Tiểu luận (kỹ thuật di truyền) chuyển gen động vật

0 1.Giới thiệu: Trong cố gắng không ngừng người việc nâng cao sức khoẻ, tiến khoa học đại bao gồm công nghệ gen công nghệ chuyển gen phát liệu pháp gen dựa việc sản xuất protein tái tổ hợp có sữa bị chuyển gen Phương pháp cung cấp nguồn protein an tồn, có giá trị cao khơng thể sản xuất phương pháp khác Chuyển gen việc di chuyển gen từ cấu trúc di truyền ban đầu gọi thể cho (donor) tới cấu trúc di truyền khác có khả dung nạp gen gọi thể nhận (recipient) thông qua vector, phương tiện kỹ thuật hay kích thích nhân tố chuyển gen nhân tố sinh học, lí-sinh, hố- sinh, cách tự vận động gen Đây kỹ thuật phức tạp hứa hẹn mang lại lợi ích to lớn kỹ thuật di truyền Động vật chuyển gen vật mang gen lạ (khác loài gen tái tổ hợp) mà gen đưa vào hệ gen có chủ ý can thiệp người Gen chuyển phải di truyền theo mơ hình Menden cho phép tạo đàn gia súc theo phương pháp lai tạo truyền thống Sử dụng động vật biến đổi gen có hàng loạt ưu điểm, là: chúng có khả sinh sản để tạo hệ động vật chuyển gen tiếp theo; khả sản xuất linh động, sản lượng chúng phụ thuộc vào số lượng vật sản xuất; chúng có khả tự trì nguồn nguyên liệu lượng cho thân chúng; hầu hết sản phẩm thuốc chế tạo từ vật nuôi, sản phẩm tạo tiện lợi dạng sữa Ở động vật, nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc nâng cao suất nuôi trồng, tạo hệ động vật mới, có thêm số tính trạng chống chịu bệnh tật, cho suất cao hơn, nhiều trứng hơn, tỷ lệ nạc cao Hơn nữa, động vật chuyển gen cịn có khả sản xuất loại protein quý mà người cần trị liệu Kể từ năm 1970, nhà khoa học chuyển gen lạ vào vi khuẩn bắt biểu gen Tuy nhiên, protein phục vụ cho nhu cầu người ngày đòi hỏi phức tạp thể vi khuẩn không biểu cần đến động vật chuyển gen Sản phẩm thành công người sản xuất sản phẩm sinh học thông qua chuyển gen Insulin Hoc môn sinh trưởng vào vi khuẩn E.coli (1982 1987) Năm 1998 có khoảng 1% dược phẩm protein tổng hợp tái tổ hợp trị giá tới 12 tỷ USD Người ta dự tính cần 600 bị chuyển gen cung cấp đủ nhu cầu giới dược phẩm loại protein (ví dụ human serum albumin cho điều trị bỏng) Động vật chuyển gen nghiên cứu nhằm mục đích Nghiên cứu gen gây bệnh gen gây loạn dưỡng tim, ung thư, tự miễn dịch, hồng cầu lưỡi liềm Dùng phương pháp chuyển gen để tạo động vật thí nghiệm mà bị loại bỏ khố gen để xác định chức gen Tạo loại protein, hóc mơn, yếu tố sinh trưởng dùng trị liệu Thay đổi cấu trúc giải phẫu, sinh lý quan, nội tạng ( đưa số gen mới, loại bỏ số gen) nhằm phục vụ mục đích cấy ghép nội tạng Ở Việt nam, việc tạo động vật chuyển gen vấn đề mẻ Việc nghiên cứu bắt đầu vài năm gần thực đối tượng cá, cá vàng cá chạch cá có kích thước nhỏ, thời gian sinh trưởng thành thục ngắn, thuận tiện cho công tác nghiên cứu phịng thí nghiệm Thành cơng nghiên cứu mang lại hiệu kinh tế lớn cho sản xuất mở rộng cho nghiên cứu đối tượng động vật bậc cao mà khẳng định tiến vượt bậc ngành khoa học công nghệ nước ta Các nguyên lý sinh học trình chuyển gen 2.1 Mục tiêu, yêu cầu Mục tiêu kỹ thuật chuyển gen phải đưa đoạn gen vào hệ gen nhân tế bào nhận, có khả biểu di truyền ổn định… Để đạt điều đó, phải làm thoả mãn đạt mục tiêu, yêu cầu sau:  Gen chuyển phải xâm nhập vào tế bào sinh vật chuyển gen Do tế bào thể nhận có xu hướng tự chọn lọc ngăn cản xâm nhập yếu tố lạ, phải có số biện pháp sinh lý, sinh hoá cưỡng để đưa thành phần lạ vào tế bào làm tăng hiệu suất chuyển gen  Tế bào thể nhận phải tiếp nhận gen lạ vào hệ gen nhân Không phải tất tế bào thể tiếp nhận thành phần lạ, thể không giống phản ứng khác với xâm nhập gen lạ Thậm chí, mơ khác thể hay tế bào khác mơ có khả tiếp nhận biến nạp cách khác  Gen chuyển phải biểu sau tiếp nhận vào hệ gen nhân Vấn đề quan trọng sau đoạn gen đưa vào tế bào tế bào chấp nhận vấn đề gen có khả biểu không biểu lại vấn đề khác Có khoảng 1% tế bào phơi chuyển gen có chứa gen cần chuyển tế bào phôi phát triển bình thường Khi gen chuyển vào tế bào phơi thụ tinh, tính chất ngẫu nhiên nên đoạn gen  chèn vào gen cấu trúc gây lên tượng gián đoạn chức bình thường thể đẫn đến tượng khiếm khuyết, phát triển kém, ung thư, viêm khớp hàng loạt loại bệnh khác Tế