báo cáo kỹ thuật di truyển- sản xuất vaccine tái tổ hợp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG *** BÁO CÁO SEMINAR KỸ THUẬT DI TRUYỀN CHỦ ĐỀ: SẢN XUẤT VACCINE TÁI TỔ HỢP Giáo viên bộ môn: TS Trần Thị Dung Nhóm thực hiện: Ngô Trần Đình Khoa 61303589 Phạm Trần Cương Lĩnh 61303612 Lê Thị Cẩm 61303027 1 NỘI DUNG BÁO CÁO I. Giới thiệu chủ đề. II. Khái niệm, phân loại vacine. III. Quy trình sản xuất Vaccine tái tổ hợp (minh họa bằng quy trình sản xuất Vaccine phòng cúm A H5N1 cho người). IV. Ứng dụng thực tiễn của sản xuất Vaccine tái tổ hợp trong phòng ngừa và điều trị bệnh ở người. V. Kết luận. 2 I.GIỚI THIỆU CHỦ ĐỀ: Ngay từ khi xuất hiện sự sống, trong sự đấu tranh của các loài sinh vật thì bệnh tật đã xuất hiện. Đặc biệt là sự ký sinh của các loài vi sinh vật tới các động vật bậc cao đã gây ra những bệnh tật hiểm nghèo tạo ra những nạn dịch thảm khốc và cướp đi nhiều sinh mạng. Vào năm 1684 Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723) phát minh ra kính hiển vi và nhìn thấy vi khuẩn đầu tiên. Hơn 100 năm sau Edward Jenner là người đầu tiên nghiên cứu ra phương pháp chủng đậu để phòng ngừa bệnh đậu mùa. Trong giai đoạn từ 1857 đến 1885 Louis Pasteur trở thành “Ông tổ” của ngành Vi sinh vật và cũng là người đầu tiên chế tạo ra vaccine phòng bệnh than và bệnh dại. Sang nửa thế kỷ 20, mặc dù công nghệ vaccine có những bước tiến vượt bậc và đạt nhiều thành tích đáng kể, nhưng cũng đã nảy sinh nhiều thách thức, nhiều bệnh dịch nguy hiểm tái phát và mới xuất hiện. Đến nay, cùng với những tiến bộ về công nghệ DNA tái tổ hợp, về Genomics, về Virus học và miễn dịch học phân tử đã có tác động to lớn, mở hướng ứng dụng trong quá trình sản xuất Vaccine thế hệ mới. Rất nhiều chiến lược thiết kế Vacine đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong quá trình phòng chữa bệnh truyền nhiễm. Trong số đó, Vaccine thiết kế dựa trên vector virus tái tổ hợp (Recombinant virus- Based vectoral vaccine) được xem là có hiệu quả nổi bật, có vai trò quan trọng trong việc phát triển Vaccine thế hệ mới. II.KHÁI NIỆM VACCINE, VACCINE TÁI TỔ HỢP: 1.Vaccine là gì ? Vaccine là chế phẩm có tính kháng nguyên dùng để tạo miễn dịch đặc hiệu chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một (số) tác nhân gây bệnh cụ thể. Các nghiên cứu mới còn mở ra hướng dùng Vaccine để điều trị một số bệnh (Vaccine liệu pháp, một hướng trong các miễn dịch liệu pháp). Thuật ngữ Vaccine xuất phát từ vaccinia, loại virus gây bệnh đậu bò nhưng khi đem chủng cho người lại giúp ngừa được bệnh đậu mùa (tiếng Latinh vacca nghĩa là "con bò cái"). Việc dùng vắc-xin để phòng bệnh gọi chung là chủng ngừa hay tiêm phòng hoặc tiêm chủng, mặc dù vắc-xin không những được cấy (chủng), tiêm mà còn có thể được đưa vào cơ thể qua đường miệng. 2.Tái tổ hợp là gì ? Khi các gen liên kết không hoàn toàn, xuất hiện các dạng giao tử mới không giống cha mẹ do có sự sắp xếp lai các gen. Hiện tượng này gọi là tái tổ hợp (recombination) và các dạng mới xuất hiện gọi là dạng tái tổ hợp (recombinant). Để đánh giá mức độ liên kết, dùng khái niệm tần số tái tổ hợp. % tái tổ hợp = Số cá thể tái tổ hợp / tổng số cá thể x 100% ( giống công thức tính hoán vị gene ) 3 Các công đoạn chính tạo DNA tái tổ hợp 1.Chọn nguyên liệu DNA được chọn làm phương tiện vận chuyển gen (vector) thường là DNA plasmid và DNA phage. Chúng được thu nhận chủ yếu từ tế bào vi sinh vật, được tách và làm sạch theo phương pháp chiết tách DNA plasmid, DNA virus. DNA chứa gen cần nghiên cứu (DNA lạ) cũng được thu nhận từ tế bào sinh vật được chiết tách và làm sạch và kiểm tra theo phương pháp chiết tách DNA. Ngoài ra, người ta còn sử dụng DNA tổng hợp bằng phương pháp hóa học hoặc tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme sao chép ngược theo cơ chế nuclease S1 hoặc kỹ thuật Gubler-Hoffman. Các enzyme để cắt, nối các đoạn DNA lại với nhau như enzyme ristriction, enzyme ligase cùng với sự hợp tác của một số enzyme khác như kinase và alkanline phosphotase, 2.Công đoạn cắt với sự tham gia của enzyme RE kiểu II RE (Restriction Endonuclease) kiểu II: là những enzyme cắt hạn chế ở những vị trí xác định và được dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp bởi vì chúng có một số ưu điểm: Hầu như chỉ có một kiểu hoạt tính cắt, enzyme khác đảm nhiệm việc cải biên. Mỗi một enzyme cắt ở vị trí phù hợp định trước ngay ở bên trong hay cạnh trình tự nhận biết. Chúng chỉ cần ion Mg 2+ và không cần năng lượng ATP. 4 RE kiểu II - Các enzyme này gặp chuỗi đích của nó trên phân tử DNA và cắt DNA thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu dính. Hiệu quả cắt của enzyme giới hạn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như hàm lượng của enzyme, nhiệt độ, ion kim loại, môi trường đệm, pH và độ tinh khiết của DNA. 3.Công đoạn nối với sự có mặt của DNA ligase Bước tiếp theo của kĩ thuật di truyền là nối các đoạn DNA vào vector chuyển gen để tạo plasmid có mang DNA lạ. Phản ứng nối được thực hiện nhờ enzyme DNA ligase. DNA ligase là một enzyme xúc tác các phản ứng nối hai mảnh DNA bằng cách tạo cầu nối phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của hai nucleotide đứng cạnh nhau (Hình 6-2). Trong sinh học phân tử, người ta coi DNA ligase như một chất keo phân tử để kết dính các mẫu DNA lại với nhau. Nối đầu bằng được xảy ra khi hai đoạn DNA đầu bằng đứng cạnh nhau. Dưới tác dụng của enzyme ligase, liên kết phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) được hình thành và hai nucleotide được nối lại với nhau. Khả năng nối hai đoạn DNA đầu bằng rất thấp. Để tăng hiệu suất phản ứng, thường người ta phải tăng nồng độ của các đoạn DNA. Nối đầu lệch: Đầu tiên, hai mảnh DNA đầu lệch do có những bazơ bổ sung nên chúng tiến gần lại nhau để tạo liên kết hydro giữa các bazơ nitơ bổ sung. Sau đó, hai nucleotide của hai đầu nối tạo liên kết este giữa OH(3’) và P(5’) dưới tác dụng của enzyme DNA ligase. 