5.1. ỨNG DỤNG TRONG CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM:
Trong ngành thực phẩm, việc kiểm tra chất lượng thực phẩm dựa trên các phương pháp truyền thống thường mất nhiều thời gian từ vài giờ đến vài ngày. Nhưng với kỹ thuật dùng biosensor đã mang lại cho ngành cơng nghiệp thực phẩm một thiết bị theo dõi và đo lường nhanh, độ nhạy cao, sử dụng thuận lợi hơn so với những phương pháp truyền thống.
Bảng 5.1: Một số ứng dụng của biosensor trong cơng nghiệp thực phẩm:
Hợp chất
cần đo Ưng dụng phát hiện (định tính và định lượng)
Các acid amin
Alanin, arginin, asparagin, acid aspartic, cystein, glutamin, acid glutamic, glutathiol, histidin, leucin, lysin, methionin, N-acetyl methionin, phenylalanin, sarcosin, serin, tyrosin, tryptophan, valin Các hợp chất
amin, amid, dị vịng
Aminopyrin, anilin, amin thơm, acetyl cholin, cholin, phosphatidyl- cholin, creatin, guanidin, guanosin, penicilline, spermin, creatin, acid
uric, ure, xanthyl, hypoxanthin.
Hydratcarbon Amygdalin, galactose, glucose, glucose-6-phosphat, lactose, maltose, sacharose, tinh bột.
Acid hữu cơ Acid acetic, acid formic, acid gluconic, acid isocitric, acid ascorbic, acid lactic, acid malic, acid oxalic, acid pyruvic, acid succinic, acid nitrylacetic.
Các rượu và các
phenol Acetaldehyde, bilirubin, catechol, cholesterol, cholesterol ester, ethanol, glycerol, glycerol ester, methanol, phenol. Các hợp chất
khác Chất kháng sinh, độ tươi của cá thịt, vitamin
a) Đo nồng độ glutamin và nồng độ glutamat
Glutamat trong thực phẩm khơng chỉ ảnh hưởng đến mùi vị của thực phẩm mà cịn liên quan đến khía cạnh an tồn vệ sinh thực phẩm. Các loại đồ hộp thịt cá , đồ hộp nước xúp, dầu giấm, nước sốt được bổ sung một lượng mono natri glutamat cĩ tác dụng tăng mùi vị, nhưng một lượng lớn glutamat cĩ thể gây ra những dấu hiệu bệnh lý nghiêm trọng ảnh hưởng sức khỏe con người như: tim đập nhanh, đau dạ dày.
glutamat oxydase. Glutamat oxydase cũng cĩ thể được đồng cố định với glutaminase để đo nồng độ glutamin dựa trên phản ứng:
glutamin glutaminase glutamat + NH3
glutamat glutamat oxydase α - ketoglutarat + NH3 + H2O2
Việc đo nồng độ glutamin cĩ ý nghĩa rất quan trọng bởi đĩ là chỉ tiêu đánh giá nguồn nitơ của mơi trường nuơi cấy vi sinh vật cơng nghiệp.
Glutamat oxydase cĩ hoạt tính tối ưu tại pH = 7.8, cịn glutaminase từ E.coli lại hoạt động tại vùng acid. Nếu thay thế bằng glutaminase trung tính từ Bacillus thì cả hai enzym này đều cĩ hoạt tính tối ưu tại pH = 7 và cĩ tính chịu nhiệt tốt. Màng enzym tạo thành rất ổn định và cĩ hoạt tính tốt được sử dụng trong thương mại.
Màng enzym cho kết quả đo đạt tuyến tính đến 8mM glutamin, khơng đáp ứng với các chất khác (trừ glutamat), và giữ được trạng thái khơ trong thời gian ít nhất 6 tháng ở 4oC, thời gian đáp ứng 30 giây nhanh hơn rất nhiều so phương pháp sắc lý lỏng cao áp HPLC.
b) Đo nồng độ cholin:
Trong cơ thể, cholin là thành phần của phospholipid cấu tạo nên màng tế bào và màng của nhiều bào quan trong tế bào, mặt khác cholin cịn là tiền chất để tổng hợp nên acetylcholin (chất cĩ vai trị chuyển sự kích thích thần kinh), đồng thời cũng là nguồn các nhĩm methyl trong cơ thể. Cholin thường được bổ sung vào thức ăn cho trẻ em và các sản phẩm dinh dưỡng cho người lớn.
