Tổng quan về cảm biến sinh học Biosensor

Tổng quan về cảm biến sinh học Biosensor tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả...

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BIOSENSOR LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA BIOSENSOR

Năm 1956, giáo sư Leland Clark Jnr – người khai sinh về khái niệm điện cực sinh học (Biosensor) đã có công bố về điện cực Oxy Dựa trên kinh nghiệm và tâm huyết của mình, ông đã phát triển lĩnh vực phân tích giúp có thể đo lường được trong cơ thể

Năm 1962, tại Hội nghị Khoa học ở Viện hàn lâm New York, ông đã có bài diễn thuyết: “Làm thế nào để các điện cực điện hóa (phương pháp pH, cực phổ, phép đo điện thế, phép đo độ dẫn điện) thông minh hơn” Trong đó, ông trình bày cách làm điện cực điện hóa thông minh hơn bằng cách thêm enzym vào máy chuyển đổi như những chiếc bánh sandwich được bao bọc bởi một lớp màng

Năm 1975, ý tưởng của Clark trở thành hiện thực với sự công bố của công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) về máy phân tích glucose dựa trên việc đo dòng điện của hydro peroxide Đây là lần đầu tiên các phòng thí nghiệm trên thế giới phân tích dựa trên một Biosensor Cũng vào năm này, Biosensor tiến thêm một bước mới là khi Divis đề xuất rằng vi khuẩn có thể được dùng như một yếu tố sinh học trong điện cực vi khuẩn để

đo hàm lượng rượu

Năm 1976, La Roche (Thụy Sĩ) giới thiệu máy phân tích Lactat (Lactate Analyser – LA640) trong đó sử dụng tác nhân trung gian hexacyanoferrat hòa tan để chuyển các electron từ lactatdehydrogenase tới một điện cực Mặc dù không thành công trên thương trường nhưng là bước đột phá quan trọng cho một thế hệ của Biosensor được ứng dụng trong thể thao và chẩn đoán lâm sàng

Năm 1987, điện cực enzym screen-printed được công bố bởi Medisense (Cambridge, USA) với dụng cụ đo có kích thước như một chiếc bút cho phép giám sát lượng glucose trong máu tại nhà Điện cực này được thiết kế lại làm cho thông dụng hơn

và số lượng bán của Medisense đã đạt tới 175 triệu đôla năm 1996 khi họ được Abbort mua lại Hiện nay Hãng Boehringer, Manheim và Bayer đang cạnh tranh nhau rất gay gắt

về Biosensor và lượng bán ra của ba công ty chiếm ưu thế trên thị trường Biosensor của thế giới tới 85%

Biosensor thực chất là một thiết bị phân tích chuyển một tín hiệu sinh học thành một tín hiệu điện Đầu tiên, Biosensor sẽ nhận dạng hiện tượng và biên dịch thành một đặc tính có thể định lượng được, sau đó đặc tính định lượng này được chuyển đổi thành một tín hiệu điện bởi một bộ biến năng Trong Biosensor, hiện tượng được nhận dạng bởi

một hệ thống sinh học gọi là cơ quan thụ cảm sinh học (bioreceptor) Hệ thống này sẽ tiếp xúc trực tiếp với mẫu phân tích gây ra phản ứng và tạo thành hợp chất nhạy cảm cho Biosensor Cơ quan thụ cảm sinh học có đặc tính chọn lọc đặc biệt đối với chất phân tích

Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo của biosensor

Chú thích: Chất xúc tác sinh học (a) chuyển cơ chất (S) thành sản phẩm (P) Bộ biến năng (b)

chuyển sản phẩm phản ứng thành tín hiệu điện Bộ khuếch đại (c) nhằm khuếch đại tín hiệu điện của bộ biến năng Bộ vi xử lý tín hiệu (d) Màn hình hiển thị (e).

1.3. ĐẶC ĐIỂM – YÊU CẦU CỦA BIOSENSOR

Để định lượng, Biosensor phải đáp ứng yêu cầu liên quan đến đo lường: khả năng lặp lại, khả năng tái sử dụng cao, tính chọn lọc, tính nhạy cảm, vùng trả lời tuyến tính và thời gian đáp ứng tín hiệu tốt

 Các phép đo có độ lặp lại tốt nếu như hai loạt kết quả thu được tương tự nhau được thực hiện bởi cùng người phân tích, sử dụng cùng biosensor trong cùng một mẫu phân tích

 Phương pháp đo có khả năng tái sử dụng cao nếu các kết quả trước có thể đạt được khi tiến hành phân tích lặp lại lần hai

 Tính chọn lọc của biosensor thể hiện ở khả năng nhận ra một hợp chất đơn trong hỗn hợp các cấu tử của mẫu, khả năng này phụ thuộc vào cơ quan thụ cảm sinh học và bộ biến năng Một biosensor có tính chọn lọc cao nếu như thành phần tạp chất của mẫu thấp

 Tính nhạy cảm của biosensor thể hiện ở sự thay đổi về lượng thì sẽ gây ra sự thay đổi về tín hiệu trả lời:

Da = s Dm

Trong đó Da : Độ dao động về biên độ của dòng ra

Dm : Độ dao động về biên độ của dòng vào

s : Độ nhạy cảm của biosensor, đặc trưng cho mức độ phù hợp của biosensor trong một ứng dụng cụ thể

Đối với Biosensor đo bằng điện thế thì biên độ của tín hiệu trả lời tỷ lệ thuận với logarite của nồng độ chất phân tích Theo định luật Nernst: Da = s D(logc)

 Vùng tín hiệu tuyến tính thu được là một đường cong hiệu chỉnh của tín hiệu trả lời với nồng độ khác nhau của chất phân tích Đường cong chỉ thật sự có ý nghĩa nếu tiến hành hiệu chỉnh cả hai loạt nồng độ tăng và giảm Đường cong hiệu chỉnh gọi là tốt nếu như tín hiệu trả lời ổn định theo thời gian

 Thời gian đáp ứng khá dài bởi bản chất của đường cong hiệu chỉnh, nó cho biết một phương pháp đo cho tín hiệu trả lời nhanh hay chậm khi thay đổi nồng độ.1.4. NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA BIOSENSOR

Các chất cần phân tích trong mẫu phân tích sẽ đi vào trong điện cực Màng ngoài (external membrane) của biosensor sẽ cho các chất cần phân tích thấm qua Các thành phần sinh học (enzym, tế bào vi sinh vật, mô, cơ quan) sẽ phản ứng với chất cần phân tích

và tạo ra các đáp ứng mà các bộ biến năng (transducer) có thể phát hiện được Các thành phần sinh học ở đây thực hiện các hoạt động sau:

 Biến đổi các chất cần phân tích thành các chất hóa học khác thông qua các phản ứng sinh hóa (biểu diễn bằng vòng tròn rỗng trong sơ đồ)

 Giải phóng ra các sản phẩm hóa học rồi từ đây tạo ra các tác nhân kích thích

 Thay đổi các đặc tính như quang học, điện học, cơ học

 Tạo ra một số các đáp ứng khác nhau với lượng có thể đo được

Còn có một số màng khác gần bộ phận transducer, những màng này có thể có các đặc tính thấm khác nhau so với màng bên ngoài Tín hiệu ra của điện cực thường phụ thuộc vào loại biến năng mà nó sử dụng

Hình 1.2: Nguyên lý hoạt động chung của một Biosensor:

- Chất cần phân tích

- Tác nhân kích thích (chất tạo ra tín hiệu)

Bảng 1.1: Một số điện cực enzym thường sử dụng

Glucose Glucooxydase và catalase H2O2, O2

Lactose b-galactosidase, glucooxydase H2O2

CHƯƠNG 2 PHÂN LOẠI BIOSENSOR

1.1. ĐIỆN CỰC ĐIỆN HÓA (Electrochemical biosensor)

2.1.1. Điện cực đo điện thế (potentiometric biosensor)

Điện cực đo điện thế hoạt động dựa trên nguyên tắc xác định sự khác nhau về điện thế giữa điện cực đo (probe electrode) và điện cực so sánh (reference electrode) (là điện cực có điện thế không đổi) Sự khác nhau về điện thế giữa hai điện cực là hàm của hoạt

độ các ion trong dung dịch điện phân nơ đặt điện cực (điều kiện hoạt động của điện cực

đo điện thế là không có dòng điện trong mạch đo, vì thế người ta gọi nó là điện cực có dòng điện bằng không) Điện thế này được xác định theo phương trình Nerst:

=

nF

RT E E

Trong đó: Eo: Điện thế oxy hóa-khử tiêu chuẩn;

R: Hằng số khí;

T: Nhiệt độ tuyệt đối;

F: hằng số Faraday;

N: số điện tử trao đổi của cơ chất;

a1, a2: Hoạt độ trong dung dịch và trong lớp màng điện cực

 Điện cực đo (probe electrode):

Điện cực đo là điện cực có tham gia phản ứng điện hóa với một trong các cấu tử của cân bằng điện thế Điện cực đo phải có thế điện cực được thiết lập đủ nhanh và có độ chính xác cao Trong điện cực điện hóa, điện cực đo thường dùng là điện cực màng và điện cực khí

 Điện cực khí :

Điện cực được cấu tạo bởi kim loại trơ như Pt, Au…tiếp xúc đồng thời với khí và dung dịch chứa ion tương ứng với khí này Trên thị trường đã có điện cực khí hydro, điện cực Oxy, điện cực khí clo được sử dụng rộng rãi

 Điện cực màng chọn lọc ion :

Điện cực màng chọn lọc thông thường là các bán pin có lớp màng phân cách dung dịch cần phân tích với một dung dịch chuẩn ở bên trong Nguyên tắc hoạt động của điện cực màng là dựa vào sự xuất hiện của một đại lượng điện thế trên bề mặt của màng phân cách chứ không phải do phản ứng điện hóa kèm theo sự vận chuyển ion Màng có tác dụng thuận nghịch với một ion hay một nhóm ion trong dung dịch một cách chọn lọc Điện cực thủy tinh là điện cực điển hình của loại điện cực màng này Tất cả các loại điện cực màng đều phải đáp ứng các yêu cầu bắt buộc sau đây:

1. Màng phải không được tan trong dung dịch cần phân tích Để đáp ứng được điều này, màng phải được cấu tạo từ những chất có phân tử lượng lớn như thủy tinh silicate hoặc nhựa polymer.

2. Màng chọn lọc phải có độ dẫn điện Độ dẫn điện này thường được tạo ra nhờ vào sự dịch chuyển của các ion hóa trị một bên trong màng.

3. Màng hoặc một vài phần tử chứa trong bộ khung của màng phải có khả năng tác dụng chọn lọc với ion cần khảo sát theo nguyên tắc: trao đổi ion, kết tinh hay tạo phức Hai nguyên tắc đầu phổ biến hơn nguyên tắc thứ ba.

Đây là loại điện cực màng thông dụng nhất Điện cực gồm một ống thủy tinh, ở đầu của ống là một bầu tròn cấu tạo bằng thủy tinh mỏng (0.06-0.10mm) Đây chính là lớp màng thủy tinh có thành phần xác định và có khả năng trao đổi chọn lọc với proton và các cation khác

Điện cực màng thủy tinh đo pH: Phổ biến nhất là thủy tinh chứa 22%Na2O, 6%CaO và 72%SiO2 có khả năng trao đổi chọn lọc ion H+ đến pH xấp xỉ 9 Ở pH cao hơn, lớp màng thủy tinh trở nên kém chọn lọc với H+ vì có thể trao đổi với Na+ cũng như các cation hóa trị I khác Ngày nay người ta đã sử dụng loại thủy tinh trong đo Na+ và

Ca2+ được thay thế bởi Li+ và Ba2+ có khả năng xác định chọn lọc H+ ở pH cao hơn

Phần cuối của điện cực là một bầu thủy tinh có thành mỏng và có thành phần đặc biệt Bên trong bầu thủy tinh chứa dung dịch H+ có nồng độ xác định Nhúng vào dung dịch H+

là dây dẫn Pt hay kim loại Ag phủ AgCl Toàn bộ bộ phận trên được đặt trong ống bảo vệ Khi nhúng điện cực thủy tinh vào dung dịch chứa ion H+, ở hai bề mặt của màng thủy tinh tiếp xúc với H+ có phản ứng trao đổi:

H+dd + Na+dd H+tt + Na+dd

nghĩa là ở hai mặt của lớp thủy tinh sẽ tạo ra hai lớp “gel” H2SiO3 (dày 10-4-10-5 mm) do

sự hiện điện của H+ trong thủy tinh Vì có hiện tượng trao đổi ion xảy ra ở hai mặt của màng thủy tinh nên mỗi lớp gel sẽ xuất hiện một điện thế có giá trị phụ thuộc vào hoạt độ của H+ trong dung dịch và hoạt độ của H+ trong lớp gel Hay nói cách khác, hiệu thế màng

E qua lớp thủy tinh sẽ phụ thuộc vào hoạt độ của H+ bên trong bầu, của H + ở ngoài bầu và hoạt độ H+ ở trong hai lớp gel Với giả sử rằng hiện tượng trao đổi ion xảy ra ở hai mặt thủy tinh gần giống nhau và do cố định hoạt độ H + ở trong bầu thủy tinh nên hiệu thế màng E chỉ phụ thuộc vào hoạt độ của H+ trong dung dịch cần khảo sát

Bằng việc thay thế thành phần của thủy tinh sao cho điện thế màng không phụ thuộc vào giá trị pH, thường sử dụng Al2O3 và B2O3 ta có thể tạo ra các điện cực màng thủy tinh dùng xác định các cation hóa trị I như Na+, K+, NH4 …

 Đầu dò khí:

Đầu dò khí là các thiết bị đo có tính chọn lọc và độ nhạy cao dùng để xác định các khí hòa tan hoặc các ion có thể chuyển thành khí hòa tan khi điều chỉnh pH của môi trường

Bộ phận chính của đầu dò khí là một lớp màng xốp mỏng được lắp vào phần cuối của đầu

dò và có thể được thay thế một cách dễ dàng Tấm màng này được gọi là màng thấm khí, được chế tạo từ các polymer chịu nước như polytetrafluoroethylene hoặc polypropylene với độ xốp khoảng 70% (kích thước lỗ xốp nhỏ hơn 1mm) Lớp màng này sẽ phân tách dung dịch cần phân tích với dung dịch NaHCO3 và NaCl (nếu thiết bị dùng để đo CO2 hòa tan)

 Điện cực chuẩn:

Trong hầu hết các ứng dụng điện hóa, ngoài điện cực đo ta phải sử dụng thêm một điện cực có điện thế xác định và không đổi Điện cực này được gọi là điện cực chuẩn hay điện cực so sánh Điện cực chuẩn phải không tham gia phản ứng với bất kỳ thành phần nào trong dung dịch cần khảo sát, phải thuận nghịch và tuân theo phương trình Nerst, phải có điện thế không đổi theo thời gian và có thể lấy lại giá trị thế ban đầu sau khi có dòng điện nhỏ chạy qua… Điện cực chuẩn thường là điện cực kim loại loại hai (kim loại M phủ một lớp hợp chất ít tan MA của kim loại đó và được nhúng vào trong dung dịch muối có chứa anion A có nồng độ xác định)

Điện cực calomel được tạo thành bởi kim loại Hg tiếp xúc với dung dịch chứa muối

Hg2Cl2 bão hòa và KCl có nồng độ xác định (bão hòa hay 1M)

Hình 2.1: Cấu tạo của một biosensor đo điện thế đơn giản

Chú thích:

a) Màng bán thấm

b) Thành phần sinh học

c) Màng thủy tinh

d) Điện cực thủy tinh đo pH

e) Điện thế giữa điện cực đo và điện cực

so sánhg) Dung dịch HClf) Điện cực đo Ag/AgClh) Điện cực so sánh

Ứng dụng: Điện cực đo điện thế được dùng để xác định glucose với sự cố định enzym

glucooxydase lên điện cực:

D-glucose Glucooxydase D-gluconat + H+

Đo lượng H+ tạo thành (đo pH sau khi giải phóng H+) sẽ xác định hàm lượng D -glucose.Xác định Ure với sự có mặt của enzym Urease:

lysin lysindecarbocylase cadalverin + CO2

2.1.2. Điện cực đo dòng điện (Amperometric biosensor)

Điện cực đo dòng điện hoạt động dựa vào dòng điện chạy qua mạch đo khi đặt một hiệu điện thế giữa hai điện cực (điện cực đo và điện cực so sánh) Mật độ của các hạt tích điện tỷ lệ thuận với cường độ dòng điện chạy giữa hai điện cực

Cường độ dòng điện chạy giữa hai điện cực là hàm của mật độ các hạt tích điện trong dung dịch và điện thế đặt giữa hai điện cực Trong đa số trường hợp, người ta thường tiến hành oxy hóa hoặc khử một loại hạt tích điện trên cực đo

Nếu đặt vào điện cực đo một điện thế E biến thiên so với điện cực so sánh và vẽ đường cong I = f(E), chiều cao I của bậc giới hạn khuếch tán sẽ tỷ lệ với nồng độ của hạt bị oxy hóa hoặc bị khử trên điện cực đo

Hình 2.3: Đồ thị I = f(E)

Chú thích: 1- E quá nhỏ để sự oxy hóa có thể xảy ra

2- vận tốc oxy hóa điện hóa và cường độ dòng điện sẽ tăng cường với sự tăng hiệu điện thế

3- cường độ không phụ thuộc vào hiệu điện thế và I = K.CredHiện nay các điện cực đo dòng điện đang được sử dụng rộng rãi là điện cực oxy và điện cực hydroperoxyde Oxy và hydroperoxyde (H2O2) đều là những chất được sinh ra trong một số phản ứng có enzym xúc tác, cũng như trong phản ứng có các chất trung gian oxy hóa-khử nhân tạo: ferrocyanua, ion N-metyl-phenazini (NMP) và benzoqiunon và chúng có thể xác định nhờ đo dòng điện

Các điện cực đo dòng điện thường sử dụng các enzym oxydoreductase để gắn vào màng Oxy, NAD+, NADP+ được dùng như chất nhận điện tử để phục hồi enzym sau khi tham gia phản ứng xúc tác cơ chất Các enzym sử dụng Oxy như oxydase và enzym sử dụng NAD+, NADP+ được gọi là dehydrogenase hay reductase Trong hai nhóm enzym này thì oxydase được dùng nhiều nhất Các điện cực đo dòng điện được sử dụng để xác định các cơ chất của enzym như glucose, monosacharide, hypoxanthyl, lactate, acid amin, sulfite, salicylate, oxalate và pyruvate

Điện cực enzym để đo nồng độ glucose có cấu tạo gồm: một anod Pt và một catod

Ag phủ AgCl tiếp xúc với màng đã cố định glucoseoxydase (GOD) Cả hai đều được đặt trong dung dịch điện phân KCL Điện áp phân cực 0.68 Volt được đặt vào giữa hai điện cực Dưới tác động của điện áp phân cực này H2O2 được giải phóng ra sẽ bị oxy hóa ở mặt phân cách giữa anod và màng theo phản ứng:

H2O2 O2 + 2H+ + 2e

-+ O2

Dòng điện đo được tỷ lệ với lượng H2O2 bị oxy hóa và do đó tỷ lệ với lượng glucose trong môi trường cần đo

Hình 2.4: Sơ đồ nguyên tắc của điện cực đo dòng điện

Cũng như đo glucose, để đo lượng lactate, dùng điện cực có gắn lactatoxydase

(LOD) từ Pediscoccuspecies xúc tác phản ứng:

Lactate + O2 lactatoxydase pyruvat + H2O2

Để đo lượng cholesterol thì gắn enzym cholesteroloxydase (ChOD) từ

Rhodococcus eryththropolis, xúc tác phản ứng:

Cholesterol + O2 ChOD Chlest-4-ene-3-one + H2O2

Để đo lượng lactose thì gắn enzym b-galactosidase (b-GAL) từ E.coli và glucoozydase (GOD) từ A.niger, xúc tác các phản ứng:

lactose + H2O β -GAL β -D-glucose + D-galactose

β -D-glucose + O2 + H2O GOD acid gluconic + H 2 O2

Do quá trình chuyển khối H2O2 đến điện cực anod mà vận tốc phản ứng ở anod thường bị giới hạn Khi đó, cường độ dòng điện ở anod tỷ lệ thuận với nồng độ H2O2 trong môi trường tiếp xúc với anod

Cũng có thể xác định lượng glucose qua đo nồng độ Oxy hòa tan trong dung dịch

nhờ điện cực Oxy hay điện cực Clark, có cấu tạo gồm: hai điện cực có khả năng phân

cực, một catod bằng Pt và một anod bằng Ag phủ AgCl Cả hai điện cực được đặt vào chất điện phân là KCl Hệ thống điện cực này được ngăn cách với môi trường nghiên cứu bằng một màng thấm khí kỵ nước bằng teflon hay polypropylen) cho Oxy thấm qua Dưới tác dụng của điện áp phân cực 0.65V đặt vào giữa hai điện cực, Oxy khuếch tán qua màng

sẽ bị khử tại catod theo phản ứng:

O2 + 4e- + 4H+ 2H2O

Hình 2.5: Cấu tạo của điện cực Oxy xác định nồng độ Glucose

Dòng điện chạy giữa hai điện cực do phản ứng điện hóa tỷ lệ với lượng O2 bị khử và do

đó tỷ lệ với lượng O2 và lượng glucose Dòng điện được đo sau khi khuếch đại và được chỉ thị trực tiếp bằng số hoặc biểu diễn dưới dạng nồng độ Oxy hay áp suất riêng phần của Oxy

Phương pháp đo dòng điện này có những đặc điểm sau:

 Phản ứng Enzym sẽ phụ thuộc vào vận tốc khuếch tán của cơ chất qua màng

 Khi phản ứng oxy hóa – khử xảy ra, gradient nồng độ của cơ chất giảm dần,

do đó vận tốc chuyển khối chậm và có thể dòng điện bị khử, để duy trì dòng điện không đổi cần phải giữ vững vùng tiếp xúc càng nhỏ càng tốt (tức là cần điều chế các vi điện cực có đường kính rất nhỏ, đến vài mm)

 Vận tốc phản ứng oxy hóa – khử phụ thuộc vào nồng độ Oxy hòa tan Để hạn chế ảnh hưởng của nồng độ Oxy hòa tan trong dung dịch đến kết quả phân tích thì người ta không sử dụng oxy làm chất nhận điện tử mà sử dụng các chất trung gian để vận chuyển điện tử đến bề mặt điện cực Các chất vận chuyển điện tử trung gian có thể là ion Fe3+, N-methylphenazinium (NMP) hoặc tetracyanoquinodimethane (TCNQ), hexacyanoferate

2.2. ĐIỆN CỰC ĐO NHIỆT (Calorimetric biosensor)

Các phản ứng giữa cơ chất và chất xúc tác sinh học thường giải phóng ra nhiệt năng và người ta có thể đo lượng nhiệt giải phóng ra đó bằng một thiết bị đ nhiệt (điện cực đo nhiệt), từ đó sẽ tính được lượng cơ chất ban đầu Khi nhiệt lượng tỏa ra càng lớn thì độ nhạy phát hiện càng lớn Do đó để tăng nhiệt lượng tỏa ra, có thể cố định đồng thời

2 hoặc 3 enzym (cũng có thể lên tới 4-5 enzym)

Bảng 2.1: Enthanpi của một số phản ứng có enzym xúc tác:

Sử dụng đồng thời enzym glucooxydase oxy hóa đường glucose và enzym catalase

để oxy hóa peroxide Hai phản ứng này xảy ra cùng một lúc do đó lượng nhiệt tỏa ra nhiều hơn

H2O2 O2 + 2H + + 2e

-+ O2catalase

Qua nghiên cứu ta thấy cứ 0.1mM cơ chất chuyển hóa hoàn toàn thành sản phẩm sẽ tạo ra

100 kJ/mol Các thiết bị này phải luôn được đặt trong hệ thống cách nhiệt để giữ môi trường ổn định nhiệt độ

Trong loại điện cực này, bộ biến năng là cặp nhiệt điện Trên căp nhiệt, người ta phủ một lớp màng chứa enzym Cặp nhiệt có cấu tạo gồm hai dây dẫn nối với nhau nhờ mối hàn Sức điện động E của mạch phụ thuộc vào bản chất của dây dẫn và vào nhiệt độ T1,

T2 Thông thường nhiệt độ của một mối hàn được giữ ở giá trị không đổi và biết trước, gọi

là nhiệt độ chuẩn T1 = Tref Nhiệt độ của mối hàn thứ hai khi đặt trong môi trường nghiên

cứu sẽ nhạy cảm với sự thay đổi nhiệt độ của môi trường gây ra do phản ứng xúc tác bởi enzym.

Ưu điểm: Kích thước cặp nhiệt nhỏ nên có thể đo nhiệt độ ở từng thời điểm của đối

tượng cần nghiên cứu và tăng vận tốc hồi đáp tín hiệu (do nhiệt dung nhỏ) Trên cơ sở này, Bataillard đã đưa ra cải tiến là sử dụng một cặp nhiệt bán dẫn (intergrated silicon) để định lượng glucose, ure và penicillin Do tính chất của cặp nhiệt và lớp tiếp xúc enzym-cặp nhiệt có tính truyền nhiệt cao cho phép không phải kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ của môi trường xung quanh, do đó có thể thu nhỏ kích thước của thiết bị để có thể cấy vào dưới da đo trực tiếp nồng độ các chất trong máu

Hình 2.6: Sơ đồ điện cực enzym-cặp nhiệt

Loại điện cực này còn có thể gọi là điện cực áo nhiệt vì buồng đo nhiệt hoàn toàn

bị cô lập với môi trường xung quanh nhờ lớp áo nhiệt, quá trình này gần giống với quá trình đoạn nhiệt Loại thiết bị này có cấu tạo đơn giản và được sử dụng rộng rãi nhất

Hình 2.7: Sơ đồ điện cực enzym – nhiệt điện trở.

c- Thiết bị trao đổi nhiệtd- lớp cách nhiệt

e- nhiệt điện trở so sánhf- cột enzym (1mL)

g- nhiệt điện trở đoh- ống mao dẫni- Nguồn điện

Cơ chất được đi vào thiết bị trao đổi nhiệt rồi qua cột enzym để phản ứng với enzym và giải phóng ra nhiệt, nhiệt độ giải phóng ra sẽ được đo bởi nhiệt điện trở so sánh Kết quả đo được sau đó đi ra qua bộ xử lý để thu nhận tín hiệu

Mối quan hệ giữa điện trở và nhiệt độ được xác định theo phương trình:

Hay:

Trong đó R1: điện trở của nhiệt điện trở so sánh, R2: điện trở của nhiệt điện trở đo, T1: nhiệt độ của mẫu sau khi qua bộ phận gia nhiệt, T2: nhiệt độ của mẫu sau khi qua cột enzym, B: Hằng số nhiệt độ của nhiệt điện trở

Khi sự thay đổi nhiệt độ rất nhỏ, B(1/T1-1/T2) nhỏ hơn 1 thì khi đó eB(1/T1-1/T2) ~ 1 + B(1/T1-1/T2) và do đó ta có:

Khi T1~T2 thì biểu thức trên trở thành:

Độ giảm tương đối điện trở (DR/R) của nhiệt điện trở thì tỷ lệ thuận với độ tăng nhiệt độ

DT Hằng số tỷ lệ (-B/T1) là -4%oC-1 Do đó dựa vào sự thay đổi nhiệt độ mà có thể xác định được chất cần phân tích

Ngoài cách chế tạo cột vật liệu sinh học như trên, người ta còn có thể bao bên ngoài nhiệt điện trở một lớp vỏ silicon và đặt màng cố định enzym ở trên, nhờ đó thu nhỏ được kích thước thiết bị.

Hình 2.8: Điện cực Enzym-nhiệt điện trở có vỏ bọc silicon

Cũng có thể tích hợp nhiều nhiệt điện trở tạo ra điện cực nhiệt định lượng đồng thời nhiều chất Các nghiên cứu về loại điện cực nhiệt độ cho thấy ngoài những ứng dụng trong các lĩnh vực y tế, môi trường, thực phẩm, chúng còn có thể có những ứng dụng đặc hiệu như:

- Xác định các hằng số Ki, Km, Vm của enzym cố định (Stefuca, 1990)

- Định lượng ADP, ATP bằng cách sử dụng puruvatkinase và hexokinase đồng thời

cố định trên aminopropyl CPG (Kirstein, 1989)

2.3. ĐIỆN CỰC ĐO QUANG (Optical Biosensor)

Điện cực đo quang được chế tạo dựa vào các tính chất vật lý của ánh sáng để phát hiện ra sự biến đổi nhỏ trong mẫu phân tích

Nguyên tắc hoạt động: Dung dịch phân tích được tiếp xúc với màng và khi phản ứng enzym xảy ra thì sẽ có hiện tượng ánh sáng bị hấp thụ hoặc phát ra ánh sáng màu Người ta có thể xác định được hàm lượng các chất của mẫu phân tích thông qua việc đo

độ hấp thụ ánh sáng hoặc sự phát quang ánh sáng của các chất tạo thành do phản ứng xúc tác bởi enzym

Cơ sở của kiểu điện cực quang là sự kết hợp các sợi dẫn ánh sáng với phép trắc phổ quang, phép trắc huỳnh quang, hoặc phép đo phản xạ quang Nó có khả năng chỉ báo những thay đổi của các thông số quang học, chẳng hạn như sự hấp thụ ánh sáng, chiều dài bước sóng hoặc chỉ số phản xạ trong môi trường đo bao quanh sợo dẫn Những thiết

bị này gắn vào hoặc là sợi đơn hoặc là chùm sợi kép để ánh sáng tới và chùm tia sáng được đo.

Điện cực này hoạt động theo nguyên tắc: năng suất phản xạ từ mặt phản xạ tuân theo phương trình:

,%

0 0

I

I R

Trong đó C-nồng độ chất hấp thụ, K-hằng số hấp thụ, e- hằng số tán sắc

Kỹ thuật này được dùng để định lượng glucose trong máu nhờ thuốc hiện màu MBTH methyl-2-benzotiazolinon) và DMAB (3-dimethyl-aminobenzoic acid) Hai enzym Glucooxydase (GOD) và peroxydase được cố định bằng cách hấp thụ lên bề mặt tấm nền

(3-đã phủ thuốc nhuộm Khi mẫu phân tích tiếp xúc với tấm nền thì phản ứng xảy ra như sau:

H2O2

nếu H2O2 có nồng độ cao thì phải dùng enzym catalase Mẫu phân tích sau đó được đem

đo năng suất phản xạ ở bước sóng thích hợp và từ đó sẽ tính được hàm lượng glucose.Với Biosensor dựa trên nền tảng của sự phản xạ toàn phần (total internal reflection – TIR) thì bề mặt dây dẫn được phủ kháng thể, sẽ tiếp xúc với mẫu phân tích Khi sóng ánh sáng

đi đến lớp màng nhạy thì chỉ có một phần nhỏ sóng ánh sáng bị hấp thụ vào trong môi trường, còn tất cả chúng bị phản xạ lại nhiều lần và dần dần nguồn sáng bị suy giảm Dựa vào lượng ánh sáng phản xạ, ta có thể tính được hàm lượng mẫu phân tích

Hình 2.9: Biosensor dựa trên hiện tượng phản xạ toàn phần

Nguyên tắc hoạt động: Cơ chất tác dụng với enzym cố định để tạo thành sản phẩm

có khả năng phát ra ánh sáng màu Đo ánh sáng màu đó ở một bước sóng nhất định sẽ suy

ra được nồng độ cơ chất

Dựa vào đặc tính này, người ta thường sử dụng nó để xác định các vi khuẩn trong thực phẩm Khi các vi khuẩn tác dụng đặc hiệu với ATP và D-luciferin dưới tác dụng của enzym luciferase sẽ tạo thành oxyluciferin, AMP Pyrophosphate, CO2 và ánh sáng vàng

đo được ở bước sóng 562nm Từ đó xác định lượng vi khuẩn có mặt trong thực phẩm

Nguyên lý của loại điện cực này dựa vào sự dao động của các tinh thể Các chất điện môi tự nhiên như thạch anh, tuamalin, hoặc nhân tạo như liti sulfat, thạch anh tổng hợp…dao động khi chịu tác động của từ trường Tần số dao động của tinh thể phụ thuộc vào độ dày và sự biến dạng của tinh thể, mỗi tinh thể có một tần số dao động đặc trưng Tần số dao động này thay đổi theo sự hấp thụ hay nhả hấp thụ từ bề mặt tinh thể, thông thường nó sẽ tăng khi có tạp chất hấp thu lên trên bề mặt của tinh thể Đo tần số dao động

sẽ biết được nồng độ của cơ chất cần đo

Tần số dao động được tính theo công thức:

trong đó: Df: Chênh lệch tần số dao động (Hz), Dm: chênh lệch khối lượng của chất hấp thu (g), K: hằng số đặc trưng cho sự dao động của tinh thể, phụ thuộc vào bề dày và độ nứt của tinh thể, A: diện tích bề mặt hấp thu (cm2).

Điện cực điện áp được dùng để đo amoniac, methane, lưu huỳnh dioxit và cơ chất phosphate hữu cơ Ta có thể dùng nó để xác định nồng độ formaldehyde nhờ formaldehyde dehydrogenase hay xác định dư lượng thuốc trừ sâu vô cơ phospho vốn kìm hãm enzym xholinesterase

Ưu điểm: Cho thời gian đáp ứng nhanh, nhỏ gọn và rẻ tiền

Nhược điểm: Không dùng phân tích mẫu dạng lỏng, dễ bị hư hỏng do độ ẩm không khí.

Hình 2.10: Sơ đồ cấu tạo của điện cực điện áp

2.5. ĐIỆN CỰC MIỄN DỊCH (Immunobiosensor):

Điện cực miễn dịch hoạt động dựa trên tính chất kháng nguyên – kháng thể Tức là các kháng thể phản ứng đặc hiệu với các kháng nguyên sinh ra nó

Mỗi kháng thể là một protein hình chữ Y, gồm 4 chuỗi polypeptide, trong đó có hai chuỗi nặng và hai chuỗi nhẹ liên kết với nhau bởi các cầu disulfite Một phần cấu trúc của các chuỗi là cố định, nhưng các phần đầu mút của hai nhánh chữ Y lại biến đổi và tạo nên các

vị trí kết hợp có khả năng phản ứng với các chất hóa học khác gọi là kháng nguyên

Kháng nguyên là các “chất lạ” có bản chất protein hay hydrat cacbon

Phản ứng kháng nguyên – kháng thể được xác định bằng nhiều cách, trong đó có kỹ thuật ELISA (enzym linked immunosorben assay: kỹ thuật hấp thụ miễn dịch có gắn enzym) Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA như sau:

Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên được cố định trên bề mặt của một ống Một hỗn hợp gồm một lượng đã biết phức kết enzym-kháng nguyên và một lượng chưa biết kháng nguyên của mẫu được đặt vào ống Sau một thời gian thích hợp kháng thể, phức enzym-kháng nguyên và kháng nguyên tự do có thể gắn kết hoặc vẫn ở trạng thái tự do, phụ thuộc vào nồng độ của chúng Các kháng nguyên tự do được rửa trôi và loại bỏ Lượng phức kết enzym-kháng nguyên gắn với kháng thể được xác định bằng vận tốc phản ứng enzym

Hình 2.11: Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật ELISA

ELISA được sử dụng để phát hiện và khuếch đại một phản ứng kháng kháng thể Lượng kháng nguyên liên kết với enzym gắn với kháng thể cố định được xác định bằng nồ độ tương đối giữa kháng nguyên liên kết và kháng nguyên tự do và được

nguyên-định lượng bằng tỷ lệ của phản ứng enzym Để có thể đáp ứng nhanh chóng, người ta sử dụng các enzym có khả năng sử dụng lại nhiều lần Độ nhạy của phương pháp này cũng

có thể tăng lên bằng cách sử dụng các phản ứng có xúc tác enzym Các phản ứng này cho đáp ứng nhanh hơn: chẳng hạn tạo ra các sản phẩm phát quang, hoặc huỳnh quang, hoặc

có màu đậm hơn Kỹ thuật này hiện nay được sử dụng rộng rãi trong các phòng phân tích thí nghiệm

Gần đây để tăng phạm vi ứng dụng, vận tốc và độ nhạy, kỹ thuật ELISA được kết hợp với các bộ Biosensor hình thành phương pháp sử dụng điện cực miễn dịch (immunosensor) Các điện cực miễn dịch này rất thích hợp khi sử dụng với điện cực điện áp hoặc các điện cực đo điện thế

Hình 2.12: Nguyên lý hoạt động của điện cực miễn dịch

(I): Điện cực sinh học dùng ở đây thay thế cho hệ thống giám định màu truyền thống

a) Ống được phủ kháng nguyên cố định Một lượng dư phức kết enzym-kháng thể được đặt vào trong ống và xảy ra sự gắn kết;

b) sau một thời gian thích hợp, những phân tử nào không được gắn kết sẽ bị rửa trôi;

c) dung dịch chứa kháng nguyên phân tích được đưa vào ống, phụ thuộc vào nồng

độ kháng thể mà xảy ra sự gắn kết và loại một số phức kết enzym-kháng thể Lượng phức kết enzym-kháng thể loại ra được xác định bằng tín hiệu đáp ứng từ bộ điện cực sinh học.(II): Điện cực sinh học này dựa vào giám định trực tiếp các kháng nguyên gắn bề mặt được phủ kháng thể

a) điện cực sinh học được phủ kháng thể (cố định), đặc hiệu với kháng nguyên phân tích Bộ chuyển đổi được ngâm trong dung dịch chứa một hỗn hợp gồm một lượng

đã biết phức kết enzym-kháng nguyên và nồng độ chưa biết kháng nguyên phân tích;

b) sau một thời gian thích hợp, kháng nguyên và phức kết enzym-kháng thể được gắn với kháng thể;

c) những phân tử nào không được gắn với kháng thể bị rửa trôi và loại bỏ Lượng phức enzym-kháng nguyên gắn với kháng thể được xác định trực tiếp từ tín hiệu chuyển đổi

2.6. ĐIỆN CỰC VI SINH VẬT (microbial biosensor)

Điện cực vi sinh vật được chế tạo để phát hiện các chất hóa học, dựa vào sự hô hấp và trao đổi chất của vi sinh vật

Điện cực này gồm hai loại:

 Điện cực dùng để đo sự thay đổi hoạt lực hô hấp của vi sinh vật cố định với một thiết bị đo điện thế

 Điện cực dùng để đo các chất sinh ra từ vi sinh vật và phản ứng dễ dàng với điện cực

