TIỂU LUẬN- KỸ THUẬT GEN TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH SỚM Ở NGƯỜI

Kỹ thuật gen trong chuẩn đoán một số bệnh  Ung thư vòm họng do virut Epstein-Barr Bệnh lao do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis  Sốt xuất huyết chẩn đoán trước sinh bệnh Teo cơ tủ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Kỹ thuật gen trong chuẩn đoán một

số bệnh

 Ung thư vòm họng do virut Epstein-Barr

Bệnh lao do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis

 Sốt xuất huyết

chẩn đoán trước sinh bệnh

Teo cơ tủy(SMA)

Loạn dưỡng cơ Duchenne(DMD)

Bệnh alpha- Thalassemia

Tăng thượng thận bẩm sinh(CAH)

….

Chuẩn đoán bệnh

Trực tiếp Quan sát bệnh phẩm qua kính hiển vi

Trực tiếp Quan sát bệnh phẩm qua kính hiển vi

Nuôi cấy, phân lập vi sinh vật gây bệnh

Huyết thanh bệnh nhân

Kháng nguyên đặc hiệu của vsv trong

Kỹ thuật gen

Gen là đơn vị chức năng cơ sở của bộ máy di truyền

chiếm một locus nhất định trên nhiễm sắc thể và xác định một tính trạng nhất định Các gen là những đoạn vật chất

di truyền mã hóa một tính trạng nhất định Các gen là

những đoạn vật chất di truyền mã hóa cho những sản

phẩm riêng lẻ như các mRNA được sử dụng trực tiếp cho tổng hợp các enzym, các protein cấu trúc hay các chuỗi polypeptide để gắn lại tạo ra protein có hoạt tính sinh học Ngoài ra, gen còn mã hóa cho các tRNA, rRNA,

mRNA…

Kỹ thuật gen - Phương pháp PCR

PCR (polymerase chain reaction): “phản ứng chuỗi

trùng hợp” hay “phản ứng khuếch đại gen”

Nguyên lý phương pháp PCR

Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzim helicase

Kết hợp với enzim DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trong môi trường thích hợp

Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên biệt, chủ động

Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật Multiplex PCR

Là phương pháp PCR sử dụng đồng thời cùng

1 lúc nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau

Ung thư vòm họng

Nguyên nhân: có rất nhiều

giả thiết, nhưng chủ yếu

Virut Epstein-Barr

Hệ gen của EBV là chuỗi ADN xoắn kép, mạch hở, kích thước khoảng 172 kb

Hệ gen của EBV gồm 6 tổ hợp gen mã hóa cho các loại protein kháng nguyên, ký hiệu là EBNA (EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C và EBNA-LP) và 3 tổ hợp gen mã hóa cho protein màng là LMP-1, LMP-2A và LMP-2B

Trình tự mARN gen LMP-1 của EBV (1.116 bp)

Chuẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc

Theo thông báo của Tổ

Vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis

Tách chiết DNA trong

mẫu đàm bệnh nhân

http://giangduongykhoa.wordpress.com/category/lao-ph%E1%BB%95i/

Các hệ mồi, mẫu dò nhằm phát hiện các kiểu đột biến katG/315/AGC -> ACC, rpoB/516/GAC -> GTC và emb/306/ATG -> GTG/CTG/ATA/ATC/ATT

Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi

và mẫu dò nhằm phát hiện đột biến

katG/315/AGC ->ACC rpoB/516/GAC -> GTC

Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi

và mẫu dò nhằm phát hiện đột biến

emb/306/ATG ->GTG (biểu đồ màu xanh)

emb/306/ATG ->ATA (biểu đồ màu đỏ)

Kết quả khảo sát độ nhạy của hệ mồi và mẫu dò nhằm phát hiện đột biến

katG/315/AGC ->ACC rpoB/516/GAC -> GTC

Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi

và mẫu dò nhằm phát hiện đột biến

emb/306/ATG ->GTG (biểu đồ màu xanh)

emb/306/ATG ->ATA (biểu đồ màu đỏ)

Kết quả

Cả ba biểu đồ: tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín hiệu nền từ mẫu có nồng độ amplicon 107 copy/ml với chu kỳ ngưỡng Ct giảm dần đến mẫu có nồng độ 102 copy/ml Mẫu có nồng độ 10 copy/

ml thì có tín hiệu huỳnh quang thấp hơn tin hiệu nền.

Chuẩn đoán sốt xuất huyết

 Sốtxuất thuyết là do virus Dengue (có 4 type: 1,

2, 3, 4) Là bệnh lý nguy hiểm đe doạ tính mạng cần được chẩn đoán phát hiện sớm.

 Phương pháp ELISA phát hiện IgM không thể giúp chẩn đoán sơm nhiễm Dengue (phải sau ngày

thứ 4 của bệnh)

 RT-PCR Dengue có thể giúp chẩn đoán sớm SXH ngay trong những ngày đầu của bệnh, và còn

định được type Dengue

 Chẩn đoán phát hiện sớm SXH rất có giá trị để điềutrị và theo dõi bệnh

Chẩn đoán trước sinh bệnh thiếu máu

huyết tán Alpha - Thalassemia

Alpha -Thalassemia: bệnh di truyền lặn NST thường do đột biến gen HbA, nằm trên cánh ngắn NST 16(16p13.3) gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi alpha globin

Alpha -Thalassemia là một trong những bệnh huyết sắc tố phổ biến nhất, là nguyên nhân hàng đầu gây hiện tượng phù thai

