tiểu luận kỹ thuật di truyền- phương pháp ssr

Ví dụ: • GTGTGTGTGTGT • hay GT6 CTGCTGCTGCTGCTG • hay CTG5 ACTCACTCACTCACTC • hay ACTC4 II.ĐẶC ĐIỂM: Microsatellite là marker được lựa chọn trong việc lập bản đồ phân tử, sự xác định nhữ

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN: KĨ THUẬT DI TRUYỀN

TS: Trần Thị Dung

Sinh viên thực hiện:

Ngô Thị Dung-61203022 Nguyễn Kim Dung-61203023 Nguyễn Hoàng Thêm-61203134

Chủ đề: PHƯƠNG PHÁP SSR

NỘI DUNG

I KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP SSRs

II ĐẶC ĐIỂM

III CƠ CHẾ ĐỘT BiẾN HÌNH THÀNH

MICROSATELLITES

IV CÁC LOẠI SSRs

V PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

MICROSATELLITES (SSRs)

VI PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN

MICROSATELLITES (SSRs) VII NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA

MICROSATELLITES VIII ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG

PHÁP MICROSATELLITES

IX TÀI LIỆU THAM KHẢO

I.KHÁI NIỆM:

• Microsatellite là những trình tự đặc biệt của DNA mà có chứa sự lặp lại nối tiếp từ 2 đến 6 bp

còn gọi là SSR (simple sequence repeats), STR (short tandem repeats), VNTR (variable number of tandem repeats)

Ví dụ:

• GTGTGTGTGTGT

• hay (GT)6 CTGCTGCTGCTGCTG

• hay (CTG)5 ACTCACTCACTCACTC

• hay (ACTC)4

II.ĐẶC ĐIỂM:

Microsatellite là marker được lựa chọn trong việc lập bản đồ phân tử, sự xác định những giống cây trồng, đánh giá nguồn gốc tổ tiên của cây trồng cho mục đích nghiên cứu quần thể cây trồng và sự tiến hóa là vì

• Có tính đa alen và biến dị cao

• Là marker đồng trội

• Phân bố ngẫu nhiên khắp bộ gen sinh vật

• Dễ dàng xác định bằng PCR sử dụng các primer đặc biệt

Một cá thể có một locus đồng hợp sẽ có cùng số lần lặp lại trên cả hai nhiễm sắc thể, trong khi một cá thể dị hợp sẽ có số lần lặp lại khác nhau trên hai nhiễm sắc

thể Những vùng xung quanh locus của microsatellite, được gọi là vùng hai bên (flanking region) có thể có cùng trình tự Điều này rất quan trọng bởi vì những vùng hai bên có thể được dùng như primer của phản ứng PCR khi

nó sẽ khuếch đại microsatellite, và vùng hai bên này sẽ bảo tồn giữa các giống hay thỉnh thoảng giữa các họ

• (SSRs có thể được khuếch đại để xác định phản ứng dây chuyền

polymerase (PCR) quá trình, bằng cách sử dụng chuỗi duy nhất

• DNA liên tục bị làm biến tính ở nhiệt độ cao để tách các sợi đôi, sau đó làm lạnh để cho phép ủ mồi và phần mở rộng của trình tự nucleotide thông qua SSRS

• Quá trình này cho kết quả nhìn thấy trên gel agarose hoặc

polyacrylamide , chỉ một lượng nhỏ DNA cần thiết cho việc khuếch đại bởi vì theo cách này thermocycling tạo ra một sự gia tăng theo cấp số nhân trong phân đoạn nhân rộng

NGUYÊN LÝ CỦA SSR MARKER

• Dựa vào hai đầu (vùng sườn) của các đoạn lặp lại có trình tự rất đặc biệt

và thống nhất chung cho cùng một đoạn DNA trên gen không phân biệt

cá thể trong cùng một loài, nhưng giữa các cá thể trong cùng một loài số

lần lặp lại của đơn vị lặp lại là khác nhau Từ đó, thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản các cặp DNA trên gen chứa các trình tự lặp lại Điện di sản phẩm PCR cho phép phân biệt được sự giống và khác nhau giữa các cá thể trong cùng loài

III CƠ CHẾ ĐỘT BIẾN HÌNH HÀNH MICROSATELLITE

Cơ chế đột biến hình thành Microsatellites vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ Tuy nhiên có hai giả thuyết được nhiều người chấp nhậm là

do 1) quá trinh bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân và

2) quá trình trượt lỗi trong quá trình sao mã

1 Sự trượt lỗi của polymerase (Polymerase slippage)

-Khi DNA tái bản, enzyme polymerase không tìm thấy vị trí của nó và cắt bớt đơn vị lặp lại hay thêm vào quá nhiều đơn vị lặp lại

- Kết quả là sợi mới có số lần lặp lại khác với sợi bố mẹ Điều này giải thích cho những sự thay đổi nhỏ trong số lần lặp lại (thêm vào hoặc bớt

