Tiểu luận kỹ thuât điện di trên gel AGAROSE

Điện di là hiện tượng dịch chuyển của cácvật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường. Sự dịch chuyển này do thành phần lực điện trong lực Lorentz. Điện di hay điện di trên gel (electrophoresis hay gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử DNA, RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point).

Trường: ĐH Nông Lâm Huế

Khoa : Cơ Khí – Công Nghệ

GVHD : Nguyễn Thị Vân Anh

Lớp : BQ 41

Nhóm : 3

Thành viên thực hiện:

1 Nguyễn Ngọc Phải

2 Võ Thị Bích Chi

3 Trần Thị Hiền

4 Trần Thị Liên

5 Chế Thị Nga

1 Điện di là gì?

Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các

vật thể mang điện tích dưới tác động của điện

trường Sự dịch chuyển này do thành phần lực

điện trong lực Lorentz.

Điện di hay điện di trên gel (electrophoresis hay gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân

tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử DNA, RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point)

2.Cách tiến hành điện di trên gel-agarose:

a Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel:

 Dung dịch đệm thường sử dụng trong điện di agarose và polyacrymid là TBE(Tris-Boric

acid-EDTA) và TAE(Tris-Acetic acid-acid-EDTA)

 Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm 1x TBE hòa tan với hàm lượng agarose cần thiết đặt trong lò vi sóng hoặc đun nóng đến khi tan hoàn

toàn,đổ vào khuôn có các lượt cài sẵn để tạo bản

gel với số giếng nạp mẫu cần thiết.

 Khi bản gel đã đông cứng,đặt bản gel vào

buồng điện di,đổ dung dịch đệm ngập bản gel

khoảng 1-2mm

b Nạp mẫu:

Mẫu ADN được tách chiết enzym giới hạn cắt

thành các đoạn có kích thước nhỏ, được trộn đều vào đệm nạp mẫu có thêm chất màu tạo thành

hỗn hợp có màu xanh để kiểm tra kích thước các đoạn AND thường chạy đồng thời cùng với mẫu AND chuẩn.

c Chạy điện li:

Trong điện li thường sử dụng nguồn điện thế

100V, cường độ 100mmA, thời gian chạy điện ly trong khoảng 40 phút đến 1-2 giờ.Tùy theo chiều dài bản gel và mật độ yêu cầu tachf các phân

tử(có thể dựa vào vị trí các vạch màu, khi các

vạch màu chạy được khoảng ¾ chiều dài bản gen

có thể kết thúc điện di).

d Nhuộm bản gen và soi gen:

 Kết thúc điện di, bản gen được lấy ra nhuộm

Ethyldium-bromid hoặc các phương pháp

nhuộm khác.

 Bản gen sau khi nhuộm ETBR được đặt vào

máy có tia soi UV, để quan sát kết quả điện di, vị trí các đoạn điện di theo kích thước khác nhau, quan sát được những vệt sáng màu đỏ cam trên bản gel hoặc đặt bản gel vào các thiết bị chụp

ảnh chuyên dùng để chụp ảnh.Trường hợp

nhuộm bạc hoặc nhuộm SYBR-GREEN có thể xác định kết quả bằng mắt thường

3 Cách đổ gel-agarose

3.1 Chế tác gel agarose:

Dưới đây là phương pháp chế gel agarose điện di DNA:

3.1.1 Cho đủ lượng agarose (Seakem Agarose, Nusieve Agarose ) cần pha vào dung dịch TAE 1× trong một bình tam giác theo bảng dưới đây để có độ phân li nucleic acid thích hợp Để có dung dịch TAE 1× cần cho thêm 19 lần nước khử ion vào dung dịch gốc

TAE 20×.

Nồng độ agarose (%) Độ lớn DNA phân li (kb)

0,3 60 - 5 0,6 20 - 1 0,7 10 - 0,8 0,9 7 - 0,5 1,2 6 - 0,4 1,5 4 - 0,2 2,0 3 - 0,1

3.1.2 Gia nhiệt bằng cách hấp 5 phút

trong nồi hấp cao áp ở 115 °C hoặc bằng

vi sóng.