Các vi khuẩn hiếu khí sử dụng Oxy và sản sinh năng lượng Nhờ việc đo lượng Oxy tiêu thụ thông qua điện cực O2, ta có thể xác định và đánh giá được hoạt lực hô hấp của vi khuẩn Oxy thấm qua màng teflon và bị khử trên trên điện cực platin Nếu các thành phần của dung dịch có ảnh hưởng đến hoạt lực hô hấp thì nồng độ của nó có thể được định lượng thông qua việc xác định nồng độ Oxy

Người ta thường dùng điện cực này để xác định chỉ số BOD (Biochemical Oxygen Demand – nhu cầu Oxy sinh hóa) ( là lượng Oxy do vi sinh vật tiêu thụ để oxy hóa sinh học các chất hữu cơ trong bóng tối ở điều kiện chuẩn về nhiệt độ và thời gian) Chỉ số BOD là thước đo lượng chất hữu cơ gây ô nhiễm nước và nó được sử dụng để đánh giá chất lượng nước Các chất gây ô nhiễm có thể bị phân hủy bởi vi sinh vật nhờ tiêu thụ Oxy Vì vậy mức độ ô nhiễm có thể được xác định thông qua việc đo lượng Oxy.

Điện cực được chế tạo bằng các cố định trichosporon cutaneun vào màng cellulose và

gắn với điện cực Oxy

Nguyên lý hoạt động của điện cực đo BOD: Oxy khuếch tán từ dung dịch bão hòa

không khí qua màng thẩm tích đi vào màng có chứa các tế bào vi sinh vật rồi qua màng teflon và cuối cùng chúng bị khử trên bề mặt catod Pt của điện cực oxy Dòng điện của điện cực Oxy dần dần ổn định do vận tốc khuếch tán của Oxy qua màng cân bằng với vận tốc tiêu thụ Oxy do hô hấp của vi sinh vật cố định trên màng Người ta gọi dòng điện này

là dòng điện cơ bản (base current) Nếu ta cho chất đồng hóa hữu cơ vào dung dịch đo thì khả năng phân tán oxy hòa tan trong dung dịch tăng do đó vi sinh vật sẽ sử dụng oxy cho

hô hấp tốt hơn Kết quả là vân tốc hô hấp tăng dần còn nồng độ oxy hòa tan giảm dần, dẫn đến dòng giảm dần cho tới khi đạt đến trạng thái ổn định mới và người ta gọi dòng điện này là dòng đỉnh (pick current) Sự khác nhau giữa dòng cơ bản và dòng đỉnh được gọi là dòng ra (output), tín hiệu của dòng ra tỷ lệ thuận với nồng độ của các chất hữu cơ bị phân hủy sinh học của mẫu đo Vì vậy ta có thể biết được nồng độ BOD dựa trên điện cực vi sinh vật

PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO BIOSENSORViệc chế tạo Biosensor bao gồm ba bước:

 Chọn lựa bộ thụ cảm sinh học

 Chọn lựa bộ biến năng

 Cố định thành phần sinh học lên bộ biến năng

2.1. CHỌN LỰA BỘ THỤ CẢM SINH HỌC (Bioreceptor):

Bộ thụ cảm sinh học đóng một vai trò là thiết bị nhận dạng sinh học Khi có mặt chất cần kiểm tra, bộ thụ cảm sinh học phải tạo ra một hiệu ứng hóa lý có khả năng phát hiện bởi bộ biến năng Điều này liên quan nhiều quá trình chẳng hạn như sự xúc tác sinh học, sự cặp đôi miễn dịch hay sự nhận cảm hóa học

3.1.1 Enzym:

Chất xúc tác sinh học thường được sử dụng là enzym vì có sẵn trên thị trường, chẳng hạn như glucose oxidase (enzym oxy hóa glucose) và urease (Enzym thủy phân ure) Các enzym này được thu nhận từ nhiều nguồn sinh học khác nhau và được sử dụng một mình hay kết hợp với cofactor của chúng như NAD+ và NADP+

Sự sử dụng các enzym thương mại có nhiều thuận lợi chẳng hạn như khả năng sản xuất hàng loạt với những đặc điểm, thời gian sống biết trước và sẵn có Vì vậy các enzym thương mại đóng một vai trò quan trọng trong các Biosensor hiện đang có mặt trên thị trường Nhưng bên cạnh đó chúng có những bất lợi như ít bền và khi hoạt động cần có cofactor kết hợp, đồng thời một enzym đơn lẻ thì không xúc tác hoàn toàn cho một chuỗi phản ứng, vì vậy trong biosensor thường kết hợp nhiều enzym với nhau theo một trình tự hợp lý để đảm bảo sự hoạt động tối ưu của Biosensor

3.1.2 Vi sinh vật:

Cơ thể vi sinh vật có đầy đủ các enzym và cofactor cần thiết trong một môi trường

đã được tối ưu hóa Trong môi trường thích hợp, Vi sinh vật sẽ sản sinh và đền bù bất cứ

sự mất mát hoạt tính của Enzym theo thời gian

3.1.3. Mô và cơ quan :

tiếp lên bộ biến năng mà không cần đến kỹ thuật cố định protein.

 Mô thực vật – động vật :

Thực vật là nguồn enzym hữu dụng cho hóa học phân tích Bằng việc sử dụng bộ biến năng thích hợp, có thể chế tạo Biosensor có tính năng ổn định cao vì các enzym vẫn được duy trì hoạt tính trong mô thực vật Tương tự như vậy, mô động vật được xem như là một

bộ thụ cảm sinh học hữu dụng cho sự phát hiện chọn lọc L-amiono acid mà không bị ảnh hưởng đáng kể bởi D-amino acid Để tăng khả năng chọn lọc có thể kết hợp một chất kháng khuẩn để tránh sự nhiễm khuẩn, chẳng hạn như thêm 0.02% NaOH vào điện cực glutamine

 Bộ phận cơ quan :

Các xúc tác sinh học cũng được tìm thấy trong các cơ quan tế bào như lysosome, lục lạp, thể hạt và vi thể vì chúng chứa nhiều hệ thống enzym được dùng trong biosensor Chẳng hạn như vi thể gan có hệ thống enzym monooxidase với cytochrome P 450 xúc tác cho phản ứng oxy hoá nhiều acid béo, hormone steroids… Các cơ quan tế bào được gắn trực tiếp lên bộ biến năng đo dòng điện trong thiết bị Biosensor

3.1.4. Tác nhân miễn dịch :

Kháng nguyên và kháng thể cũng được sử dụng làm bộ thụ cảm sinh học Tính chọn lọc của Biosensor được quyết định bởi kháng thể và tính nhạy cảm được quyết định bởi enzym kết hợp Kháng thể được cố định vào bộ biến năng nhờ vào kỹ thuật Miễn dịch học Enzym (EIA) Hoặc thay enzym bằng chất mang ion đóng vai trò như chất trung gian của các quá trình điện hóa miễn dịch Kháng nguyên thích hợp với kháng thể được kết hợp với chất mang ion tạo ra sự tiếp hợp được phát hiện bởi bộ biến năng điện hóa.3.1.5. Bộ thụ cảm hóa học:

Màng tế bào cũng được sử dụng do khả năng kích thích hóa học gây ra sự thay đổi cấu tạo Các tế bào thần kinh cũng được dùng trong phát hiện thuốc, độc tố hay các chất khác

3.2. CHỌN LỰA BỘ BIẾN NĂNG:

Bảng 3.1: Hiện trạng nghiên cứu của Biosensor với bộ biến năng tương ứng:

Enzym Tế bào, vi sinh vật miễn dịchTác nhân Mô thực vật-động vật Bộ thụ cảm hóa học

Chú thích: x: Đang nghiên cứu cơ bản

xx: Đã nghiên cứu và phát triển những mẫu đầu tiênxxx: Những thiết bị có mặt trên thị trường

