sản xuất enzyme amylase từ vi sinh vật

Mục lục Giới thiệu chung A Amylase 1/ Nguồn enzym amylase từ vi sinh vật 2/ Đặc tính và cơ chế tác dụng của amylase a/ α-amylase b/ β-amylase c/ Glucoamylase 3/ Thu nhận enzym amylase t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Giảng viên giảng dạy:

TS Lại Mai Hương

Họ và tên SV:

Mục lục

Giới thiệu chung

A) Amylase

1/ Nguồn enzym amylase từ vi sinh vật

2/ Đặc tính và cơ chế tác dụng của amylase

a/ α-amylase

b/ β-amylase

c/ Glucoamylase

3/ Thu nhận enzym amylase từ vi sinh vật

a/ Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật

b/ Các yếu tố ảnh hưởng của môi trường đến tổng hợp enzym amylase

+Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng

+ Ảnh hưởng của amino acid

+ Aûnh hưởng của nguồn khóang dinh dưỡng

+ Ảnh hưởng của pH nguyên liệu

c/ Các phương pháp thu nhận enzym amylase

Bảng số liệu

B) Một số VSV đặc trưng

1)Vi khuẩn

2)Nấm

I/GIỚI THIỆU CHUNG:

Enzym là một loại protein, xúc tác cho mọi phản ứng sinh học trong mọi tế bào củasinh vật Enzym được tạo thành trong cơ thể thực vật, động vật và vi sinh vật Trongcông nghiệp sản xuất enzym thì thường dùng vi sinh vật do vi sinh vật có nhiều ưu điểm:

- Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh

- Enzym thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao

- Vi sinh vật là giới sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp

- Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và dễkiếm

- Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzym khác nhau

Trong nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzym có một số kỹ thuật chung và một số kỹthuật riêng Những kỹ thuật chung bao gồm:

- Kỹ thuật tạo giống

- Lựa chọn phương pháp nuôi cấy

- Thiết kế thiết bị nuôi cấy

- Kỹ thuật lên men

- Tách, tinh chế thu nhận enzym

- Tách, tinh chế và thu nhận chế phẩm enzym (có nhiều đặc điểm chung với kỹthuật tách, tinh chế thu nhận chế phẩm enzym từ nguồn động vật và thực vật)

Để đảm bảo tính ổn định trong quá trình tổng hợp enzym và tính ổn định của hoạttính enzym thì phải bảo quản giống vi sinh vật dùng trong sản xuất enzym Để bảo quảnenzym, người ta thường áp dụng những phương pháp sau:

- Phương pháp cấy truyền và bảo quản lạnh

- Phương pháp bảo quản trong đất hoặc trong cát

- Phương pháp bảo quản giống trong hạt ngũ cốc

- Phương pháp bảo quản giống trong lớp dầu khoáng

- Bảo quản giống theo phương pháp đông khô

có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường 19 năm sau, tức là vào năm 1833, hainah2 khoa học người Pháp là Payen và Persoz đã tách được chất phân giải tinh bột đó từđại mạch nảy mầm Các tác giả đã dùng rượu để kết tủa nó trong dịch chiết malt và thuđược enzym ở dạng bột, đồng thời đặt tên là diaslase (xuất phát từ chữ Hi Lạp có nghĩa

là phân giải) Sau này theo đề nghị của Duclo, enzym phân giải tinh bột được gọi là

amylase.

Amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảymầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn Bấy giờ, người ta thu chúng chủ yếu từcanh trường vi khuẩn, nấm sợi và một số loài nấm men.