bào chứa gen biến nạp phải có khả tái sinh (ở thực vật) có khả chuyển lại cho đời sau Đây sở cho việc trì thể chuyển gen để chọn lọc, tăng số lượng thể chuyển gen 2.1 Biểu sản phẩm chuyển gen Sử dụng động vật chuyển gen nhà máy dược phẩm lựa chọn mang lại lợi nhuận cao thay cho việc nuôi cấy tế bào Đối với số protein phức tạp (có chứa phân tử đường, cấu trúc bậc 2, bậc 3…) biện pháp tối ưu Những động vật trở thành phương tiện sản xuất có nhiều lợi ích dễ dàng trì, tái sản xuất sinh sản, suất thay đổi linh hoạt qua số lượng vật nuôi, giá thành thấp đặc biệt, sản phẩm biểu qua sữa dạng dễ sử dụng tiện lợi Thực tế có nhiều cách để thu sản phẩm chuyển gen thể thu hoạch từ máu, từ nước tiểu từ sữa Hemoglobin từ lợn chuyển gen loại protein tạo thu hoạch từ máu với hy vọng tìm nguồn thay máu người Một số loại protein thu lại từ nước tiểu động vật chuyển gen họ cho rằng, có số lợi tạo động vật chuyển gen sản xuất protein qua nước tiểu khong cần đợi đến động vật sinh sản, sản xuất liên tục, không theo chu kỳ… Tuy nhiên, bàng quang, thận quan sản xuất lượng lớn liên tục protein việc sản xuất thuốc (protein) qua đường cần tiếp tục nghiên cứu Một đường chủ yếu công ty dược phẩm nghiên cứu tập trung vào sản suất protein qua sữa Vậy, làm để chuyển gen vào thể protein gen tổng hợp trình tạo sữa tiết theo đường sữa Như biết, để gen hoạt động cần phải có gen huy, gen khởi động, gen điều hoà, gen cấu trúc Muốn protein tổng hợp q trình tạo sữa gen cấu trúc cần phải đưa vào promotor điều khiển hoạt động mã hoá protein tuyến sữa hoạt động q trình tạo sữa Vì vậy, gen có mơ bào hoạt động tuyến sữa tiết vào sữa Các gen, promoter gen k-casein blactoglobunin promoter đích cần chèn vào Sản xuất protein qua tuyến sữa có nhiều lợi thế, bao gồm: -Tuyến sữa động vật có vú quan sản xuất sinh học thích nghi với việc sản xuất protein tiết sữa; -Nhiều protein sản xuất tuyến sữa động vật có vú; -Sự biểu gen tuyến sữa động vật có vú xác thời gian;Sản lượng sữa tiết động vật có vú lớn 3 Các bước tạo động vật chuyển gen Thông qua chuyển gen, ADN cho loại protein hay dược phẩm chuyển vào động vật để sản xuất số lượng lớn dược phẩm đó, bao gồm: 3.1 Xác định, đánh giá phân lập gen mong muốn Để bắt đầu chuyển gen, phải xác định gen cần chuyển, đặc tính mong muốn gen điều khiển tính trạng gen nào, nằm đâu hệ gen vật cho Ví dụ, với mục đích sản xuất protein hemoglobin người vào lợn, người ta phải xác định tính trạng cần chuyển protein hemoglobin người, tiếp theo, người ta phải xác định gen tổng hợp lên hemoglobin gen nào, trình tự gen sau phải phân lập gen Mục đích tìm gen cấu trúc tính trạng mong muốn Để gen hoạt động cần phải có gen huy, gen khởi động, gen điều hồ, gen cấu trúc Vùng điều hồ có chiều dài khoảng 100 bp kết hợp với nhân tố điều hoà cis- trans- để tham gia vào trình phiên mã, để khởi động kết thúc trình phiên mã gen Để tìm gen cấu trúc người ta từ nhiều hướng khác từ ADN nhân, sản phẩm biểu từ ARN thơng tin (mARN) từ protein Khi tìm gen cấu trúc cần thiết rồi, người ta cần phân phân lập gen cấu trúc kết hợp với promotor xác định để tạo tổ hợp gen cấu trúc promotor Đoạn gen cấu trúc tổ hợp phân lập trực tiếp từ ADN hệ gen, bao gồm vùng intron vùng exon kích thước dài Gen cần chuyển tổng hợp từ mARN để tạo cADN Kích thước đoạn cADN ngắn nhiều so với kích thước đoạn gen phân lập tử ADN hệ gen, mARN có đoạn mang mã (exon) Tuy nhiên, theo kinh nghiệm nhiều tác giả hiệu chuyển gen từ ADN hệ gen cao nhiều so với chuyển gen từcDNA Hình So sánh loại ADN đích sử dụng chuyển gen vào phôi non 3.2 Thiết kế biểu gen vào vật mang 3.2.1 Các loại vật mang(nhân tố chuyển gen) Vật mang yếu tố cần thiết cho việc đưa gen muốn chuyển từ thể cho sang thể nhận Tuỳ theo cấu trúc gen cần chuyển mà yêu cầu loại vật mang khác Vật mang chủ yếu vector sinh học, đoạn phân tử acid nucleic thường có dạng vịng, mang nhiều đặc tính có khả xâm nhập vào tế bào vật chủ mượn máy tế bào vật chủ để tạo nhiều giống hệt ban đầu Các loại vector dùng kỹ thuật chuyển gen là: Plasmid( nhóm plasmid tự nhiên, plasmid nhân tạo ), phage, cosmide, virus eukaryote (SV40, adenovirus, retrovirus, herpes virus ), nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men động vật có vú Các đặc tính cần thiết vector: - Có khả chép tích cực độc lập tế bào vật chủ; - Vector phải có kích thước nhỏ tốt để thu nhận ADN ngoại lai có kích thước tối đa; - Vector phải cho phép phát dễ dàng so với tế bào không mang vector (thường kháng kháng sinh sản sinh enzyme b-gallactosidase); - Vector phải có khả tồn tế bào chủ nhiều hệ; - Vector phải có vị trí nhận biết (tồn vị trí cho enzyme giới hạn, nhiều loại enzyme tốt) 3.2.2 Chuyển gen vào vật mang Sau tạo tổ hợp gen biểu hiện, chèn tổ hợp vào vector thích hợp plasmid phage để tạo dòng tế bào vi khuẩn Sự chuyển nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn kiểm tra cách ni cấy vi khuẩn môi trường chọn lọc sử dụng kháng sinh tương ứng với gen kháng kháng sinh có plasmid Số lượng tổ hợp gen chuyển plasmid khuếch đại lên theo phân chia tế bào vi khuẩn Hàng triệu plasmid tách khỏi vi khuẩn đoạn gen mong muốn dược cắt khỏi plasmid enzyme giới hạn Sau cắt khỏi plasmid, tổ hợp gen biểu thu lại cách gel sau điện di Tổ hợp plasmid mang gen chuyển biến nạp vào tế bào eukaryote nuôi cấy để đánh giá biểu gen Đoạn gen ngoại lai sau tinh từ gel agarose hoà tan đèm chuyên dùng cho vi tiêm (đệm TRIS-EDTA) Dung dịch ADN dùng cho vi tiêm có nồng độ từ l-5 mg/ml 3.3 Thu nhận tế bào nhận Ở động vật có vú giai đoạn biến nạp gen thích hợp trứng giai đoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân tinh trùng trứng chưa dung hợp với Ở giai đoạn tổ hợp gen lạ có hội xâm nhập vào hệ gen động vật nhờ tái tổ hợp ADN tinh trùng trứng Do tế bào phôi chưa phân chia phân hóa nên tổ hợp gen lạ biến nạp vào giai đoạn có mặt tất tế bào kể tế bào sinh sản động vật trưởng thành sau Đối với động vật có vú, trứng chín thu nhận phương pháp sử dụng kích dục tố để gây siêu nỗn theo chương trình xây dựng cho lồi phương pháp ni cấy trứng ống nghiệm (in-vitro) Sau thụ tinh nhân tạo để tạo trứng tiền nhân 3.4 Chuyển vật mang vào tế bào nhận Tổ hợp gen ngoại lai chuyển vào tế bào nhận theo nhiều cách khác như, phương pháp bao gồm: Vi tiêm (microinjection), phương pháp sử dụng thiết bị vi thao tác cực nhạy với vi kim thực kính hiển vi để tiêm đoạn ADN dịch tiêm vào phôi non động vật Chuyển gen sử dụng tế bào gốc(stem cell) Các tế bào phôi giai đoạn 16-32 tế bào tế bào đa (totipotent) nghĩa phân hóa thành loại mơ Người ta tiến hành nuôi cấy biến nạp gen vào tế bào cách nhiễm với vector virus Sau chọn tế bào biến nạp gen lạ người ta đưa vào phôi khác giai đoạn phôi nang để tạo động vật chuyển gen thể khảm Tỉ lệ phôi sống sót sau thao tác cao (80%), số 90% biểu tính trạng Tiếp theo, người ta lai tạo qua đời để thu động vật đồng hợp tử tính trạng mà ta chuyển vào Chuyển gen súng bắn gen (gene gun), biện pháp chuyển gen xuất cuối năm 1980 Biện pháp sử dụng hạt bụi volfram bụi vàng trộn lẫn ADN (tổ hợp gen cần chuyển) bắn vào khối mô, tổ chức cần nhận nhờ áp lực khí helium (3500 psi) Đây biện pháp chuyển gen có nhiều ưu điểm hiệu quả, Việt nam có số quan nghiên cứu áp dụng kỹ thuật Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Công nghệ sinh học kỹ thuật chủ yếu tiến hành mô thực vật Phương pháp xung điện (electroporation) Phương pháp tạo cho màng sinh học dễ thấm dễ dung hợp nhờ kích thích điện trường, Một yếu tố khác là, xung điện tạo lỗ thủng nhỏ bề mặt màng tế bào, nhờ nhiều loại plasmid chuyển qua Phương pháp có hiệu cao, phù hợp cho việc biến nạp với số lượng lớn tế bào Tuy nhiên tỷ lệ tế bào chết nhieù một loại tế bào cần địi hỏi biện pháp tiền xử lý thích hợp Qua trung gian virus(virus mediated), biện pháp chuyển gen đặc hiệu để chuyển gen vào đối tượng nhận Nguyên lý phương pháp đơn giản Khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, virus thường chuyển đoạn gen cỉa vào tế bào chủ bắt tế bào chủ phải tổng hợp nguyên vật liệu cho Phương pháp mở triển vọng thách thức khoa học để điều khiển lợi dụng đặc điểm có lợi để sửa chữa khuyết tật di truyền liệu pháp gen Chuyển gen sử dụng trung gian virus (retrovirus- loại virus khơng gây bệnh) có lợi không làm thay đổi hoạt động gen cũ thể gây nên mối nghi ngại việc tạo virus mới, lan truyền thành