việc tách chiết collagen được tiến hành dễ dàng hơn, collagen có thể được chiết tách bằng acid hoặc bằng enzyme, quá trình tách chiếtcollagen được thực hiện trong các reactor ở nhiệt độ lạnh và trong điều kiện vô trùng, kết hợpkhuấy trộn liên tục để đảm bảo collagen thu được có chất lượng tốt

 Giai đoạn tinh sạch collagen:

- Trong dịch chiết thô, ngoài collagen còn có các protein tạp, các lipid, muốikhoáng, để loại các thành phần này cần sử dụng các biện pháp khác nhau

- Để loại muối khoáng thường dùng phương pháp thẩm tích Thẩm tích là sựkhuyếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan ( protein, mộtsố polysaccaride ) nhưng thấm đối với các dung dịch tinh thể ( các muối của hợp chất hữu cơ

bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ hay dùng các phương pháp sắc ký trao đổiion, điện di, phương pháp lọc gel,…

2.1 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI

2.1.1 Qui trình chiết tách collagen từ da heo [6]

Na 2 SO 4

Da heo

Ngâm Cạo lông

Rửa

Loại béo

Nước

Ly tâm

Trích ly Kết tủa

Kết tủa lại

 Thuyết minh qui trình công nghệ :

Da heo sau khi thu nhận sẽ qua quá trình xử lý ngâm với dung dịch Na2SO4, sau đótiến hành cạo lông rồi cho qua quá trình rửa với nước theo tỉ lệ H20 : da = 6 : 1(w/w) Tiếnhành rửa lần 1 trong vòng 30 phút, sau đó rửa tiếp lần 2 và 3, mỗi lần được thực hiện trongvòng 20 phút, nhiệt độ 300C Quá trình rửa giúp loại bớt các tạp chất như phần thịt dư, máu,mỡ thừa, nhầy nhớt,… để chuẩn bị cho các quá trình tiếp theo

Sau khi tiến hành rửa với nước, da heo sẽ được loại béo bằng dung dịch isopropylkết hợp với bổ sung chất hoạt động bề mặt không ion Tiến hành bổ sung chất hoạt động bềmặt 2 lần vào dung dịch chứa da heo và ngâm trong vòng 6h, trường hợp loại béo bằng dungdịch isopropyl ta tiến hành trong vòng 10h

Da heo sau khi được loại chất béo sẽ được trích ly bằng dung dịch NaOH 3% (w/v)và monomethylamine 1,9%(v/v) để tách chiết collagen, quá trình được tiến hành ở nhiệt độ

200C trong vòng 1 tuần để đảm bảo collagen có chất lượng tốt

Để kết tủa collagen vừa được trích ly ta dùng dung dịch acid HCl 5M Đến đâycollagen thô đã được kết tủa, pH lúc này bằng 4,6 – 4,7 Để thu được collagen sạch ta tiếnhành ly tâm lấy phần tủa hòa tan lại trong dung dịch dịch acid acetic 0.1M, quá trình đượcthực hiện ở 40C trong vòng 72h, tiến hành ly tâm lần nữa ta thu được collagen thành phẩm

 Những kết quả phân tích collagen trên da heo :

Kết quả cho thấy collagen được thu nhận từ da heo có cấu trúc chủ yếu gồm haichuỗi α1 và α2 Ứng với mỗi chuỗi có 8 peptide khác nhau và những peptide này được phântích giữa sự kết hợp trao đổi ion và sắc ký lọc gel để xác định thành phần các acid amin cótrong mỗi chuỗi Kết quả cũng cho thấy chuỗi collagen được đặc trưng bởi vị trí và trọng

Bằng các phương pháp xác định cho thấy collagen từ da heo có nhiệt độ biến tính ở

370C, nhiệt độ biến tính của collagen có liên quan đến các thành phần acid amin, đặc biệt làcác thành phần proline, hydroxyproline, glycine Nhiệt độ biến tính này còn phụ thuộc vàođiều kiện nhiệt độ môi trường sống động vật

2.1.2 Qui trinh chiết tách collagen từ gân chân gà [7]

Collagen thành phẩm

 Thuyết minh qui trình công nghệ :

Nguyên liệu là gân chân gà sau khi được cắt nhỏ được ngâm với dung dịchCH3COONa để loại đi các protein hòa tan và các carbonhydrat trong thời gian 3 ngày Dungdịch thu được ta tiến hành trích ly để thu được collagen bằng cách bổ sung dung dịch đệmcitrat 0,15M

Dung dịch sau khi trích ly được đem đi lọc để loại đi các tạp chất rắn khác, sau đótiến hành thẩm tích dung dịch vừa thu được để loại đi các muối ra khỏi hỗn hợp để tinh sạchcollagen

Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chấtkeo hòa tan ( protein, một số polysaccaride ) nhưng thấm đối với các dung dịch tinh thể ( cácmuối của hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, ) Các tinh thể có thể khuếch tán từdung dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vào dung dịch keo Trong khi đó,các ion và các chất phân tử nhỏ sẽ chuyển từ dung dịch keo vào dung dịch có nồng độ thấphơn

Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại muối ra khỏi dung dịchprotein thì dung dịch protein được cho vào các túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm,thường là dùng các túi cellophan Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn, H20 hay lượnglớn dung dịch đệm được pha loãng

Ở đây tác giả dùng dung dịch Na2HPO4 0,02M Vì màng cellophan là màng bánthấm có kích thước lỗ chỉ cho các chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua các dung dịch đệmloãng Như vậy, muối sẽ khuếch tán vào dung dịch đệm loãng ( di chuyển theo hướng giảmnồng độ), còn dung dịch đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein.Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi