Tiểu luận kỹ thuật gen di truyền

Tiểu luận kỹ thuật gen di truyền

Mục lục

1 Tổng quan bệnh teo cơ DMD

2 Triệu chứng bệnh

3 Chẩn đoán

• DNA test

• Muscular biopsy test

• Prenatal test

4 Liệu pháp gen:

• Liệu pháp truyền thống

• Liệu pháp mới

• Hướng đi mới 1: mini- và micro- dydstrophin

• Hướng đi mới 2: exon skipping

5 Khái quát các liệu pháp gen điều trị DMD

6 Tài liệu tham khảo

Trang 2 3 4-5 4 5 5 6-14 6 7 7 11 14 15

Tổng quan: Bệnh teo cơ Duchenne muscular dystrophy

Duchenne muscular dystrophy (DMD) là một dạng bệnh teo cơ, liên quan tới việc biểu hiện tính trạng lặn của nhiễm sắc thể giới tính X Người mặc chứng bệnh này sẽ thoái hóa cơ rất nhanh, thậm chí mất khả năng đi lại và chết; tỷ lệ mắc là 1/3500 nam, góp phần lớn nhất về tầm nguy hiểm trong tất cả các dạng teo cơ Hầu hết chỉ nam có biểu hiện bệnh, nữ thường là người mang yếu tố gây bệnh, trừ trường hợp nữ có cha bị bệnh còn mẹ mang bệnh Sự rối loạn này là do có đột biến trong gen DMD, định vị trên nhiễm sắc thể giới tính X (Xp21) trong thể gen của con người

Cho tới nay, gen DMD được coi là gen lớn nhất trong số 30,000 gen, mã hóa cho các loại protein của con người; bao gồm 79 exons _chứa 2,6 triệu bp Với kích thước lớn như thế, gen luôn có xu hướng sắp xếp lại và tái tổ hợp, rất dễ gây ra đột biến Phần lớn là đột biến do mất một hoặc một vài exon ( 60%); tuy nhiên, lặp đoạn (6%), đảo đoạn và đột biến điểm cũng đã được tìm thấy Khi xảy ra đột biến, nó sẽ phá vỡ khung đọc khi phiên mã dystrophin và dẫn tới việc kết thúc sớm quá trình tổng hợp protein này

Dystrophin là thành phần cấu trúc vô cùng quan trọng trong các tế bào cơ, giúp liên kết các protein từ phía bên trong khung xương của mỗi sợ cơ với phức hợp ngoài màng sợi Nếu vắng mặt dystrophin sẽ cho phép canxi thâm nhập quá mức qua màng

tế bào, gây nguy hiểm cho các sợi cơ và thủng màng, nhưng vai trò tiềm năng của protein này còn là truyền tín hiệu, cho nên nhiều triệu chứng bệnh được phát hiện có nguồn gốc từ hai hướng Sự yếu đi của các cơ một cách nhanh chóng dẫn tới việc tất

cả các bệnh nhân mắc DMD đều phải ngồi xe lăn trước 12 tuổi và hầu như sẽ chết ở tuổi 20

Hình 1: Vai trò

của dystrophin

Triệu chứng

Triệu chứng chính của DMD, hay rối loạn thần kinh cơ nhanh chóng, là sự yếu đi của các cơ, đi kèm với nhiễm độc cơ, đầu tiên là ở các cơ thần kinh chủ động như cơ xương chậu, xương mác, diễn tiến tới các cơ thuộc vùng vai và cổ, lan xuống cơ tay

và cơ hô hấp Các triệu chứng xuất hiện từ những năm đầu của trẻ:

• Trẻ có thể bắt đầu bị sẩy chân, vấp ngã, đi lắc lư, gặp khó khăn khi đi lên cầu thang và đi bằng ngón chân (gót chân không nện xuống ,một đáp ứng bù lại của

cơ thể khi cơ duỗi đầu gối bị yếu )

• Mệt mỏi

• Gặp khó khăn với các kỹ năng liên hoàn ( chạy, nhảy lò cò, nhảy cao )