phần virus để tạo loại virus mạnh hơn, nguy hiểm Chuyển qua trung gian tinh trùng (sperm mediated), phương pháp chuyển gen sử dụng tinh trùng ủ với liposome có chứa ADN plasmide dùng thụ tinh nhân tạo Phương pháp thực thành công thỏ Phương pháp nghiên cứu áp dụng chuyển gen lợn, nhằm tạo nguồn quan, tổ chức phục vụ cho cấy ghép 3.5 Phân tích hiệu việc chuyển gen Để khẳng định động vật có chuyển gen lạ vào hay không người ta phải kiểm tra xem gen lạ có xâm nhập vào máy di truyền động vật có biểu hay khơng Đây cơng việc địi hỏi nhiều thời gian công sức, phương pháp xác định bao gồm: 3.5.1 Phương pháp nhân gen Phương pháp để sàng lọc sơ trước tiên phản ứng nhân gen (PCR ) sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn gen chuyển Phương pháp PCR cho phép nhân nhanh (hàng triệu lần hai giờ) xác đoạn ADN riêng biệt Đây thật phương pháp đại, kinh tế thuận tiện cho việc xác định có mặt gen tế bào với độ xác tương dối cao Sự có mặt băng ADN với kích thước mong muốn điện di sản phẩm PCR chứng tỏ có mặt gen ngoại lai hệ gen vật chủ Tuy nhiên, phương pháp có độ nhạy cao, kết bị nhiễu PCR nhân đoạn gen khơng phân biệt ADN ngồi nhiễm sắc thể hay khơng bị lây nhiễm ADN q trình thao tác Do tính phức tạp hệ gen vật chủ, cặp mồi bắt cặp với đoạn không đặc hiệu hệ gen vật chủ tạo nên kết dương tính khơng xác Để nâng cao tính xác việc xác định hội nhập gen ngoại lai, người ta sử dụng phương pháp Southern blot Đây phương pháp tốn phương pháp hữu hiệu để xác định có mặt gen ngoại lai phát số lượng gen hội nhập Trong phần lớn phịng thí nghiệm, người ta sử dụng PCR để sàng lọc sơ hàng trăm chí hàng nghìn cá thể chuyển gen sau sử dụng phương pháp khác để xác nhận lại kết PCR mà cho dương tính 3.5.2 Phương pháp Southern blot Đây phương pháp sử dụng để định vi trình tự đặc biệt ADN hệ gen ADN mẫu cắt loại enzyme giới hạn sau điện di gel (agarose polyacrylamide), mẫu làm biến tính chuyển lên màng lai nitrocellulose, đó, ADN dị có đánh dấu phóng xạ (hoặc khơng phóng xạ) sử dụng để lai ghép Tiếp theo, kết phân tích đánh giá 3.5.3 Phương pháp Dot blot slot blot Hai phương pháp áp dụng để định lượng tương đối loại ADN đặc trưng phương pháp lai phân tử đánh dấu phóng xạ khơng phóng xạ.Tuy gen chuyển hội nhập vào hệ gen vật chủ biểu khơng Các phương pháp cho phép kiểm tra có mặt gen chuyển thể vật chuyển gen, biểu gen bước cuối quan trọng để đánh giá động vật chuyển gen Có hai cách đánh giá biểu gen ngoại lai thể vật chủ phát có mặt mARN có mặt protein gen qui định tổng hợp 3.5.4 Các phương pháp phát mRNA Để xác định gen chuyển có hoạt động khơng, người ta xác nhận biểu gen thơng qua có mặt mARN Northem blot, ARN dot blot (kỹ thuật lai phân tử mà đối tượng mARN), RT-PCR (PCR ngược) Trong phương pháp RT-PCR phương pháp nhạy nhanh Chỉ cần lượng ARN khuôn nhỏ để tổng hợp nên sợi cDNA enzyme phiên mã ngược Sợi cDNA sau khuếch đại lên nhờ PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen ngoại lai 3.5.5 Các phương pháp phát protein Một cách khác để theo dõi hệ sau động vật chuyển gen có gen lạ xuất khơng, tức có tổng hợp protein hay khơng, trường hợp có sẵn kháng thể kháng protein, kỹ thuật lai thấm protein (Westem blotting) sử dụng để phát biểu gen Nội dung phương pháp tóm tắt sau: Điện di protein tổng số gel SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis) để tách protein theo trọng lượng phân tử khác Chuyển protein sang màng lai (nitrocellulose) Lai với kháng thể đơn dịng (monoclonal antibody) có đánh dấu phóng xạ Phản ứng dương tính nói lên protein gen lạ tổng hợp Người ta sử dụng kỹ thuật miễn dịch enzyme (ELISA) kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) để phát protein lạ động vật 3.6 Tạo dòng động vật chuyển gen Động vật chuyển gen sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu để tạo dòng động vật chuyển gen Con vật tạo gọi Fo (foundation animal) có biểu gen chuyển Lai ghép để nhân lên dịng chuyển gen có gen chuyển vị trí (locus) đó) đồng hợp tử Thơng thường, chuyển gen kết ban đầu gen chuyển vào nhiều vị trí hệ gen trạng thái dị hợp tử điều khiển số lượng vị trí kết hợp Các vị trí kết hợp khác có biểu khác nhau, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, có khác biệt đáng kể hệ sau động vật chuyển gen Và hy vọng rằng, di truyền gen tuân theo định luật Menden Chuyển gen kỹ thuật vi tiêm Việc chuyển gen vi tiêm vào phôi non động vật tiến hành nhờ trợ giúp máy móc thiết bị vơ xác chun dụng Trong số biện pháp chuyển gen, nay, vi tiêm biện pháp hiệu việc chuyển gen vào tế bào động vật đặc biệt phôi động vật có vú Trường hợp vi tiêm phơi non để tạo động vật chuyển gen thành công Gordon chuột Tuy nhiên, gen không biểu tổ hợp gen thiết kế cấu trúc tái tổ hợp virus Trường hợp quan sát thấy thay đổi kiểu hình chuột chuyển gen hocmoon sinh trưởng mơ tả năm 1982 nhờ cơng trình Palmiter cộng đến nay, hàng trăm báo liên quan đến việc chuyển gen kỹ thuật vi tiêm xuất hàng năm Kỹ thuật vi tiêm lượng ADN khiết vào phôi non động vật tạo việc kết hợp đoạn gen vào nhiễm sắc thể trứng thụ tinh Nếu nguyên liệu di truyền dung hợp vào nhiễm sắc thể non sinh có copy thông tin di truyền tất tế bào ADN ngoại lai cần phải kết hợp vào gen tế bào chủ trước phân bào lần đầu tiên, không, ta thu vật chuyển gen thể khảm Chính vậy, gen cần phải chuyển vào giai đoạn sớm ví dụ giai đoạn nhân non, lý tưởng vài sau thụ tinh, nhân tinh trùng nhân trứng quan sát kính hiển vi Gen chuyển tiêm vào nhân nào, nhiên, nhiễm sắc thể X Y tiếp nhận gen chuyển cho kiểu hình khác nhau, lựa chọn tiền nhân thích hợp Bình thường nhân đực to gần phía ngồi nhân (hình ) 4.1 Điều kiện để thực vi tiêm Brinster cộng (1985) thông báo thay đổi phương pháp luận chuyển gen thông qua vi tiêm vào phôi chuột kết cuối cần có điều kiện để tăng tần số hoà nhập ADN ngoại lai vào tế bào thể nhận Có vài nhân tố quan trọng nhất, là: · Nồng độ ADN tiêm: Nồng độ ADN tiêm nhân tố hạn chế hiệu hoà nhập Nồng độ tối ưu 1-2 ng/ml, tức khoảng 100-1000 đoạn ADN · Tạo đầu dính (non-blunt end): Một phân tử ADN mạch thẳng tiêm vào hiệu cắt enzym endonuclease tạo hai đầu dính · Vị trí tiêm ADN vào tế bào: Tiêm ADN ngoại lai vào nhân thường cho hiệu cao vào tế bào chất · Kiểu tế bào tiêm: Tiêm ADN lạ vào nhân trứng nhân tinh trùng làm thay đổi kiểu gen kiểu hình hợp tử trứng tinh trùng tạo Một cách khác cho hiệu cao tiêm vào nhân hợp tử Tuy nhiên, cách người ta tiến hành bò cừu hiệu đạt 22% Sau tiến thông báo lĩnh vực nghiên cứu tế bào cuống phôi (ES) nguyên bào tinh, ngun bào nỗn (PGC) Những dịng tế bào cho phép hoà nhập ADN lạ vào hệ gen động vật cách có hiệu cao · Nguồn vật liệu di truyền tạo phôi: Hiệu gắn kết ADN lạ vào genome phơi lai nịi cho hiệu cao vào genome phơi dịng cận huyết 4.2 Quy trình tạo động vật chuyển gen (1) Gen có chức lựa chọn phân lập phịng thí nghiệm (2) Một vật cho gây siêu nỗn thu hoạch phơi từ ống dẫn trứng (3) Gen đưa vào trứng thụ tinh kỹ thuật vi tiêm (4) Phôi chuyển gen đưa vào vật nhận mà cho đời non có gen chuyển (5) Kiểm tra non gen chuyển, lai tạo để tạo non có tính ổn định di truyền tính trạng 4.3 Những thiết bị yêu cầu cho thao tác vi tiêm Gía thết bị cần thiết cho thao tác chuyển gen vi tiêm khoảng 50ngàn-80 ngàn USD bao gồm: 10 · Hệ thống kính hiển vi độ phân giải cao với vật kính Nomarski Hoffman(Kính hiển vi soi ngược) với thị kính 10x-15x vật kính 20x 40x để quan sát nhân non · Tủ ấm CO2, để trì nhiệt độ 37-38oC với nồng độ CO2 5%-6% · cặp vi thao tác Litz tương đương có tác dụng điều khiển kim vi tiêm kim giữ; · Cặp syringe điều khiển lượng dung dịch kim vi tiêm kim giữ · Thiết bị giữ điều khiển syringe, · Các thiết bị chế tạo gia cố kim ống capillary dùng đế chế tạo kim vi tiêm, kim giữ kim nạp ·Dầu parafin, agar hoá chất cần thiết khác · Bàn chống rung, kính hiển vi soi nổi, dụng cụ phẫu thuật vi phẫu thuật, 4.4 Các gen dùng để chuyển vào động vật Cho đến nay, người ta chuyển nhiều gen lạ có nguồn gốc từ người, động vật, thực vật vi sinh vật vào loại động vật chuột, thỏ, cá loại vật ni bị, cừ, dê, lợn , gà, chim chí vào muỗi Động vật Gen chức chúng nhận Cá -Gen sinh trưởng yếu tố sinh trưởng (fGH, hGH, bGH) d-crystallin (gà), b-gallactosidase, kháng hygromycine, protein chống đông lạnh, ÀP, a-globin, neomicine, phosphats-transferase, liciferase Lợn -Các loại gen hóc mơn sinh trưởng yếu tố