Chẩn đoán trước sinh bệnh

Alpha-Thalassemia

Vùng gen α-globin gồm 2 gen: HbA1 và HbA2

Các đột biến thường gặp gây Alpha-Thalassemia

gồm: mất đoạn lớn dạng SEA, thailand, philipin, α4.2, α3.7 và các đột biến điểm HbQs, HbCs

Đột biến trên vùng gen α-globin gồm 2 nhóm: gây

mất hoàn toàn số lượng chuỗi α globin và làm giảm số lượng chuỗi α globin

Chẩn đoán trước sinh bệnh

Alpha-Thalassemia

Đối tượng nghiên cứu

 Sản phụ có thai từ tuần 15-25

 Hình ảnh siêu âm thai bất thường

 Tiền sử sinh con bất thường

 Tiền sử gia đình hoặc người thân mắc các

bệnh như teo cơ tủy, tăng sản thượng thận bẩm sinh

Kỹ thuật tiến hành

Nuôi cấy tế bào dịch ối: dịch ối được nuôi cấy trong dung dịch Amniomax Fluid Sau 10-14 ngày, thu hoạch các tế bào dịch ối và rửa sạch bằng dung dịch PBS 1X

Tách chiết DNA từ mẫu ngoại vi và tế bào dịch ối sau nuôi cấy

Kỹ thuật Multiplex PCR: nhận biết sự mất đoạn của 5 đột biến mất đoạn lớn

Kỹ thuật tiến hành

C-ARMS-PCR( combine Amplification Refratory

Mutation System Polymereas Chain Reaction): là kỹ

thuật Multiplex PCR được sử dụng để sàng lọc các đột biến Dùng các mồi đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ sung với alen đột biến và một mồi chung ngược chiều với một đặc hiệu alen Sự có mặt của đột biến được thể hiện bằng sản phẩm DNA khuếch đại với các kích thước khác nhau.

Kỹ thuật thực hiện

 Giải tự vùng gen alpha-globin và phân tích kết quả: giải trình tự được thực hiện trên máy ABI 3130 Kết quả được phân tích bằng phần mềm chromas và

chromas pro, sau đó được đưa tới ngân hàng gen để

so sánh với trình tụ gen alpha thalassemia chuẩn.

Kết quả

Kết quả

Nhận xét

 Trong 7 đột biến sàng lọc, alen đột biến dạng SEA gặp với tần suất cao nhất 59%, đột biến HBQs 17,6%, HbCs 11,8%, α4.2: 5,9%

Chẩn đoán trước sinh bệnh tăng thượng

thận bẩm sinh

 Tăng thượng thận bẩm sinh (TSTTBS-CAH)

là bệnh dii truyền lặn trên NST thường, chủ

yếu do thiếu hụt hoạt động của enzyme 21-OH, gen CYP21A mã hóa cho enzyme 21-OH.

 Sự thiếu hụt hoạt động của enzyme 21-OH

dẫn đến sự thiếu hụt cortisol hoặc thiếu hụt

aldosternone cũng như thừa adrogen thượng

thận.

Chẩn đoán trước sinh bệnh tăng thượng

thận bẩm sinh

 Vùng gen mã hóa cho E 21-OH gồm 2 gen: gen

CYP21 và gen giả CYP21P Vùng gen này nằm trên cánh ngắn NST6

 Gen CYP21P là gen bất hoạt, gen CYP21 mã hóa cho E 21-OH.

 Qua quá trình phân bào giảm nhiễm, sự bắt chéo

không đồng đều giữa các cặp NST làm cho trình tự

ở vùng gen giả chuyển sang gen CYP21 gây nên đột biến trên gen.

 95% đột biến trên gen CYP21 là do đột biến

chuyển đoạn từ gen giả CYP21P, 5% còn lại là do

tự gen CYP21 bị đột biến

Đối tượng nghiên cứu

 2 mẫu dịch ối của 2 gia đình có con đầu đã

được chẩn đoán lâm sàng bị bệnh tăng thượng thận bẩm sinh

Phương pháp nghiên cứu

 Mẫu bệnh phẩm: 15ml dịch ối

 Phân tích gen CYP21

 Nuôi cấy tế bào dịch ối: trong dung dịch Amniomax fluid là môi trường đặc hiệu chỉ cho tế bào dịch ối Thu

và rửa sach bằng dung dịch PBS sau 10-14 ngày.

 Tách chiết DNA từ tế bào dịch ối: bằng các kit tách

DNA của Qiagen Đức.

Phương pháp nghiên cứu

Sàng lọc các đột biến thường gặp bằng kỹ thuật

MLPA: sử dụng kit MLPA P050B2 sàng lọc 6 đột

biến thường gặp: P30L(exon1), mất đoạn 8bp(exon3), I172N(exon4), exon 6 cluster, Q318, mất toàn bộ gen CYP21, mất đoạn 30kb.

Giải trình tự gen CYP21 và phân tích kết quả

Kết quả

Gia đình 1:

Kết quả

Gia đình 2:

Tài liệu tham khảo

 PGS.TS Khuất Hữu Thanh Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật 2006.

 Nguyễn Đình Phúc và Lê Thanh Hòa Virut Epstein-Barr gây ung thư vòm mũi họng và một số phương pháp hiện đại ứng dụng trong chẩn đoán Tổng quan Tạp chí Công nghệ Sinh học 2008, 6 (2), tr.1-18.

 Hồ Thị Thanh Thủy, Nguyễn Văn Hưng… Phát hiện nhanh vi khuẩn lao

Mycobacterium tuberculosis kháng các thuốc isoniazid, rifampin và