Việc xác định nồng độ cholin cĩ thể thực hiện bằng phương pháp theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trên mơi trường cơ chất, bằng phương pháp quang phổ hay sắc ký. Tuy nhiên, các phương pháp này thường ít chính xác, thời gian dài và giá thành cao. Với sự sử dụng điện cực enzym cĩ gắn cholin oxydase được chế tạo dựa trên cơ sở phản ứng oxy hĩa sẽ cho thời gian nhanh, chính xác hơn rất nhiều.
Phản ứng oxy hĩa xảy ra trong điện cực:
cholin + O2 H2O2 +
betain aldehyde
cholin oxydase
betain aldehyde
dụng dung dịch cholin hydroxyde nồng 111mg/l làm chuẩn. Thời gian thu được kết quả chỉ sau 30 giây và giá rẻ.
c) Đo hàm lượng cồn:
Hàm lượng cồn được xác định bằng cách sử dụng alcohol oxydase:
rượu + O2 alcohol oxydase H2O2 + aldehyde
Tuy nhiên một hạn chế của điện cực này là tính khơng bền của alcohol oxydase ở dạng khơ, do đĩ cần cĩ biện pháp bảo quản thích hợp để ổn định hoạt tính enzym.
d) Phát hiện sự cĩ mặt của vi khuẩn cĩ mặt trong thực phẩm:
Dùng điện cực sinh học phát quang để phát hiện sự cĩ mặt của vi khuẩn trong thực phẩm khi vi khuẩn này tác dụng đặc hiệu với ATP và D-luciferin để giải phĩng ra ánh sáng phát quang nhờ tác dụng xúc tác của enzym luciferase:
ATP + D-luciferin luciferase oxy luciferin + AMP + CO2 + λ (562nm) ánh sáng vàng
e) Điện cực miễn dịch đo hàm lượng albumin, insulin:
Điện cực miễn dịch kết hợp với điện cực đo dịng điện để xác định insulin, albumin:
Cho kháng thể kháng insulin đã biết (lấy từ lợn) lên trên một lớp màng đã gắn trong điện cực Oxy để các kháng thể cĩ thể bám trên lớp màng đĩ, sau đĩ cho insulin cần kiểm tra lên màng và cho tiếp kháng nguyên (insulin) đã gắn catalase và bổ sung cơ chất là H2O2, phản ứng như sau:
H2O2 catalase - insulin H2O + 1/2 O2
Hàm lượng O2 tạo thành được định lượng nhờ điện cực O2 từ đĩ xác định được hàm lượng insulin.
Hình 7.1 mơ tả điện cực miễn dịch sử dụng bộ chuyển đổi quang học, trong đĩ biến đổi sinh học tạo ra đáp ứng quang thơng qua một màng điện cực (sensor chip).
Khi mẫu chứa kháng nguyên đi qua sẽ phản ứng đặc hiệu với kháng thể trên bề mặt sensor chip và do đĩ làm thay đổi bước sĩng và gĩc phản xạ của ánh sáng chiếu vào mặt bên kia của sensor chip. Đo các thơng số quang học sẽ cho ta nồng độ kháng nguyên cĩ trong mẫu.
f) Kiểm tra hàm lượng cloramphenicol trong sản phẩm thủy sản:
Dùng điện cực miễn dịch dựa trên nguyên tắc ELISA để kiểm tra hàm lượng cloramphenicol trong thủy sản.
Các giếng được phủ lớp kháng thể kháng cloramphenicol (cloramphenicol chuẩn hoặc dung dịch chuẩn). Cloramphenicol gắn enzym và kháng thể kháng cloramphenicol được bổ sung vào giếng. Cloramphenicol tự do và cloramphenicol gắn kết enzym sẽ cạnh tranh các vị trí kết gắn của kháng thể kháng cloramphenicol (phản ứng miễn dịch enzym cạnh tranh). Đồng thời các kháng thể được bổ sung vào được cố định lại bởi các kháng thể trên thành giếng. Cloramphenicol kết gắn enzym bị dư thì sẽ được loại bỏ bằng cách rửa. Bổ sung vào giếng cơ chất của enzym (ure peroxyde) và chất tạo màu (tetramethyl benzidin) và ủ. Enzym gắn kết sẽ chuyển hĩa chất tạo sắc vốn khơng màu thành sản phẩm cĩ màu xanh. Khi bổ sung chất kết thúc phản ứng sẽ chuyển từ màu xanh sang màu vàng. Đo cường độ màu trên máy đo màu quang điện ở bước sĩng 450 nm, thì nhận thấy cường độ màu tỷ lệ nghịch với hàm lượng cloramphenicol cĩ trong mẫu.
Giai đoạn ủ được thực hiện trong máy ủ ổn định nhiệt độ. Kết quả phản ứng được đọc bằng máy đọc theo nguyên tắc so màu và so sánh với đồ thị chuẩn để xác định nồng độ kháng sinh. Phương pháp này cĩ thể phát hiện cloramphenicol ở nồng độ 0.05ppb.