• Khả năng học kém

• Mắc chứng cơ bắp chân phình to, khi các mô cơ bị phá huỷ và được thay bằng mỡ

Hình 2: Mô bệnh học thuộc cơ cẳng chân, từ người bị

mắc bệnh Dunchenne và đã tử vong Quan sát cho thấy rất nhiều sợi cơ đã bị thay thế bởi các tế bào mỡ

Chẩn đoán

A DNA test:

Việc kiểm tra và phân tích DNA có thể xác định được loại đột biến và những exon nào bị ảnh hưởng

Theo trang Leiden Muscular Dystrophy ( hiệu đính tháng 10,2008):

Dựa trên những kết quả mới nhất đảm bảo xác định được các loại đột biến trong gen DMD_ nguyên nhân gây ra bệnh teo cơ Dunchenne [xem Table, White & den Dunnen 2006, Aartsma-Rus 2006] thì các kỹ thuật dựa trên vật liệu DNA tốt nhất cho đến nay để phát hiện ra những thay đổi ở mức phân tử trong cơ thể bệnh nhân như sau:

1 Kiểm tra mất đoạn- lặp đoạn:

• Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA): Điểm mạnh của MLPA (Schwatz & Duno 2003) ở chỗ nhờ phương pháp này người ta đã kiểm tra được tất cả 79 exon trong gen DMD, đánh giá exon nào có khả năng bị đột biến mất hay lặp đoạn

• Multiplex PCR (Beggs & Chamberlain kits): phương pháp này chỉ có thể kiểm tra 18 trong tổng số 79 exon và nó không xác định được đột biến lặp đoạn trên 5-7% bệnh nhân (den Dunnen 1989, White & den Dunnen 2006) Ngoài ra, các kỹ thuật truyền thống, như Southern blotting, khá cần thiết để xác định được những giới hạn chính xác của vùng tái sắp xếp trên gen, cũng như là lọc ra các đột biến lặp đoạn Việc tìm kiếm những giới hạn này vô cùng quan trọng nếu muốn phân biệt được các khung đọc mở trong những khung đọc đã bị thay đổi do đột biến

• Các phương pháp khác : một số phương pháp định lượng khác cũng đã đang được sử dụng rải rác, qPCR (quantitative-PCR - e.g Ashton 2008); Multiplex-Amplifiable Probe Hybridisation - (MAPH - White 2002) là một phương pháp đơn giản và có tính chọn lọc cao, nhưng nó đòi hỏi hàm lượng DNA mẫu nhiều và thao tác tỉ mỉ FISH, CA_ phương pháp phân tích đánh dấu lặp và qPCR đặc hiệu exon là những công cụ có giá trị để xác nhận các

vùng tái sắp xếp đã biết trong cơ thể người mang yếu tố gây bệnh nhưng lại không hiệu quả lắm nếu muốn kiểm tra bệnh nhân trực tiếp

2 Kiểm tra đột biến điểm:

Nhiều nghiên cứu cho rằng việc kiểm tra đột biến điểm dựa trên vật liệu RNA là

kỹ thuật mạnh nhất để phát hiện ra những thay đổi mất hay lặp những đoạn có hại nhưng không phải exon trên gen DMD Bằng cách nhân vùng mang mã trọn vẹn trên DMD từ khuôn RNA, tất cả các đột biến gây ngắn cụt bất lợi sẽ được giải quyết, bao gồm cả những trình tự RNA-splicing Phương pháp Protein Truncation Test (PTT) đang được cải thiện và tỏ ra rất hiệu quả, tuy đây chưa phải là cách đơn giản nhất Hơn nữa, với các mẫu RNA lấy sinh tiết từ cơ thì không phải lúc nào cũng cho kết quả, với mẫu RNA từ tế bào lympho thì rất khó tiến hành (Tuffery-Giraud 2004) Đoạn cDNA có được sau RT-PCR được đem đi giải trình tự để xác định sự có mặt của các loại đột biến (Hamed 2006, xem Primers for DMD RNA RT-PCR)

B Muscle biopsy test:

Nếu các kiểm tra trên DNA thất bại trong việc phát hiện đột biến, việc thử sinh tiết

cơ cần được tiến hành Chiết tách lấy một lượng mẫu nhỏ mô cơ rồi đem nhuộm nhằm phát hiện dystrophin Sự vắng mặt hoàn toàn loại protein này chỉ ra người mắc bệnh