5 DNA và các phản ứng nối 3.Vaccine tái tổ hợp Đây là loại nucleic acid vaccine, dựa trên nguyên lý một gen mã hóa cho protein kháng nguyên đặc hiệu được tiêm vào vật chủ (tế bào động vật hoặc vi sinh vật) để sản xuất các kháng nguyên này và khởi động một phản ứng miễn dịch. Vaccine tái tổ hợp là các chế phẩm sinh học của vi sinh vật được làm giảm độc lực, không còn khả năng gây bệnh đối với đối tượng nhận vaccine. 6 Khi đưa vaccine vào cơ thể bằng các phương pháp khác nhau, chúng đều có khả năng kích thích cơ thể sinh miễn dịch. Khi cơ thể chịu sự kích thích của kháng nguyên, sẽ cảm ứng sản xuất ra một loại protein mới có chức năng bảo vệ gọi là kháng thể (antibody) Hiện nay, bằng công nghệ DNA tái tổ hợp người ta đã sản xuất được protein vỏ của một số loại virus như virus bệnh lở mồm long móng, bệnh dại và viêm gan B. Tuy nhiên, vaccine được sản xuất theo phương pháp trên có giá thành cao, điều kiện bảo quản và vận chuyển nghiêm ngặt, đồng thời cần có kỹ thuật viên để tiến hành tiêm chủng. III.QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACCINE TÁI TỔ HỢP (MINH HỌA BẰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACCINE PHÒNG CÚM A H5N1 CHO NGƯỜI): Với công nghệ gene hiện đại, người ta cắt đoạn gene tổng hợp trên vi sinh vật gây bệnh, ghép gene này vào vi khuẩn hay tế bào nuôi cấy để tạo protein đặc hiệu cho mầm bệnh, dùng protein này để tiêm chủng tạo miễn dịch đặc hiệu. Dạng vaccine này an toàn ít tác dụng phụ, khả năng miễn dịch cao. Minh họa bằng quy trình sản xuất Vaccine phòng cúm A H5N1 ờ người: Bước 1: Thu nhận mẫu bệnh và thông tin tình hình dịch tễ bệnh cúm: Công đoạn này được tiến hành thường xuyên trong năm bởi các nhân viên y tế, nhân viên giám sát hoặc Trung tâm cúm quốc gia (National Influenza Centres - NICs).Mục đích của công đoạn này để cung cấp dữ liệu cho việc chọn lựa chủng virus ứng cử làm vaccine. Bước 2: Chẩn đoán, phân lập virus và các phân tích sơ bộ: Công đoạn này được thực hiện trong vòng vài giờ đến 3 tuần bởi các nhân viên của NICs và những phòng thí nghiệm cúm quốc gia khác. Trước tiên virus cần được phân lập trong tế bào phôi trứng gà hoặc tế bào MDCK. Sau đó xác định virus thuộc type cúm nào (A B, C, ). Nếu là type cúm A, thì sẽ tiếp tục thực hiện thử nghiệm xác định virus thuộc phân type HA và NA nào của cúm type A. Dựa vào đặc điểm kháng nguyên hoặc sự phân bố theo thời gian và vùng địa lý của virus gây nhiễm, NICs sẽ chọn lựa mẫu virus và gửi đến 1 trong 4 Trung tâm hợp tác với tổ chức Y tế thế giới (WHO Collaborating Centres - WHO CCs) đặt ở Atlanta, London, Melbourne hoặc Tokyo. Đối với virus H5N1 và những virus thuộc cúm type A khác mà có tiềm năng gây đại dịch cúm thì NICs hoặc những phòng thí nhgiệm cúm quốc gia khác còn tiến hành chẩn đoán sơ bộ bằng PCR và giải trình tự. Các kết quả này sau đó cũng được gửi lại cho WHO CCs. Bước 3: Sản xuất kháng huyết thanh chồn sương: Công đoạn này mất 3- 5 tuần được thực hiện bởi WHO CCs ở Atlanta, London, Melbourne, Memphis và Tokyo.Mục đích của công đoạn này là sản xuất kháng thể ở chồn sương nhằm xác định mối tương quan về tính kháng nguyên của virus (antigenic distance) để chọn lựa virus ứng cử làm vaccine. 