đi một hay nhiều lần lặp lại)

-Sự trượt lỗi có thể khuếch đại những trình tự lặp lại ngắn này thành nhiều lần lặp lại qua các thế hệ kế tiếp

-Bên cạnh đó, hiệu quả của hệ thống sửa chữa cho sự bắp cặp sai cũng đóng một vai trò quan trọng trong tốc độ biến đổi của microsatellite

2 Sự bắt cặp không đồng đều trong giảm phân

Cơ chế này giải thích cho những thay đổi lớn hơn trong số lần lặp lại Trong sơ đồ dưới, nhiễm sắc thể A có quá nhiều sự lặp lại, và nhiễm sắc thể

B thì có quá ít sự lặp lại

Nguyên nhân tồn tại của microsatellite

-Microsatellite là DNA vô nghĩa, và sự biến đổi phần lớn không có tính chất

rõ rệt.Chúng thường không có tác động có thể đo lường được trên kiểu hình, và khi chúng đột biến, thông thường là gây hại và không có lợi Ở người, 90% những microsatellite đã biết được tìm thấy trong vùng không

mã hóa của bộ gen Khi tìm thấy ở vùng mã hóa ở người, microsatellite được biết là gây bệnh Thú vị là khi tìm thấy trong vùng mã hóa,

microsatellite thường là sự lặp lại ba nucleotide Sự giải thích có

thể là do những dạng nucleotide lặp lại khác sẽ gây hại nhiều cho vùng mã hóa, vì nó sẽ gây ra sự đột biến xê dịch khung

- Microsatellite cung cấp nguồn cần thiết cho sự đa dạng di truyền

Ở vi khuẩn, sự biến đổi alen của microsatellite trong vùng mã hóa được cho

là để thích nghi với những môi trường khác nhau Nghĩa là một alen ngắn

có thể thích nghi với một môi trường, và một alen dài với nhiều lần lặp lại

có thể thích nghi với một môi trường khác Đặc biệt là, sợi nhỏ protein ngắn có thể làm cho vi khuẩn ít nhớt, và một sợi nhỏ protein dài hơn có thể làm nó dính hơn và gây bệnh hơn (Moxon và Wills, 1999) Do đó, có sự

đa dạng trong quần thể sẽ đảm bảo sự sống sót của quần thể vi khuẩn trong những môi trường khác nhau Tương tự, Kashi và Soller (1999) tin rằng sự

đa dạng của microsatellite có thể là một cách để đền bù cho sự mất đi tính

đa dạng di truyền do

bởi sự chọn lọc di

IV CÁC LOẠI SSRs

• Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần – dinucleotide repeat) chúng ta có tri nucleotide loại di nucleotide được tìm thấy nhiều ở động vật có vú chủ yếu là GT/AC, ở thực vật là AA/TT, AT/TA

• Chúng ta có thể phân ra làm 3 loại (hoàn hảo không có sự ngắt quãng trong trình tự phối hợp và ngắt quãng bao gồm kết hợp nhiều loại lặp lại, ngắt quãng bị chèn bởi 1 hay nhiều base

i) Satellites là đoạn trình tự lặp lại 1 lần mà có thể cấu tạo tới vài

phần trăm của genome có thể lớn tới 5 Mb Satellites thường tập trung ở vùng tâm động của nhiễm sắc thể do đó nó it khi được sử dụng trong phân biệt kiểu gen của các cá thể mà được sử dụng nhiều trong quá trình lập bản

đồ gen ở gần vùng tâm động

ii) Minisatellites có mặt tại hàng trăm hoặc hàng nghìn vị trí khác

nhau trên gennome mà ở đó một đơn vị lặp lại từ 10 bp cho tới 0,5-30 kb

Để phát hiện ra minisatellite người ta có thể dùng phương pháp mẫu dò phóng xạ Những thông tin này có thể tạo nên thông tin đặc biệt riêng cho từng cá thể như kiểu "dấu vân tay" ở người Nó được sử dụng để xác định quan hệ trong gia đình và nguồn gốc của các mẫu vật

iii) Microsatellite là các đoạn lặp lại ngắn 2-6bp và kích thước mỗi

locus là 20-100 bp

Microsatellite được ứng dụng nhiều hơn cả vì nó đơn giản hơn, phân

bố đều trên genome

Các thông tin về đa allen của một locus cũng như trên nhiều locus cùng một lúc có thể được phân tích một cách đơn giản và nó có thể đủ lớn cho các phương pháp thống kê để đưa ra nhiều thông tin bổ ích về cấu trúc quần thể, hệ phả, khoa học hình sự

Microsatellite có tính đa hình rất cao (chiều dài) là những allen đồng trội nó có các tính chất cần thiết cho một marker

Tần số đột biến lớn, nó tuân theo định luật menden, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể có thể xác định được bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ

IV PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MICROSATELLITES (SSRs)

Để tìm và xác định Microsatellites ta có một số các thủ tục xác định như sau: 1.Cắt nhỏ ADN genome bằng các enzym giới hạn