Ở các nước phương Đông, nhất là Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, nhân dân đãbiết sử dụng amylase từ vi sinh vật hàng ngàn năm nay Amylase có thể thủy phân hạttinh bột chưa hồ hóa cũng như hạt tinh bột đã hồ hóa

Phân loại:

Enzym amylase chia làm 2 nhóm:

-Endoamylase (α - amylase, EC.3.2.1.1) Nhóm này gồm 2 nhóm nhỏ:

+ α-1,4-glucano hydrolase

+ α-1,6 glucano hydrolase: gồm:

isoamylase (EC.3.2.1.68)

pullulanase ( EC.3.2.1.41)-Exoamylase Nhóm này gồm:

+ β-amylase (EC 3.2.1.2)+ Amyloglucosidase (glucoamylase) (EC 3.2.1.3)

Ứng dụng của Amylase:

1) α-amylase ( EC 3.2.1.1):

-α-amylase của vi khuẩn được ứng dụng để thu nhận maltodextrin có DE là 20

- α-amilase của nấm sợi được ứng dụng để thu nhận maltodextrin có DE là 402) β-amylase ( EC 3.2.1.2):

- Tham gia phân giải chuỗi amylase

- Tham gia phân giải glucose thứ 2, thứ 3 từ điểm liên kết α-1,6 glucoside

- Tham gia isomer hóa glucose thành fructose, tăng độ ngọt cho sản phẩm

Trong thiên nhiên, enzym có ở hầu hết mọi thực vật, động vật và vi sinh vật Song chỉ

có một số hạt thực vật và một số loài vi sinh vật mới là những đối tượng có thể dùng làmnguồn thu nhận các chế phẩm enzym amylase, do chúng có khả năng tích lũy một lượnglớn các enzym này trong những điều kiện xác định

II/NGUỒN ENZYM AMYLASE TỪ VI SINH VẬT:

Ngày nay do có ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật đã trở thành nguồn thu enzym chủđạo Người ta đã biết nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzym amylase.Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên,bởi vì các loài khác nhau và thậm chí các chủng vi sinh vật khác nhau cũng thường sản sinh

ra nhiều hệ enzym khác nhau Chẳng hạn trong số 278 loài Aspergillus được tiến hành thử

nghiệm thì chỉ có 34 loài tạo α-amylase và maltase với lượng đáng kể Vi sinh vật tạoamylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì íthơn

Để thu nhận amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi Aspergillus (Asp oryzae, Asp niger, Asp usamii, Asp awamo-ri, Asp batatae) ; Rhizopus (Rh Lonnesis,

Rh neveus, Rh japonicum , Rh fonkinensis, Rh lopninen-sis, Rhizopus delemar) và

một số loài của Neurospora, Mucor sinh tổng hợp rất mạnh mẽ không những chỉ αamylase mà cả glucoamylase

-Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida , Saccharomyces,

Endomycopsis, Endomyces cũng tạo amylase Đặc biệt người ta đã tuyển chọn được

chủng Endomycopsis species 20-9 có khả năng tổng hợp mạnh mẽ glucoamylase, αamylase, glucoziltransferase và invertase

-Nhiều vi khuẩn cũng có khả năng tạo lượng lớn enzym amylase như Bacillus

Polymyxa , Bac cassavanum ,Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas saccharophila, Phytomonas destructans … Các vi khuẩn ưa nhiệt (ưa ấm) có khả năng sinh trưởng

nhanh (4-6 lần vi khuẩn ưa ấm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối cao, nên khi nuôichúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi sinh vật khác.Những vi khuẩn ưa nhiệt tạo nhiều

enzym amylase đáng chú ý là Bac diastaticus, Bac stearothermo-philus, Bac.

coagulans, Bac circulans Đặc biệt, Bac circulans được phân lập từ đất sinh trưởng tốt

ở 65-700C và tạo amylase mạnh nhất ở 500C Vì vậy người ta nuôi vi khuẩn này để làmgiống ở 700C, còn khi nuôi để thu enzym thì nuôi ở 500C Trong số vi khuẩn ưa ẩm tạo

amylase mạnh, thì Bac subtilis được nghiên cứu chu đáo hơn cả và được sử dụng rộng rãi nhất Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bac subtilis là 370C

Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loài tạo amylase mạnh, tuy nhiên, cũng có một

số loài, chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt Micromonospora vulgaris 42 có khả năng tạo

một lượng nhỏ α-amylase hoạt động ở 650C cùng với protease và các enzym khác

Trong công nghiệp, các biến chủng tạo được bằng cách gây đột biến nhờ tác độngcủa các tác nhân lý học hay hóa học hoặc tác động phối hợp cùa hai tác động trên lànhững chủng hoạt động rất có khả năng sinh tổng hợp nhiều amylase Chúng được sử

dụng rộng rãi để thu chế phẩm amylase Đáng chú ý là những chủng của nấm mốc: Asp.

niger, Asp niger S-4, Asp niger S-4-10, Asp usamii 3758-45, Asp batatae 217-61, Asp oryzae 3-9-15, Asp oryzae N-475, Asp niger URRL-333 và Asp NRRL-337 Phức hệ

enzym amylase từ các nguồn khác nhau đều do đặc điểm riêng Đối với nấm sợi

Aspergillus, trong canh trường của chúng thường có các enzym sau: α-amylase,glucoamylase , glucoziltransferase

III/ĐẶC TÍNH ENZYM VÀ CÁC LOÀI VI SINH VẬT DÙNG TỔNG HỢP:

Amylase là hệ enzym phổ biến trong thế giới vi sinh vật Các enzym này thuộc nhómthủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết nội phân tử trong polysaccharide với sự thamgia của nước

R – R’ + H – OH R – H + R’OH

Hiện nay người ta đã biết có 6 loại enzym amylase, trong đó Bac subtilis amylase (αamylase, β- amylase, γ-amylase hay glucoamylase) thủy phân các liên kết α-1,4

-glucoside của tinh bột và các polysaccharide đồng loại Bac subtilis amylase còn lại

(dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase và oligodextrin- 6-glucanhydrolase hay dextrinase) thủy phân các liên kết α-1,6 glucoside trongpolysaccharide và các dextrin cuối Nhiều vi sinh vật tạo các enzym transglucozilasecùng với amylase Các enzym amylase từ các nguồn khác nhau thì thường khác nhau vềtính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân Ngay cả cácamylase cùng loại nhưng khác vi sinh vật tổng hợp nên cũng có nhiều đặc điểm khácbiệt nhau về đặc tính, cơ chế tác dụng và điều kiện hoạt động

3.1/ α -amylase: ( α -1,4 glucan - glucanhydrolase)

3.1.1/ Đặc tính enzym:

α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều đặc điểm rất giống nhau α-amylase

có khả năng phân cách các kiên kết α-1,4 glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơchất (tinh bột, glycogen và polyose đồng loại) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật

tự nào cả Vì thế người ta gọi nó là enzym amylase nội phân tử (endoamylase) Khi tácdụng lên tinh bột, enzym này giải phóng ra glucose ở dạng α-mutamer, nên năm 1924,Kuhn gọi nó là α-amylase α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân

cả hạt tinh bột nguyên lành, song với tốc độ rất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn

-Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phântạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảmnhanh (các amylase và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh)

-Giai đoạn hai (giai đoạn đường hóa) các dextrin phân tử thấp vừa được tạothành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine Cácchất này bị thủy phân rất chậm cho disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng của, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose Sau đócác polyglucose này lại bị phân cách tiếp tục nên các mạch polyglucose collagen cứngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose Qua một thờigian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylase chứa 13% glucose và 87% maltose.Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự, nhưng vì α-amylasekhông phân cắt được liên kết α-1,6 glicoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tửamylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì trong sản phẩm cuối cùng, ngoài các đườngnói trên (72% maltose, 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%)

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thànhmaltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-

amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp khơng cho màu vớiiodine và một ít maltose.