7 Bước 4: Phân tích đặc điểm di truyền và kháng nguyên: Công đoạn này mất 1-3 tuần và được thực hiện bởi WHO CCs ở Atlanta, London, Melbourne, Memphis và Tokyo. Mỗi năm, WHO CCs xây dựng thường xuyên thử nghiệm HI (haemagglutination inhibition) sử dụng kháng huyết thanh sản xuất ở chồn sương của hơn 5000 chủng virus cúm và sau đó giải trình tự để xác định phân type. Với phân tích này sẽ cho cái nhìn toàn diện về đặc điểm kháng nguyên và di truyền của virus đang gây dịch. Ngoài phân tích đặc điểm di truyền và kháng nguyên của virus, WHO CCs còn hợp tác với FDA (Food and Drug Administration, Mỹ), NIBSC (National Institute of Biological Standards and Control, Anh) và TGA (Therapeutic Goods Adminitration, Úc) tiến hành phân tích các mẫu huyết thanh thu nhận từ người trưởng thành và một vài trẻ em được gây miễn. Mục đích của phân tích này là nhằm xác định tính kháng nguyên của virus gần đây có thay đổi đáng kể so với virus cũ hay không, để xác định xem liệu kháng thể tạo ra do vaccine hiện tại có đủ chống lại virus cúm hiện thời hay không. Nói cách khác, liệu vaccine cũ vẫn còn hiệu lực bảo vệ chống lại virus đang lưu hành ngoài thực địa hay không. Bước 5: Đánh giá và chọn lựa virus ứng cử làm vaccine: Các dữ liệu về đặc điểm kháng nguyên và trình tự gene cho phép dự đoán chủng virus cúm sẽ lưu hoành khoảng 8 tháng trong mùa cúm tới và chọn lựa virus H5N1 triển khai làm vaccine. Ngay khi chủng virus được chọn lựa làm vaccine thì WHO sẽ khuyến cáo trên website của WHO cho nhà sản xuất, các viện nghiên cứu, các phòng thí nghiệm cúm quốc gia…. Bước 6: Sự tái tổ hợp virus cúm bằng kỹ thuật di truyền ngược: Công đoạn này mất khoảng 6 tuần và được thực hiện bởi WHO CC ở Atlanta, và Memphis, và các phòng thí nghiệm của FDA và NIBSC. Bằng kinh nghiệm trong nhiều năm nghiên cứu các nhà khoa học thấy rằng virus cúm A hoang dại phát triển kém trong trứng gà. Để khắc phục trở ngại này, TS Edwin D Kilbourne của trường New York Medical College đã sáng chế ra kỹ thuật tái tổ hợp di truyền ngược nhằm tạo ra chủng virus tái tổ hợp phát triển tốt hơn trong trứng gà. Kỹ thuật này cho phép 6 gene (mã hóa cho các protein NP, PA, PB1, PB2, M, NS) của virus cúm A/Puerto Rico/8/34 (thường gọi là PR8) kết hợp với 2 gene mã hóa cho protein HA và NA (của chủng khuyến cáo làm vaccine) đã được làm giảm độc lực tạo chủng virus mới mang đặc điểm kháng nguyên HA và NA giống với chủng khuyến cáo làm vaccine và có thể phát triển trong trứng nhanh kịp thời cung cấp vaccine khi có dịch xảy ra. Với virus H5N1, bằng công nghệ di truyền ngược, người ta tạo ra chủng virus cúm H5N1 giảm độc lực bằng cách loại bỏ vài acid amin tại