2.Phân tách các đoạn ADN bằng điện di trên gen thạch agarose 1%, phân tách các đoạn từ 300- 500bp

3 Chuyển lên màng lai (nylon membral) theo nguyên tắc southernblot

4 Dùng các mẫu dò là các đoạn ADN đã được đánh dấu cho lai ghép với màng lai, các mẫu dò là các trình tự ADN tương ứng với trình tự

Microsatellite mà chúng ta quan tâm

5 So sánh và khôi phục các vạch AND tương ứng với Microsatellite mà chúng ta quan tâm

6 Chuyển vào một vector sequencing

7 Sequencing và xác định SSR cũng như trình tự ADN nằm ngoài trình

tự SSR, đây là vùng để thiết kế mồi

8 Tổng hợp mồi và kiểm tra sự đa hình của Microsatellite kích thước của các alen chỉ khác nhau từ hai nucleotide trở lên mặt khác trong quá trình tổng hợp PCR, polymeraza có thể tạo thêm hoặc có thể bỏ sót một đơn vị lặp lại một nucleotide A nữa Do vậy để xác định kích thước các alen đòi hỏi quá trình điện di phải dùng gel có độ phân tách cao

Tạo Microsatellites mồi:

-Nếu biết được vị trí cụ thể của bộ gen, ví dụ như trong một exon của một gen, mồi có thể được thiết kế bằng tay

-Mồi SSR ngẫu nhiên có thể được phát triển bởi các phân đoạn nhân bản ngẫu nhiên của DNA từ các loài đầu mồi

-Các phân đoạn này ngẫu nhiên được đưa vào một plasmid hoặc vi khuẩn vector ,sau đó được cấy vào vi khuẩn ecoli

VI NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA MICROSATELLI

Trong chuẩn đoán bệnh:

- Vì ADN Microsatellite thay đổi về chiều dài trong sự phát triển của một

số bệnh ung thư, chúng là những marker rất hữu ích trong việc dò tìm, phát hiện ung thư sớm Bởi vì tính đa hình của chúng hữu ích trong sự nghiên cứu các liên kết để định vị những Gen chiụ trách nhiệm về nhiều sự mất trật

tự di truyền học

Nghiên cứu quần thể :

- ADN Microsatellite có thể được sử dụng để phát hiện ra thay đổi đột ngột trong quần thể, hiệu ứng của sự phân đoạn quần thể và sự tương tác của những quần thể khác nhau Microsatellite hữu ích trong sự nhận ra của những quần thể phôi thai và quần thể mới

VIII ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP

1 Ưu điểm

-Thuận lợi to lớn của sự phân tích microsatellite là phương pháp này biểu

hiện số lượng lớn sự đa hình Một locus ở đậu nành (Glycine max) được báocáo là có 26 alen Hơn nữa, khá năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữ

dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gen, xác định cây trồng và phân tích mốiquan hệ cha con

-Microsatellite là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được

xác định Tính đồng trội của microsatllite sẽ gia tăng sự hiệu quả và

độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên những marker này so với những marker khác, như AFLP và RAPD Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gen trở nên dễ dàng hơn

-Khi các primer SSR đã được xác định, việc sàng lọc các vật liệu sử dụng

kỹ thuật này hoàn toàn không đắt tiền Hơn nữa, sự khuếch đại SSR giữa các loài nghĩa là sự xác định những primer SSR thích hợp không cần thiết trong những loài có quan hệ gần

Ví dụ, ba bộ primer microsatellite đã được thiết kế ở

Malus domestica (Rosaceae), các microsatellite này cung cấp 35 loci, trong số

đó có những primer có thể khuếch đại các loài Malus khác 2.Hạn chế

Hạn chế của phương pháp microsatellite là không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau, điều này

là do microsatellite có tỉ lệ đột biến quá cao dẫn đến 2 trở ngại

Thứ nhất: Trình tự vùng flanking ở 2 bên vùng microsatellite thường khác nhau giữa các loài do đột biến, vì vậy khó có thể áp dụng primer

microsatellite của loài này cho loài khác

Thứ hai,: Do tỉ lệ đột biến cao nên khi 2 loài có cùng kết quả phân

tích với 1 trình tự microsatellite, ví dụ như AC19, chúng ta cũng không thể kết luận rằng 2 loài đó có cùng nguồn gốc tổ tiên ban đầu, vì có thể 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC18 rồi đột biến thành AC19, còn 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC20 rồi đột biến thành AC19 40

IX.TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phạm Văn Duệ, 2005 Giáo trình kỹ thuật trồng cây ăn quả Nhà xuất bản Hà

Nội Trang 105 –

XEM THÊM TẠI: http://congnghesinhhoc24h.com/tai-lieu/phat-hien-

marker-microsatellite-tu-co-so-du-lieu-trinh-tu-est-459.html#sthash.CyoXH41P.dpuf