sinh trưởng (mMT, hGH, mMT-bGH, PRL-bGH, mMT-hGRF, alb-hGRF, mMT-hGF mMT-bGH Chuột hGH, rGH, hGRF, gen mã hoá luciferase Cừu (mMT, hGH, mMT-bGH, PRL-bGH, mMT-hGRF, alb-hGRF, mMThGF ), smt-sGH5, sMT-sGH9 a1-antitripsin (trong điều trị viêm phổi), tạo albumin, yếu tố q trình đơng máu Bị b-GH Ứng dụng chuyển gen thông qua vi tiêm Ngày nay, chuyển gen nói chung vi tiêm ADN nói riêng cách mạng ngành chăn ni giới Mục tiêu chăn ni tăng khả sinh sản, tăng hiệu chăn nuôi, tăng suất sản phẩm tăng khả chống bệnh Do chuyển gen làm thay đổi cấu trúc vật chất di truyền nên tạo bước nhảy vọt vế khả vật nuôi mà tự nhiên khơng có Những thành tựu ứng dụng tạo động vật chuyển gen nhờ vi tiêm sau: 5.1 Tăng cường khả sinh trưởng thay đổi đặc tính thể: 11 Khả sinh trưởng chất lượng sản phẩm động vật cao kiểm soát gen tăng cường sinh trưởng Việc chuyển gen hoocmon sinh trưởng chuột người vào động vật tăng tỉ lệ kích thước thể lên hai lần Lợn chuyển gen tháng tuổi nặng 28% so với lợn không chuyển gen có mức hoocmon sinh trưởng gấp 50 lần dịch mã gen dung hợp MLP 5.2 Tăng sản lượng chất lượng sữa: Machlin(1979) thấy tăng hoocmon sinh trưởng HGH có nguồn gốc ngoại sinh làm tăng 18% sản lượng sữa Nếu bò chuyển gen hoocmon sinh trưởng làm tăng lượng hoocmôn sinh trưởng thể tăng sản lượng sữa mà không gây tác dụng xấu tiêm nhiều hoocmon sinh trưởng 5.3 Tạo biệt dược, mô phủ tạng thay cho người: Người ta tan cừu chuyển gen mà sữacủa chúng có chứa protein lactofein có tác dụng nhưchất kháng sinh Một lồi dê chuyển gen đũng tạo mà máu chứng chứa chất antitrombine loại glycoproteincó chức điều hồ đơng máu.Người ta cho phủ tạng linh trưởng nhóm gần người dùng ghép cho người thực tế khó khăn: Ngày dùng phủ tạng lợn dễtìm có kích thước tương tựnhưcủa người.Tuy nhiên, người ta dùng phủ tạng lợn gặp khó khăn màng tế bào chứng có enzymgalactose (người khơng có) làm trở ngại choviệc ghép Vì thế, nhà khoa học (1998)đã nghiên cứu tạo giống lợn khơng có galactose dochuyển hai ba gen người cho lợn vàbướcđầu giải quyếtđược khó khăn Đối với động vật sản xuất dượcphẩm, yêu cầuđối với vật chuyển gen sản xuất dược phẩm là: Nó có khảnăng sản xuấtđược dược phẩm theo yêu cầu mức độ cao mà khôngảnhhưởngđến sức khoẻ thân chuyển khả sản xuất dược phẩm sang đời sau Bảng Các loại dược phẩm sử dụng gần có nguồn gốc từ động vật chuyển gen Động vật Dược Sử dụng chuyển phẩm/protein 12 gen Máu hệ tuần hoàn Lợn Hemoglobin Năm 1991, lợn chuyển gen tạo từ phôi người ngày tuổi TTCNSH NewJersey Gen chuyển la tạo hemoglobin người, có khả vận chyển oxy bình thường Cừu, Yếu tố chống Điều trị bệnh ưa chảy máu giảm nguy phản ứng Lợn, Bị đơng máu VIII, truyền máu IX Cừu, Bò Fibrinogen Điều trị vết thương Bị Albumin huyết Duy trì thể tích máu chống sốc máu người Dê Chất chống đơng Protein chống đơng máu nhóm III xuất thường máu nhóm III xuyên thể có vai trị đơng máu Cơng ty CNSH Massachusess tạo dê chuyển gen này, hàng năm tạo 500-800 lít sữa, lít chứa 28 g protein Cừu Alpha-1-anti Thiếu hụt dẫn tới hội chứng “Emphysema” Protein tripsin giúp tăng trình vận chuyển qua màng dưỡng khí chất thải Các nhà KH Scottlen tạo cừu biến đổi gen sản xuất >35g alpha-1antitripsin lít sữa=1/5 nhu cầu điều trị cho bệnh nhân/năm Tuy nhiên, vào tháng năm 2003, công ty phải từ bỏ cơng trình chi phí q tốn cho việc tinh chế protein từ sữa cừu Cừu, lợn, Yếu tố hoạt hố Enzyme chống đơng vón sử dụng điều trị số bệnh dê plasminogen tim mạch, ngẽn mạch mơ bào Điều trị phịng chống lây nhiễm Dê Pro542 Điều trị HIV Dê, cừu Yếu tố vận chuyển xuyên màng Bò Alpha-lactabumin Chống nhiễm trùng Bò Colagen I II Sửa chữa mô bào, điều trị thấp khớp Kháng thể Gà Kháng thể, Trứng với hàm lượng dinh dưỡng phù hợp với nhu cầu Protein máu, dinh người dưỡng Chuột Kháng thể người Kháng thể động vật có phản ứng mẫn kháng thể người tổng hợp từ chuột khơng 13 Gà, dê bị, Kháng thể đơn Các loại vaccine tạo vaccine viêm gan B dòng Các loại khác Dê Protein chống Năm 1998, báo cáo cho rằng, sữa dê có chứa loại bệnh số rét protein giống với protein ký sinh trùng số rét, sữa dùng loại vaccine chống bệnh sốt rét Thỏ AlphaChống bệnh Pompe’s, bệnh rối loạn tế bào