vị trí phân cắt HA.Sự tái tổ hợp HA và NA (đã loại bỏ phần gây độc) của virus H5N1 với các gene còn lại của chủng PR8 tạo nên chủng virus giảm độc lực có thể phát triển trong trứng gà. Sau đó, virus được giải trình tự gene, kiểm tra hình thái khuẩn lạc (plaquing), và độ 8 an toàn trong trứng, gà và chồn sương trước khi chủng virus được gửi đến các viện nghiên cứu và nhà sản xuất vaccine. Bước 7: Xác định đặc điểm kháng nguyên và di truyền của chủng tái tổ hợp: Công đoạn này mất khoảng 4 tuần và được tiến hành bởi WHO CCs ở Atlanta, London, Melbourne, Memphis và Tokyo. Virus tái tổ hợp H5N1 được tiêm cho chồn sương để sản xuất kháng huyết thanh nhằm đảm bảo chủng virus tái tổ hợp có cùng đặc tính kháng nguyên HA và NA của chủng hoang dại. WHO CCs và NIBSC cũng giải trình tự gene HA và NA của chủng virus tái tổ hợp để đảm bảo rằng bấy kỳ sự thay đổi nào là không ảnh hưởng đến các acid amin quan trọng đồi với tính kháng nguyên hay gây bệnh. Nếu đặc điểm kháng nguyên và di truyền là không thoã mãn được nhu cầu sẽ phải tiến hành kiểm tra lại và chọn lựa lại virus ứng cử làm vaccine. Bước 8: Đánh giá đặc tính phát triển của virus tái tổ hợp: Công đoạn này mất khoảng 3 tuần và được thực hiện bởi các nhà sản xuất vaccine. Trước khi virus tái tổ hợp được chọn lọc làm vaccine ứng cử, các nhà sản xuất vaccine phải tiến hành kiểm tra đặc tính phát triển của chúng trong tế bào nuôi cấy. Virus ứng cử là vaccine H5N1 phát triển kém hơn virus cúm A ứng cử làm vaccine phòng cúm theo mùa hàng năm. Đây là 1 thách thức lớn cho các nhà sản xuất nếu cần cung cấp lượng vaccine đủ lớn trong 1 thời gian thật ngắn khi có đại dịch xảy ra. Bước 9: Chuẩn bị các hoá chất cho vaccine bất hoạt: Công đoạn này mất khoảng 6 tuần và được tiến hành bởi nhà sản xuất vaccine và các phòng thí nghiệm của FDA, NIBSC và TGA. Các hoá chất dùng cho vaccine H5N1 bất hoạt được tiến hành bởi WHO CC ở Tokyo và các phòng thí nghiệm quốc gia ở FDA, NIBSC và TGA.Các hoá chất này sao đó được chuẩn hoá bởi các phòng thí nghiệm của FDA, NIBSC và TGA. Sau tất cả những công đoạn chuẩn bị trên được hoàn tất, virus tái tổ hợp và các hóa chất đã sẵn có được chuyển đến cho các nhà sản xuất và bắt đầu ngay vào công việc sản xuất vaccine.Tổng cộng thời gian sản xuất vaccine H5N1 cho người là khoảng 28-52 tuần. IV.ỨNG DỤNG Vaccine phòng cúm A H5N1 cho người Bước 1: thu nhận mẫu bệnh và thông tin tình hình dịch tễ bệnh cúm Bước 2: chẩn đoán, phân lập virus và các phân tích sơ bộ Bước 3: sản xuất kháng huyết thanh chồn sương 9 Bước 4: phân tích đặc điểm di truyền và kháng nguyên Bước 5: đánh giá và chọn lựa virus ứng cử làm vaccine Bước 6: tái tổ hợp virus bằng kĩ thuật di truyền ngược Kĩ thuật này cho phép 6 gene – mã hóa cho các protein NP,PA,PB1,PB2,M,NS-của virus cúm A/Puerto Rico/8/34 (thường gọi là PR8) kết hợp với 2 gene mã hóa cho protein HA và NA (của chủng khuyến cáo làm vaccine) đã được giảm độc lực làm chủng virus