Loại thiết bị này cịn được sử dụng để kiểm tra một số chất khác bằng các loại chất chuẩn khác nhau (các kit chuẩn) với giới hạn phát hiện rất thấp.
Bảng 5.2: Một số các kit chuẩn sử dụng và giới hạn phát hiện:
Loại kit Giới hạn phát hiện
cloramphenicol - mẫu sữa - mẫu thịt, trứng - mẫu tơm 0.15 ppb 0.10 ppb 0.05 ppb clenbuterol
- mẫu nước tiểu - mẫu thịt
0.10 ppb 0.04 ppb
Histamin - cá tuyết
- bột cá
20 ppb 125 ppb
g) Xác định hàm lượng mycotoxin trong ngũ cốc và thực phẩm
Mycoloxin là độc tố sinh ra trong quá trình phát triển của nấm mốc cĩ mặt trong các sản phẩm như: lạc, ngũ cốc, hoa quả.chúng cũng cĩ thể xuất hiện trong thức ăn gia súc. Gia súc khi ăn các thức ăn này, độc tố mycotoxin cĩ thể đi qua quá trình trao đổi chất rồi cĩ mặt trong các sản phẩm như trứng, sữa, thịt.
Cĩ nhiều phương pháp xác định mycotoxin trong đĩ phương pháp xác định bằng điện cực miễn dịch đang được sử dụng rộng rãi. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc liên kết đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể. Một nồng độ cố định của kháng thể được trộn với mẫu cần phân tích cĩ chứa hàm lượng mycotoxin chưa biết, kháng thể và mycotoxin sẽ tạo thành phức. Điện cực sẽ xác định nồng độ kháng thể tự do (khơng tạo phức với mycotoxin). Dựa vào đồ thị mycotoxin chuẩn cĩ thể định lượng được mycotoxin cĩ trong mẫu cần phân tích.
5.2. ỨNG DỤNG TRONG MƠI TRƯỜNG
Các điện cực enzym sử dụng trong phân tích mơi trường cĩ thể chia thành ba nhĩm dựa vào đặc điểm của một phản ứng enzym:
Nhĩm thứ nhất : các chất được định lượng là cơ chất của phản ứng enzym. Nhĩm thứ hai: các chất được định lượng là các chất kìm hãm hoạt tính xúc tác của enzym. Ví dụ, các hợp chất cơ phospho và cacbonat.
Nhĩm thứ ba: nồng độ các ion kim loại dược phát hiện nhờ vào việc chúng liên kết với phần “apoenzym” do đĩ phục hồi hoạt tính của enzym.
a) Định lượng ion kim loại nặng
Các enzym thuộc nhĩm metalloenzym cần cĩ các ion kim loại tham gia vào trung tâm hoạt động để duy trì được hoạt tính xúc tác của enzym, do đ1o khi các ion kim loại này bị tách ra khỏi enzym ( ví dụ, do tác dụng của tác nhân tạo phức) thì sẽ làm mất hoạt tính xúc tác của enzym.hoạt tính xúc tác của enzymcĩ thể phục hồi khi cho enzym tiếp xúc với mơi trường chứa ion kim loại thì ion kim loại sẽ thu hút lại vào trung tâm hoạt động của enzym. Do đĩ cĩ thể định lượng được nồng độ kim loại nặng trong mẫu thơng qua việc
định tiếp xúc vơi mẫu.
Ưu điểm của phương pháp này là cĩ thể phát hiện các kim loại ở nồng độ rất nhỏ ( m mol) và cĩ thể ph1t hiện được bất kỳ một kim loại nào cĩ mặt trong nhĩm metalloenzym.
Bảng 5.3: giới thiệu một số điện cực xác định ion kim loại
Kim loại Enzym Điện cực Nồng độ (mmol/l)
Hg (II) Urease Điện cực NH4+ 0 – 150 nm/l
Zn (II) apoenzym: phosphatasephosphatase kiềm Điện cực nhiệt điện trởPH – ISFET 1.1 – 1 (sai số 2.3%) 0.01 – 1
Cu (II) galactooxydaseApoenzym: Điện cực Pt/Ag/AgCl 0.1 – 1 (sai số 7%) Cu (II) Apoenzym: tyrosinase Điện cực O2 < 0.5
b) Định lượng phenol:
Việc phân tích nồng độ các hợp chất phenol dựa trên phản ứng:
Phenol + O2 + 2H+ tyrosinase (polyphenol oxydase o- diphenol o - diphenol + O2 tyrosinase o - quinon