C Prenatal tests:

(Các kiểm tra khi mang thai)

Nếu một trong 2 người bố hoặc mẹ là người mang nhân tố gây bệnh (carrier), thì

đó là mối nguy hiểm tiềm tàng cho đứa trẻ Các test này được tiến hành trong suốt thời kỳ mang thai, nhằm cố gắng phát hiện ra thai nào bị ảnh hưởng

Liệu pháp gen

A Liệu pháp gen truyền thống :

Kích cỡ của gen DMD mã hóa cho dystrophin luôn là một thách thức ngặt ngèo đối với các nhà nghiên cứu liệu pháp gen chữa trị bệnh teo cơ Dunchenne Nhằm thay thế gen dystrophin bị khiếm khuyết, người ta đưa một cấu trúc cDNA vào nhân của tế bào

cơ, tại đây nó sẽ được biểu hiện và điều hòa một cách thích hợp

Vì thế, để chuyển giao đoạn cDNA dystrophin 14kb ( với 11,5 kb mang mã), cần tới các vecto có năng lực lớn Những vecto thế hệ đầu tiên được tổng hợp từ virus vùng tuyến (adenoviral) mặc dù có kích thước lên tới 8kb song vẫn quá nhỏ Sau này, nhiều vecto có sức chứa lớn ( 28kb _ loại bỏ hết các gen virus) đã bỏ qua được giới hạn này, hơn thế còn làm giảm các đáp ứng miễn dịch của cơ thể chủ và nâng cao mức biểu hiện chuyển gen trong tế bào cơ Tuy nhiên, có hai vấn đề mà các nhà nghiên cứu cần phải vượt qua trước khi áp dụng thành liệu pháp chữa trị rộng rãi : một là, chúng quá lớn nên rất khó đi qua phức hợp ngoài màng ( extracellular matrix: trong tế bào cơ đây là một lớp mỏng , còn gọi là basal lamina, chứa collagen, elastin và fibronectin;

nó bao quanh sợi cơ và hoạt động như là một màng lọc hay một rào chắn có tính chọn lọc của tế bào) Hai là, không có nhiều thụ thể tương thích với adenoviral trên bề mặt sợi cơ

Tương phản với vecto adenoviral, vecto có nguồn gốc từ virus herpes simplex type-1 (HSV-1) có thể tự chứa được đoạn cài lớn Loại vecto này cũng tỏ ra đạt mức

Hình 3: Sự di

truyền bệnh DMD đến thế

hệ sau nếu mẹ

là người mang yếu tố gây bệnh (carrier)

độ chuyển gen cao trong phòng thí nghiệm, nhưng, cũng giống như adenoviral vecto, chúng chỉ được tìm thấy trong các tế bào cơ mới sinh Ngoài ra, tính độc hại của virus

và sự miễn dịch đối với HSV-1 cản trở sự biểu hiện gen dài hạn

Kích thước của cả mảnh cDNA dystrophin không phải là vấn đề lớn khi làm việc với vector plasmid DNA không có nguồn gốc từ virus vì chúng có thể chứa những đoạn cài lớn Những vecto này được tổng hợp nhân tạo và không lây lan, vì thế rất thích hợp để dùng trong thử nghiệm Tuy nhiên, con đường chuyển gen này không mấy hiệu quả trong các mô cơ, vì thế vẫn hình thành các phân tử lipid Để làm tăng hiệu suất chuyển gen, cần tới các thao tác như : xung điện, vi bong bong và sóng siêu âm…

B Liệu pháp gen mới:

Một vài cách tiếp cận mới trong liệu pháp gen cho bệnh DMD đang được nghiên cứu và phát triển, song song với các cách truyền thống Việc sử dụng mạch đôi DNA hoặc chuỗi oligonucleotide RNA nhằm sửa chữa lại đoạn gen bị hỏng nhờ vào bộ máy sửa sai DNA của tế bào đang được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm , mở ra những khám phá đầy hứa hẹn cho căn bệnh quái ác này Con đường này cho phép sửa chữa các đột biến điểm tại exon 23 trên gen dystrophin của chuột và tại intron 6 trên gen CXMD của loài chó vàng Phương pháp này vẫn đang chưa hiệu quả lắm trên cơ thể người và còn phụ thuộc khá nhiều vào tốc độ sửa sai trong các tế bào chủ Tuy nhiên,

nó tỏ ra khá mạnh bởi tác động bền bỉ, tích lũy và lâu dài

Một sự lựa chọn khác là điều trị bằng aminoglycoside ( nhóm chất kháng sinh có tác dụng ức chế việc tổng hợp protein của vi khuẩn và đặc biệt là VK gram âm ), với

cố gắng ngăn chặn bộ ba kết thúc sớm _ một nguyên nhân gây ra DMD Ví dụ, hoạt chất gentamicin đã phục hồi lại sự biểu hiện của dystrophin chức năng trong cơ xương của chuột mdx Sau đó, một vài thử nghiệm trên người với loại thuốc truyền thống này

đã được tiến hành và báo cáo hoàn thiện, tuy nhiên không thành công lắm so với thử nghiệm trên chuột Vì thế cần có những nghiên cứu sâu hơn để đánh giá lại tính khả thi của phương pháp này

Hướng đi mới 1: mini- và micro- dystrophin

• Giảm được kích thước của đoạn gen chuyển mã hóa dystrophin Một loạt các đoạn bị mất trong dystrophin là nguyên nhân gây ra các triệu chứng bệnh lý nhẹ trên cơ thể bệnh nhân BMD Do vậy, phần lớn trong gen này có vẻ không mấy quan trọng với chức năng của nó Để thiết lập bản đồ những vùng cần thiết cho hoạt tính của dystrophin, các chú chuột mdx đã được biến đổi để bị mất đi một vài chi tiết khác nhau trên bốn domain dystrophin Những đoạn bị mất trong domain N-terminal có liên quan đến kiểu hình bệnh lý trên, chứng tỏ vùng đó khá quan trọng nhưng chưa phải là thiết yếu cho sự liên kết với actin và cytoskeleton Ngược lại, việc xóa đi domain giàu cysteine gây ra triệu chứng teo cơ rất mạnh, nguyên nhân chính phá hủy phức hợp dystrophin-glycoprotein Domain C-terminal không cần lắm cho sự gắn kết phức hợp trên Cuối cùng là domain thanh nối trung tâm, khi xóa đi một vài đoạn trên domain này, mặc dù cấu trúc thanh là cần thiết nhưng số lượng các đoạn lặp lại có thể được giảm xuống một cách đáng kể Tuy nhiên, thuộc tính định vị của các đoạn lặp này và sự hiện diện,hình dạng của các vùng kết nối có tính cốt yếu Một cấu trúc mini 6.2kb (∆H2–R19) chứa 8 đoạn lặp và vùng nối 1,3,4 đã được thiết kế

để bắt chước exon 17 Người ta nhận ra nó hoàn toàn được vận hành: chuột mdx chuyển gen mang cấu trúc này đã biểu hiện hình thái không bị teo cơ và hoạt động bình thường

Một cấu trúc dystrophin mini khác cũng có thể cải thiện bệnh lý teo cơ trên chuột mdx Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng 5 đoạn lặp và 2 vùng nối đủ khả năng cung cấp độ dài cần thiết cho domain thanh Sẽ khả thi nếu muốn rút ngắn hơn nữa bằng các cấu trúc micro (3.6–4.2 kb), rất thích hợp với tế bào cơ, ít nhất là

ở cơ chuột Cấu trúc nhỏ nhất và hiệu quả hiện nay (∆R4–R23) chỉ có 3,6kb, chứa 4 đoạn lặp và các vùng nối 1,2,4