mới mang đặc điểm kháng nguyên HA và NA giống với chủng khuyến cáo làm vaccine và có thể phát triển trong trứng nhanh kịp thời cung cấp vaccine khi có dịch xãy ra. Minh họa kĩ thật di truyền ngược (cổ điển) Bước 7: xác định đặc điểm kháng nguyên và di truyền của chủng tái tổ hợp Bước 8: đánh giá đặc tính phát triển của virus tái tổ hợp Bước 9: chuẩn bị hóa chất cho vaccine bất hoạt Vacine phòng bệnh viêm gan siêu vi A và viêm gan siêu vi B Để bào chế vaccine viêm gan A, nhóm nghiên cứu đã nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát Macacca mulatta.Trên thế giới hiện nay người ta dùng dòng tế bào được gọi là tế bào thường trực, chi phí rất 10 [...]... http://vietsciences1.free.fr/vietscience/khaocuu/nguyenlandung/chuong22.pdf [5] Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi Kỹ thuật di truyền và ứng dụng NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 2004 [6] Nguyễn Đình Huyên Những điều cơ bản về kỹ thuật di truyền NXB Nông nghiệp, 1999 [7] Lê Đình Lương Nguyên lý kỹ thuật di truyền NXB Khoa học kỹ thuật, 2001 12 ... với số lượng nhiều, an toàn và nhanh chóng Đặc biệt là Vaccine thế hệ mới hay Vaccine tái tổ hợp 11 TÀI LIỆU THAM KHẢO: [1] http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail.php?cateid=4&id=83 [2] http://vietbao.vn/Khoa-hoc/Viet-Nam-san-xuat -vaccine- viem-gan-A-va-viem-gan-B-tai-tohop/20005460/188/ [3] http://daibio.com.vn/cac-ung-dung-trong-y-duoc /vaccine. daibio [4] http://vietsciences1.free.fr/vietscience/khaocuu/nguyenlandung/chuong22.pdf...cao.Việt Nam có đảo khỉ ở Hòn Gai, Quảng Ninh nên sử dụng tế bào thận khỉ giúp hạ giá thành mà hiệu quả lại tốt Còn đối với vaccine viêm gan B tái tổ hợp, các nhà nghiên cứu áp dụng công nghệ gene, gài đặt thành công đoạn ADN mã hoá sinh tổng hợp HBsAg vào vectơ (plasmid) và sau đó chuyển nạp vào tế bào nấm men Pichia pastoris Sau đó, họ nhân tế bào trong nồi lên men, có thể nhân lên... nguồn nguyên liệu Tiếp theo là khâu tách kháng nguyên ra khỏi tế bào nấm men, tinh khiết, bất hoạt, li tâm, lọc để có kháng nguyên tinh khiết sản xuất vaccine V.KẾT LUẬN Ngay từ khi xuất hiện sự sống, trong sự đấu tranh của các loài sinh vật thì bệnh tật đã xuất hiện Đặc biệt là sự ký sinh của các loài vi sinh vật tới các động vật bậc cao đã gây ra những bệnh tật hiểm nghèo tạo ra những nạn dịch thảm . (recombination) và các dạng mới xuất hiện gọi là dạng tái tổ hợp (recombinant). Để đánh giá mức độ liên kết, dùng khái niệm tần số tái tổ hợp. % tái tổ hợp = Số cá thể tái tổ hợp / tổng số cá thể x 100%. Kilbourne của trường New York Medical College đã sáng chế ra kỹ thuật tái tổ hợp di truyền ngược nhằm tạo ra chủng virus tái tổ hợp phát triển tốt hơn trong trứng gà. Kỹ thuật này cho phép 6 gene. được hoàn tất, virus tái tổ hợp và các hóa chất đã sẵn có được chuyển đến cho các nhà sản xuất và bắt đầu ngay vào công việc sản xuất vaccine. Tổng cộng thời gian sản xuất vaccine H5N1 cho người