Phụ thuộc vào kiểu phản ứng và từng ứng dụng cụ thể của Biosensor mà chọn bộ biến năng phù hợp

 Nếu nó được dùng trong sinh học thì cần phải đáp ứng các tiêu chuẩn tương ứng như khả năng tách protein, lipid hay tế bào

 Nếu nó được dùng trong invivo thì cần phải giảm kích thước tối thiểu và đòi hỏi hình dạng của nó phải phù hợp để không phá huỷ mô thực vật-động vật, đồng thời cũng có khả năng loại bỏ độc tố, kim loại hoặc các thành phần đa phân tử ra khỏi

bộ biến năng

Vấn đề tác động hóa học cũng ảnh hưởng đến sự chọn lựa bộ biến năng Có thể kết hợp enzym urese vào các điện cực pH, pCO2, hay pNH3 Bộ biến năng tốt nhất cho việc xác định ure trong một mẫu sinh học là các điện cực pCO2, pNH3 bởi chúng có một màng thẩm thấu để loại bỏ tất cả những ảnh hưởng của cation và anion

3.3. SỰ CỐ ĐỊNH THÀNH PHẦN SINH HỌC LÊN BỘ BIẾN NĂNG:

Việc cố định các thành tố sinh học, nhất là enzym thường đem lại nhiều lợi nhuận hơn trong việc ứng như:

 Làm cho enzym trong nhiều trường hợp bền hơn

 Tách phức enzym – chất mang ra khỏi mẫu dễ dàng

 Hoạt độ enzym giữ được ổn định trong một thời gian dài

Người ta thường cố định các thành phần sinh học lên một chất mang rắn bằng nhiều cách Trong kỹ thuật cố định, cần đảm bảo những yêu cầu nhất định, nhất là khi các điện cực sinh học (biosensor) được đưa vào sử dụng trong thực tế:

 Các cấu tử sinh học phải giữ được hoạt độ khi gắn trên bề mặt biosensor

 Màng sinh học phải được gắn chặt với bề mặt cảm biến và vẫn giữ được cấu trúc

và chức năng

 Màng sinh học đã được cố định phải ổn định và bền trong một thời gian dài

 Vật liệu sinh học cần có tính đặc trưng riêng đối với từng cấu tử sinh học

Để cố định các thành phần sinh học trong Biosensor, người ta thường sử dụng các kỹ thuật như hấp thụ vật lý, bao gói trong khuôn gel hoặc trong polymer, liên kết đồng hóa trị với chất mang và liên kết chéo các protein

3.3.1. Sự cố định Enzym:

a. Sự cố định bằng hấp thụ vật lý:

Điện cực Enzym đầu tiên được chế tạo bởi Updike và Hicks bằng cách cố định Enzym Glucose oxidase trong một lớp gel polyacrylamide, sau đó Enzym này được gắn lên màng Plastic của điện cực oxy Hoặc có thể cố định một enzym lên một thành phần nhạy cảm của một điện cực bằng màng thẩm thấu ngăn cản sự khuếch tán protein Guibault và Shu đã chế tạo một điện cực enzym nhạy cảm với ure bằng cách trải một dung dịch huyền phù của enzym urease lên bề mặt của điện cực có màng nilon và bao bọc khít hoàn toàn bằng màng thẩm thấu, sau đó điện cực enzym này được rửa sạch với nước

và sẵn sàng để sử dụng

Nguyên tắc của phương pháp hấp phụ vật lý như sau:

 Hấp phụ enzym lên chất mang nhờ lực tương tác yếu giữa chất mang và protein như lực Valderwaalls, liên kết hydro và liên kết kỵ nước Khi chất mang không có

lỗ xốp, enzym bám trên bề mặt chất mang Khi chất mang có lỗ xốp, enzym chui vào trong các lỗ xốp của chất mang

 Nếu chất mang có chứa điện tích, liên kết giữa chất mang và enzym là liên kết ion (Liên kết này bền hơn so với hấp phụ)

Một số chất mang thường sử dụng để cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ hay liên kết ion:

 Chất mang vô cơ: silic, thủy tinh xốp, oxide của kim loại.

 Chất trao đổi ion: amberlit, DEAE – sephadex CM – sephadex, DEAE – celllulose, CM – cellulose

 Polymer tổng hợp: polyamide, polyacrylamide, polystyrol, nilon, polyvinyl

Phương pháp điều chế: Cho enzym và chất mang tiếp xúc với nhau (khuấy trộn), sau đó rửa để loại bỏ những phân tử bị gắn yếu lên chất mang

Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng enzym cố định được và độ bền của liên kết cố định:

 Nồng độ protein enzym: lượng enzym cố định lên chất mang thường tỷ lệ thuận với nồng độ của nó ở một giới hạn nhất định

 pH: pH môi trường phụ thuộc vào số lượng và bản chất của các nhóm tích điện ở chất mang cũng như ở protein enzym Sự thay đổi pH thường ảnh hưởng lớn đến lượng enzym cố định được bằng liên kết ion Đồng thời sự thay đổi pH đột ngột thường dẫn đến sự nhả hấp phụ của enzym

 Lực ion của môi trường: sự có mặt của các muối tích điện trái dấu với chất mang

có thể kéo theo sự kết tủa cục bộ của protein trong dung dịch Tuy nhiên, sự có mặt của muối cũng có thể làm tăng độ hòa tan của protein do đó ảnh hưởng xấu đến hiệu quả cố định

 Nhiệt độ: nhiệt độ tăng làm duỗi mạch protein enzym, do đó làm tăng liên kết protein enzym với chất mang, nhưng cũng làm mất hoạt tính của enzym

 Khối lượng phân tử và bản chất của chất mang: enzym có khối lượng phân tử càng nhỏ thì hấp phụ càng cao Những chất mang có chứa nhiều nhóm háo nước hấp phụ tốt hơn và bền hơn

Tuy nhiên sự cố định vật lý ngày nay ít được sử dụng do sự có mặt của enzym trong dung dịch không giữ được hoạt tính trong thời gian dài Do đó sự cố định hóa học,

sử dụng các liên kết đồng hóa trị sẽ đảm bảo độ bền của enzym trong một thời gian khá dài

b. Sự cố định bằng liên kết ngang (cross – linking immobilization):

Sự tạo liên kết ngang là quá trình sử dụng một tác nhân đa chức để tạo cầu nối giữa các nhóm xúc tác sinh học khác nhau hay protein khác nhau để tạo ra một hợp chất có trọng lượng phân tử lớn rất nhiều và không có tính hòa tan

mang chẳng hạn như albumin trong huyết thanh của bò (BSA) Ngay cả cơ quan hay các

tế bào cũng có thể kết dính được bằng việc tạo ra các liên kết ngang

Glutaraldehyde là tác nhân tạo liên kết ngang thường dùng Tác nhân có hai nhóm chức aldehyde ở các đầu mạch này sẽ phản ứng với nhóm amine trên phân tử protein hay enzym và tạo ra các hợp chất mang tính base:

Cũng có thể thay Glutaraldehyde bằng tác nhân hai chức khác như hexamethylene diisocyanate O=C=N-(CH2)6-N=C=O làm tác nhân tạo liên kết ngang

Có 4 phương pháp chính để cố định enzym bằng liên kết ngang:

 Phương pháp ngâm (Immersion method)

Ứng dụng: Phương pháp ngâm này dùng để cố định enzym urease lên điện cực thủy

tinh hay điện cực pH-nhạy cảm với các cation hóa trị I

Nguyên tắc: Chuẩn bị dung dịch cố định: Lấy 600 đơn vị I.U enzym Urease hòa tan

trong 1ml đệm phosphate 0.02M, pH = 6.8 Thêm vào 1 ml dung dịch albumine huyết thanh bò 17.5%, sau đó thêm 0.07 ml dung dịch glutaraldehyde 25% để thu được nồng độ cuối cùng 0.8% Khuấy dung dịch trong 2 phút