gan-> glucosidase khơng có khả chuyển hố glycogen –> đái đường Bò Lactoferin loại protein giúp vật non hấp thụ Fe 2+, có tác dụng chống nhiễm khuẩn, chống thiếu máu, chống viêm khớp Dê Acide Glutamic Điều trị tiểu đường nhóm decarboxylase Chuột Hoocmôn sinh trưởng người 5.4 Giá trị thương mại Có khoảng 10-30% số trường hợp cấy chuyển gen chuột thành cơng, đó, có 5% số trường hợp Bị, dê, cừu thành cơng Việc tạo vật chuyển gen giai đoạn đắt (100.000 -200.000 USD năm 1999) hy vọng vài năm nữa, chi phí cho ca chuyển gen khoảng 5000 USD Hiệu động vật chuyển gen đem lại cao, công ty Winscosin dự tính bị chuyển gen vịng đời tạo 200-300 triệu USD trị giá dược phẩm Bảng Giá số sản phẩm thuốc tạo công ty ‘Animal Pharming’ Thuốc Động vật AAT (a-1 antitrypsin, thiếu hụt di truyền dẫn tới hội Cừu chứng emphysema) TPA(tissue Plasminogen activator, điều trị đông máu) Dê Yếu tố VIII ( yếu tố đông máu, điều trị ưa chảy máu Cừu XI) Hemoglobin (máu thay thế) Lợn Lactoferin (chất thay bỏ sung cho trẻ nhỏ) Bị 14 Gía/con/năm 15.000 USD 75.000 USD 37.000 USD 3.000 USD 20.000 USD CFTR (Cystic fibrosis transmenbrane conductant Cừu, chuột, 75.000 USD regulator, điều trị nang xơ dê Human Protein C, chống đông máu, điều trị đông máu Lợn 1.000.000 USD (giá thị trường thời sản xuất động vật) 5.5 Tạo sản phẩm kinh tế khác: Chuyển genlàm tăng hàm lượng systein, làm tăng tốcđộmọc lông, làm tăng tổng hợp collagen làm tăng độ bền da Người ta tạo rađược giống cừu chuyển gen mà tự thay lơng ăn loại thứcăn đạc biệt không cần cắt xén lông Một giống cừu chuyển gen khác có thời gian cho lơng 1/3 so với cừu khôngđược chuyển gen 5.6 Khả ứng dụng Việt Nam Thực phẩm biến đổi gen đóng góp nhiều việc đáp ứng nhu cầu lương thực, thực phẩm cho người Cây biến đổi gen với sốcác tính trạng khả kháng bệnh, chịu hạn, chịu lạnh, kháng chất diệt cỏ, bất thụđực, gạo có tiền chất caroten, cà chua chín chậm với diện tích canh tác dành cho chuyển gen vào khoảng 130.000 km2 tập trung cácnước Mỹ, Trung quốc, Canada, Achentina, Úc nước Ảrập với hầu hết loại trồng (khoảng 60 loại ).Triển vọng động vật chuyển gen khơng có giới hạn Tuy nhiên,đểđạt tới tiềm dường trình lâu dài khó khăn số trường hợp, triển vọng thật rõ ràng ngày có nhiều đầu tư kinh phí chất xám vào lĩnh vực Lĩnh vực phát triển tạo động vật chuyển gen sản xuất thuốc,sản xuất protein quí qua đường tiết sữa Mặc dù cá cứng dụng động vật chuyển gen nơng nghiệp cịn chưa khai thác, song tương lai hứa hẹn mang lại lợi nhuận không nhỏ Mặc dầu thành tựu kỹ thuật chuyển gen to lớn dễ nhận thấy nguy hại từ khơng nhỏ thật khó nắm bắt đề phịng Cũng nhìn lại góc độ tiến hố,việc chuyển gen nhân tạo làm đảo lộn dòng gen tự nhiên, dễ sinh ưu chuyển dòng gen hỗn độn tự nhiên mà người khó kiểm sốt hết Khả trơi dạt dịng gen gây hiểm hoạ môi trường sinh thái Mặt khác động vật chuyển gen nhờ retrovirus – loại virus thường chứa gen gây ung thư, dođó sử dụng retrovirus làm vector nảy sinh nguy lường trước được.Việc chuyển gen vào động vật làm nảy sinh vấn đề pháp luật đạo đức Trong tạo động vật chuyển gen mang lại nhiều lợi nhuận có quan điểm trái ngược, lo sợ tạo động vật chuyển gen đe doạ phá vỡ cân hệ sinh thái động vật chuyển gen có khả sinh sản thấp, lai với động vật tự nhiên làm giảm khả sinh sản, giảm số lượng, đe doạ tồn loài Một số trường hợp động vật chuyển gen có khả kháng bệnh có biểu bệnh lý Thêm vào đó,động vật chuyển gen sử dụng làm thực phẩm không đạt nhiều ủng hộ tuyệt đại cơng chúng Có số quan điểm cho thực phẩm 15 chuyển gen có tác hại người gây dị ứng Người ta lo lắng đến vấn đề sức khoẻ sử dụng loại thực phẩm Trong đó, ứng dụng y học động vật chuyển gen dễ dàng chấp nhận đối mặt với bệnh tật hiểm nghèo người ta lựa chọn giải pháp rủi ro Trong tương lai không xa, nhà khoa học hy vọng làm tăng nhận thức công chúng chấp nhận sản phẩm chuyển gen Ở Việt nam, nghiên cứu áp dụng công nghệ sinh học đặc biệt công nghệ gen phát triển mạnh mẽ năm gần Nghiên cứu chuyển gen thực vật động vật tiến hành nhiều sở nghiên cứu Viện Di truyền nông nghiệp, Viện Công nghệ sinh học,Trung tâm công nghệ sinh học -Đại học quốc gia Hà nội….