 Chú ý khi dùng lò vi sóng cần quan sát để tránh trào gel ra ngoài, nên chờ

đến khi gel sôi thì cắt điện, lấy ra (coi

chừng bỏng) lắc đều rồi cho vào làm sôi lần nữa Lặp lại ba lần cho agarose tan

3.1.3 Cho vào chậu bảo ôn ~50 °C cho đến khi dịch gel đạt đến khoảng 50 -60 °C (tay chạm

vào được) thì cho vào gel một lượng dung dịch ethidium bromide để có hàm lượng cuối cùng của chất màu này là 50 μg/ml (Nếu không cho ethidium bromide vào gel lỏng trước khi rót gel vào khuôn thì ngâm bản gel vào dung dịch này sau khi đã điện di).

3.1.4 Rót gel vào khuôn đã được chắn hai đầu bằng băng dán hoặc bằng kẹp, đã cài sẵn lược (comb) và đặt trên mặt phẳng (xác định bằng thủy bình kế,tức ligô).

3.1.5 Chờ cho đến khi gel rắn hoàn toàn thì cẩn thận tháo lược ra khỏi gel.

3.2 Điện di agarose

3.2.1 Tháo bản gel ra khỏi kẹp hoặc băng chắn, đặt

khuôn gel trong chậu điện di ngang, rót dung dịch đệm vào cho ngập gel.

 chú ý đầu có lỗ lược nằm ở phía cathode.

3.2.2 Pha nucleic acid cần điện di với dung dịch màu tải mẫu (điện di) 6× hoặc bằng hợp chất màu tương tự

 Dịch màu có tỷ trọng cao này giúp nucleic acid không

bị xáo động bởi dòng đối lưu của dung dịch nên khi tải vào lỗ răng lược thì nằm gọn trong đó và có màu rõ

ràng.

 Dung dịch màu tải mẫu 6× (dịch nạp mẫu) chứa 30% glycerol, 0,25% bromophenol blue (BPB) và 0,25%

3.2.3 Bằng micropipet hút mẫu DNA nhỏ vào lỗ răng

lược.

3.2.4 Bật điện một chiều để thực hiện điện di Cường độ dòng điện khoảng 50-150 V tùy loại thiết bị điện di.Thời gian điện di thay đổi phụ thuộc vào độ lớn của DNA,

nồng độ agarose của gel và cường độ dòng điện.

Chú ý: lượng DNA có thể điện di trong mỗi lỗ răng lược Chú ý:

nhiều ít tùy kích thước răng lược, nếu quá nhiều sẽ xuất hiện hiện tượng "tailing" (kéo đuôi) khó phân li.

3.3 Kiểm tra băng DNA:

3.3.1 Nếu điện di DNA trong gel có pha sẵn

ethidium bromide thì chiếu tia tử ngoại.

3.3.2 Nếu không cho trước ethidium bromide thì sau khi điện di cần ngâm gel 30 - 60 phút trong dung dịch thuốc nhuộm này ở nồng độ 0,5 μg/ml.

3.3.3 Nếu cần chụp ảnh lưu tư liệu thì có thể dùng máy ảnh pollaroid với ống kính có phin lọc ánh sáng thích hợp với film pollaroid 667, hoặc dùng thiết bị phân tích gel số hóa (gel documentation system).

Chú ý: Đèn tử ngoại (UV) có hai loại bức xạ với bước sóng 254 nm (UV sóng ngắn) và 366 nm

(UV sóng dài) UV sóng ngắn giúp quan sát rõ

DNA nhưng làm tổn hại cấu trúc chất này, cho nên nếu cần thu hồi DNA từ gel thì không nên áp dụng.

4.Ứng dụng:

Phát hiện các ADN trên gel.

Để phát hiện và xác định ADN trong tế bào VSV, TV-ĐV.

Điện li thuốc trị liệu: là phương pháp dùng dòng điện một chiều để di chuyển một số ion thuốc có

tác dụng chữa bệnh cho cơ thể.

Ngoài ra còn được dùng trong việc nghiên cứu

để phát hiện ra một số loại virut gây bệnh: VR

viên gan B, VK lao, phát hiện ra Samolnela trong sản phẩm thủy sản…

CÁM ƠN CÁC BẠN

ĐÃ LẮNG NGHE!!!