Chuẩn bị bề mặt hoạt động: Đầu tiên điện cực cation được rửa bằng nước cất, sau đó

lau khô bằng giấy lọc Nhúng ngập bầu điện cực trong dung dịch cố định trên, xoay điện cực nhẹ nhàng xung quanh trục của điện cực trong 15 phút để tạo một lớp dung dịch cố định đồng nhất Một vòng “O” được gắn khít vào để giữ cho màng enzym này bám chặt lên bầu điện cực Sau đó rửa điện cực bằng nước cất, dung dịch glycine, và cuối cùng bằng nước cất để tách rửa hay trung hòa tác nhân tạo liên kết ngang

Ưu điểm: Phương pháp thực hiện đơn giản, thích hợp cho việc cố định các Enzym

lên đa số các bộ biến năng, đặc biệt bộ biến năng nhỏ

 Phương pháp kết hợp trực tiếp (Direct binding method):

Nguyên tắc: Nhỏ 10 ml dung dịch chứa enzym lên trên đỉnh của một điện cực, sau đó nhỏ 10ml dung dịch chứa tác nhân tạo liên kết glutaraldehyde

Phương pháp này cũng được dùng để cố định enzym lên màng kỵ nước của các điện cực cảm ứng khí như màng fluorocarbon hay polytetrafluoroethylene

Hình 3.3: Phương pháp kết hợp trực tiếp

Ưu điểm: Tiết kiệm enzym, dùng để cố định các enzym có giá thành cao.

Nguyên tắc: đầu nhạy cảm của một điện cực được rửa và ngâm trong dung dịch enzym khoảng 20 phút để đảm bảo sự hấp thu enzym lên điện cực enzym Điện cực này sau đó được sấy khô ở 4oC và xoay Glutaraldehyde được bơm lên trên điện cực từ một khoảng cách đủ lớn để ngăn cản tạo giọt Sau khi tạo liên kết ngang, điện cực enzym được rửa với nước, sẵn sàng cho việc sử dụng

Ưu điểm: bề dày lớp enzym cực kỳ mỏng (1-2mm) và các biosensor tạo ra có thời

gian đáp ứng cực ngắn (5-10s)

Ứng dụng: Phương pháp này dùng để cố định enzym pennicilinase, urease và

acetylcholinesterase, cố định các protein lên nhiều chất mang

Các màng membrane gắn nhóm chức sẵn (Prefunctionalized membrane) dùng các màng membrane xốp sẵn có trên thị trường Những màng này có các nhóm chức liên kết

có khả năng phản ứng với vị trí tự do của enzym Các màng này sau đó đem ngâm trong dung dịch chứa enzym đã chọn để thu được một màng enzym với những tính chất cơ học hữu dụng

3.1.3. Sự cố định cofactor:

Cofactor được cố định lên chất mang đồng thời cùng lúc với enzym bằng phương pháp hấp thụ vật lý, hay bằng liên kết ngang

Vi sinh vật có kích thước lớn hơn enzym do đó dễ dàng cố định bằng phương pháp vật lý Chúng có thể được cố định bằng gel agar hay polyacrylamide hoặc màng thẩm thấu và màng lọc membrane như millipore 0.22 mm – chế tạo từ ester cellulosic Toàn bộ tế bào

vi sinh vật được cố định trong huyền phù collagen đã được xử lý bởi glutaraldehyde Màng collagen cũng được sử dụng như một chất mang vật lý

Màng kỵ nước và vi sinh vật có thể được gắn đồng thời lên các điện cực khuếch tán khí chẳng hạn như điện cực pNH3, pO2, pCO2 Vi sinh vật được nhốt trong các lỗ màng lọc cellulose acetate, sau đó rửa các tế bào vi sinh vật tự do trên bề mặt và đặt màng

vi sinh vật trên vào điện cực dùng màng thẩm thấu và ngâm trong dung dịch đệm để loại

bỏ các thành phần dinh dưỡng ảnh hưởng tới phép đo Các điện cực vi sinh vật được bảo quản ở nhiệt độ 40C trong dung dịch đệm phosphate

Hình 3.5: Điện cực vi khuẩn đo dòng điện

Cũng có thể cố định một enzym và một tế bào vi sinh vật lên cùng bộ biến năng Vi sinh vât được cố định bằng phương pháp vật lý và enzym được cố định bằng phương pháp liên kết đồng hóa trị để tránh sự nhả protein

Vi khuẩn acetic thuộc loài Acetobacter xylinum có khả năng tạo ra màng mỏng

trong môi trường tĩnh sau khi xử lý với glutaraldehyde và có những tính chất cơ học nhất định thì có thể cố định trực tiếp vào điện cực Oxy mà không cần dùng màng thẩm thấu.3.3.2. Cố định các tác nhân miễn dịch:

Nhiều điện cực miễn dịch được tạo ra bằng các cố định các tác nhân miễn dịch lên các bộ biến năng khác nhau

Mục đích: Để phát hiện ra kháng nguyên tương ứng tạo ra kháng thể Do kháng thể có cấu trúc là protein nên phương pháp cố định kháng thể tương tự như phương pháp cố định enzym: dùng phương pháp cố định trực tiếp hay sử dụng màng membrane.

 Cố định trực tiếp lên bộ biến năng:

Các kháng thể có thể được gắn lên một điện cực carbon bằng liên kết cộng hóa trị Các nhóm COOH được tạo ra trên điện cực carbon bằng phản ứng điện hóa trong môi trường acid nitric HNO3 và kali bicromat K2Cr2O7 và gắn với kháng thể bằng một tác nhân tạo liên kết ngang như carbodiimide

Hoặc có thể cố định bằng phương pháp hấp phụ kháng thể lên các lớp kim loại vàng hay bạc lắng trên thủy tinh Sau đó dùng phương pháp dò cộng hưởng gen nguyên sinh bề mặt

 Sự cố định bằng màng membrane:

Các kháng thể cũng có thể được cố định lên các màng membrane theo trình tự như sau: đầu tiên màng bromo-acetylcellulose được ngâm trong dung dịch chứa hexamethylene diamine, sau đó ngâm trong dung dịch diepoxy butadiene, dung dịch này tạo ra các nhóm sẽ phản ứng với kháng thể, cuối cùng màng này với kháng thể đã đuợc cố định được rửa với dung dịch ethanolamine để loại bỏ những nhóm epoxy không phản ứng

Kháng thể cũng có thể được cố định trong các mạng nylon hoặc hấp thụ vật lý bằng các màng collagen và polyvinylbutyral, sau đó được lắp vào điện cực ISFET Màng này được hoạt hóa với glutaraldehyde trước khi kết hợp với kháng thể Các kháng thể cũng có thể được cố định lên sợi quang học

b) Sự cố định kháng nguyên:

Kháng nguyên là các hợp chất bao gồm protein, hydratcarbon,…chúng được cố định bằng những cách khác nhau, không như kháng thể và enzym Yếu tố quyết định tính kháng nguyên dinitrophenol (DNP) có thể được kết hợp với một chất mang ion dibenzo-18-crown-6 (DB18C6) và sau đó được cố định trong màng polymer Đầu tiên, ether này được chuyển thành dẫn xuất dạng trans-dinitro và sau đó thành dẫn xuất arylaminey thích hợp cho việc kết hợp với fluorodinitrobenzene Phức hợp này được hòa tan trong tetrahydrosulfan và thêm dibutylsebacate, sau đó kết hợp phức hợp này trong màng polyvinylchloride (PVC) Cuối cùng màng kháng nguyên được chia thành những đĩa nhỏ được gắn lên trên đỉnh của điện cực Các biosensor tạo ra nhạy cảm trực tiếp với các kháng thể Tuy nhiên, điện cực tạo ra bằng cách này vẫn có nhược điểm đó là DNP có một

ái lực đối với ion K+ của dung dịch chất điện phân bên trong điện cực, do đó cho kết quả