• Chuyển gen nhờ vectơ rAAV : bên cạnh việc giúp chúng ta thêm hiểu biết về đại phân tử protein dystrophin, bản đồ domain trên còn cung cấp các cấu trúc gen mang mã mà với nó, vấn đề bấy lâu liên quan đến năng lực chứa có giới hạn của các vecto chuyển gen sẽ được giải quyết Nói riêng thì việc sử dụng vectow rAAv để chuyển gen là khả thi Các cấu trúc mini- và micro- dystrophin khác nhau sẽ được chuyển vào vectow rAAV type-2 và kiểm nghiệm lại trên chuột mdx Các nghiên cứu đều cho kết quả rằng vecto rAAV chuyển gen chứa 4,5 hay 8 đoạn lặp liên kết với 2 hoặc 3 vùng nối là một phương thức rất hiệu quả trong điều trị nhiều triệu chứng DMD Nhìn chung, đã có sự biểu hiện rõ ràng của mini- và micro-dystrophin, với sự định vị chính xác trên màng sợi cơ

và phức hợp glycoprotein-dystrophin đã phục hồi lại Những tác động của liệu pháp này đang được xác định bằng nhiều thông số sinh lý như: đường kính sợi

cơ, tế bào cơ, độ giảm tính nguyên vẹn của màng và mức độ hoại tử

Tuy nhiên, những đáp ứng miễn dịch trong cơ thể chống lại rAAV lại mạnh hơn, quan sát thấy trên các cơ bị teo so với cơ khỏe mạnh bình thường Điều này dễ dẫn tới viêm nhiễm môi trường quanh cơ mdx và tác động của kháng nguyên tế bào (APCs), hoạt hóa các tế bào lympho T chống lại sản phẩm chuyển gen, phá hủy các sợi cơ mới Dù vậy, sau đó kháng nguyên NEO lại được giải phóng từ các sợi cơ bị teo, hoạt động nhờ nguyên bào cơ và tái sinh các sợi mới Để tối thiểu hóa các đáp ứng miễn dịch này, cần tới thuốc ức chế miễn dịch để đình chỉ hoạt động của APCs, bảo vệ sợi cơ

Hình 4: Mô hình các domain cấu trúc chính của phân tử dystrophin trong cơ

thể con người, becker mini- và micro-dystrophin, và ultrophin

• Phân tử dystrophin có chiều dài đầy đủ bao gồm 4 domain: N-terminal (đỏ) liên kết với F-actin, domain giàu cystein (xanh lá cây) gắn với β-dystroglycan (β-DG) và vùng C-terminal (vàng) liên kết với dystrobrevins và syntrophin Domain thanh trung tâm (xanh da trời) chứa 24 spectrin_ tương tự các đoạn lặp (R1-R24) và 4 đoạn nối (H1-H4)

• Trong cấu trúc mini-dystrophin, domain thanh nối đã bị cắt bỏ bớt một vài đoạn lặp hoặc đoạn nối Lưu ý rằng các cấu trúc chuyển vào vecto rAAv không còn chứa domain C-terminal

• Phân tử ultrophin cũng bao gồm domain N-terminal liên kết với actin,

• Triển vọng:

Cấu trúc micro- và mini- dystrophin đạt hiệu quả với chuột mdx nhưng còn phải xem xét trên cơ thể con người Những yêu cầu tính năng tối thiểu đối với protein dystrophin của người và các domain thiết yếu của nó có thể khá khác so với chuột Nhưng, hướng đi này vẫn mở ra một câu hỏi liệu rằng cấu trúc này

có thể khôi phục lại chức năng của cơ cũng như ngăn chặn các nguy hiểm cho

cơ không, vì đối với cơ thể người thì phân tử dystrophin lớn hơn

Hình 5: Dùng vecto adeno-associated viral (rAAV) tái tổ hợp dường

như là phương án tốt nhất để chuyển gen vào tế bào cơ,mặc dù giới

hạn đoạn cài chỉ có 5 kb.Nó có khả năng mang lại sự biểu hiện gen dài hạn,do hình thành các monomer EPISOME bền

Hơn thế nữa, nhiều hiệu quả chuyển gen đáng chú ý có thể đạt được trong các mô cơ trưởng thành, đưa lại sự biểu hiện mạnh của thụ thể AAV type 2

Quan trọng nhất,mảnh rAAV đủ nhỏ để vượt qua phức hợp ngoài màng cơ một cách dễ dàng Gen đích, ví dụ là mini- hay

micro-dystrophins được cài vào giữa trình tự AAV inverted terminal repeat

(ITR),dưới sự điều khiển của promoter mong muốn (vd,CMV,MCK

hoặc CK6)