Ở động vật, nghiên cứu chuyển gen bắt đầu chủ yếu thực hạch với tổ hợp gen hoc môn sinh trưởng vi tiêm Chuyển gen cá có nhiều thuận lợi nhiều so với chuyển gen vào động vật có vú số lượng trứng nhiều, kích thước trứng lớn, khơng cần cấy vào thể mẹ sau vi tiêm, khơng địi hỏi điều kiện chăm sóc nghiêm ngặt Ở động vật có vú, chưa có cơng trình cơng bố thực việc chuyển gen vào động vật có vú Việt nam Tuy nhiên, kỹ thuật liên quan đến việc tạo động vật chuyển gen tiếp cận thực số sở nghiên cứu Ví dụ như, phịng thí nghiệm trang thiết bị máy móc cho phân tích gen, protein; thụ tinh nhân tạo, gây siêu nỗn, thu hoạch phơi, trứng, cắt phơi, cấy truyền phơi, xác định giới tính phôi, lai tạo chọn giống.Hơn nữa, nhiều sở nghiên cứu có kết kinh nghiệm chuyển gen thực vật động vật Động vật chuyển gen trở thành xu hướng nghiên cứu phát triển thay cung cấp thực phẩm đơn Việc nghiên cứu tạo động vật chuyển gen để tạo dược phẩm sản phẩm chúng thực nhiều nước giới Nhu cầu thị trường giới dược phẩm đặc hiệu tạo đường chuyển gen Việc chuyển gen tạo sản phẩm chuyển gen tỷ lệ thành cơng cịn thấp, chi phí cịn cao chi phí giảm nhiều năm gần giảm nhiều năm tới Động vật chuyển gen xu hướng phát triển tất yếu phục vụ nhu cầu ngày tăng người Do vậy, với điều kiện sở vật chất người quan nghiên cứu nước ta, việc kết hợp nghiên cứu để tiến hành chuyển gen vào động vật có vú hồn tồn thực giai đoạn Chi phí cho việc chuyển gen ngày thấp thời gian không xa, với phát triển vũ bão khoa học, cơng nghệ việc chuyển gen vào động vật với hiệu cao; tổ hợp gen cần chuyển chèn xác vào vị trí cần thiết khống chế tác động tiêu cực việc chuyển gen thể tiếp nhận, việc chấp nhận khả ứng dụng rộng rãi kỹ thuật chuyển gen để phục vụ nhu cầu người vô lớn Việc nghiên cứu chuyển gen vào động vật Việt nam yêu cầu hướng cần thiết để không bị lạc hậu khoa học công nghệ so với nước khu vực giới 16 MỘT SỐ THÀNH TỰU CHUYỂN GEN Ở ĐỘNG VẬT: Để phục vụ mục đích nghiên cứu thương mại, nhà khoa học tiến hành biến đổi gen nhằm tạo động vật phát sáng nhân tạo Hãy ngắm nhìn sản phẩm đặc biệt họ Một số cá Medaka biến đổi gen phát sáng bóng tối bơi bể cá Đài Bắc ngày 6/9/2001 Tập đoàn Taikong Đài Loan tạo 17 cá với ý định bắt đầu tiếp thị chúng trước công luận vật nuôi giới có khả phát sáng bóng tối Ảnh: Reuters Một đàn cá biến đổi gen Medaka Tập đoàn Taikong khoe khả phát sáng đặc biệt bể chứa triển lãm Đài Bắc ngày 26/7/2007 Ảnh: Reuters 18 Các cá Archocentrus Nigrofasciatus Var có khả phát sáng nhân tạo Triển lãm thủy sinh quốc tế Đài Loan 2010 Ảnh: Reuters 19 Hình ảnh kết hợp cho thấy chân chó săn nhân vơ tính, tháng tuổi phát quang bóng tối ánh sáng cực tím (trái) ánh sáng bình thường Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc ngày 13/5/2009 Ảnh: Reuters 20 Con chó săn đặc biệt hậu duệ đời đầu "Ruppy" - chó biến đổi gen giới mang gen huỳnh quang Các nhà khoa học lấy protein huỳnh quang cấy vào tế bào chó săn Con chó Ruppy thừa hưởng gen huỳnh quang mẹ chúng có khả phát sáng bóng tối ánh sáng cực tím Ảnh: Reuters 21 Một cá gấu trúc (Convict Cichlids) biến đổi gen phát sáng bể nước buổi họp báo giới thiệu Triển lãm thủy sinh quốc tế Đài Loan 2010 Ảnh: Reuters Ba lợn biến đổi gen phát sáng màu xanh lục Đài Bắc tháng 1/2006 Các nhà khoa học Đài Loan - nơi sản sinh cá phát sáng nhân tạo giới - hy vọng thành công họ tăng cho hoạt động nghiên cứu tế bào gốc vùng lãnh thổ 22 Ánh sáng neon tỏa từ cá ngựa vằn biến đổi gen Triển lãm thủy sinh quốc tế Đài Loan tháng 11/2009 Cá hồi chuyển đổi gen AquAdvantage làm thực phẩm 23 ... kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) để phát protein lạ động vật 3.6 Tạo dòng động vật chuyển gen Động vật chuyển gen sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu để tạo dòng động vật chuyển gen Con vật. .. xạ.Tuy gen chuyển hội nhập vào hệ gen vật chủ biểu khơng Các phương pháp cho phép kiểm tra có mặt gen chuyển thể vật chuyển gen, biểu gen bước cuối quan trọng để đánh giá động vật chuyển gen Có... chuyển gen nhân tố sinh học, lí-sinh, hoá- sinh, cách tự vận động gen Đây kỹ thuật phức tạp hứa hẹn mang lại lợi ích to lớn kỹ thuật di truyền Động vật chuyển gen vật mang gen lạ (khác loài gen