Khả năng dextrin hĩa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nĩ Vì vậy,người ta thường gọi loại amylase này là dextrin hĩa hay amylase dịch hĩa

Tinh bột + α-amylase α-dextrin + maltose + glucose + H2O

Tâm hoạt động của α-amylase cĩ chứa các nhĩm –COOH và NH3 α-amylase

dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu lỗng Protein của các α-amylase

cĩ tính chất acid yếu và tính chất của globulin Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4.2 –5.7 Phân tử lượng của các α-amylase từ các nguồn khác nhau rất gần nhau

α-amylase là một metaloenzym (enzym cơ kim) Các α-amylase đều chứa 1 –

30 nguyên tử gam Ca/mol, song khơng ít hơn 1 – 6 nguyên tử gam Ca/mol Khi táchhồn tồn Ca ra khỏi enzym thì α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất Vì Ca

tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc Bac subtilis của enzym, duy trì cấu

hình hoạt động của enzym Ca cịn cĩ tác dụng bảo đảm cho α-amylase cĩ độ bền cựclớn đối với các tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzym phân giải protein

α-amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác Người ta cho rằng đặc tínhnày của α-amylase cĩ liên quan tới hàm lượng của Ca trong phân tử của α-amylase Tất

cả α-amylase đều bị kiềm hãm bởi kim loại nặng α-amylase từ các nguồn khác nhau cĩthành phần amino acid khác nhau: mỗi loại α-amylase cĩ một tổ hợp amino acid đặchiệu riêng, song chúng đều khá giàu tyrosine và tryptophan Các glutamic acid vàaspartic chiếm gần ¼ tổng lượng amino acid cấu thành phân tử enzym Trong α-amylase

rất ít methionin và chỉ khoảng 7 – 10 gốc cysteine, trừ amylase của Bac subtilis khơng

cĩ các liên kết sulfhydryl và disulfhydryl

Thành phần amino acid của α-amylase của Aspergillus như sau (g/100g protein):

alanine = 6,8 phenylalanine = 4,2 methionine = 2,2

glycine = 6,6 tyrosine = 9,5 arginine = 2,7

soleucine = 5,2 threonin = 10,7 glutamic = 6,9

prolin = 4,2 cystine + cysteine = 1,6 amide = 1,5

Nhiều loại α-amylase đã biết hiện nay đều hoặc là thu được ở dạng tinh khiếthoặc là thu ở dạng tinh thể

Phần lớn α-amylase có phân tử lượng tương đối gần nhau (= 40000) song cónhững trường hợp như α-amylase của Bac strearothermophilus có phân tử lượng là

15600 Người ta có nhận xét rằng, phân tử lượng của α-amylase giảm đi (chỉ cònkhoảng 14000 – 15000 )còn hàm lượng Ca trong phân tử lại tăng theo nhiệt độ nuôi

vi sinh vật

Không giống các α-amylase khác , amylase của Asp oryzae có chứa phân chi

protein là polysaccharide Polyose này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 molhexozamin trên 1 mol enzym, vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết đượcrằng không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trongphân tử enzym

Ion Ca2+ làm ổn định các α-amylase của malt, của vi sinh vật trong đó có cả 3

amylase từ Asp awamori và Asp oryzae, nhưng giống thì chỉ làm ổn định có α

-amylase của Asp flavus , còn α-amylase của Asp oryzae và Asp awamori lại được ổn

định bởi Amilozse3+ sắt ức chế họat động của α-amylase từ Asp awamori và Asp.

oryzae

Về cơ chế tác dụng, trong một thời gian khá dài người ta cho rằng α-amylaselà enzym dextrin hóa điển hình, thủy phân tinh bột thành dextrin và chỉ tạo rất ítđường Tuy nhiên gần đây người ta thấy rằng trong nấm mốc có α-amylase vừa biểulộ hoạt tính dextrin cao vừa tạo ra một lượng lớn glucose và maltose

Fukumoto và cộng tác viên cho rằng trong số các α-amylase của vi khuẩn cóloại α-amylase dextrin hóa, có lọai α-amylase đường hóa Khi thủy phân tinh bộtbằng α-amylase đường hóa thì có tới 60% (và hơn nữa ) tinh bột bị phân giải, cònbằng α-amylase dextrin hóa thì mức độ depolime hóa không vượt quá 30-40% Sovới α-amylase của nấm mốc, amylase vi khuẩn có họat lức dextrin hóa trội hơn làhọat lực đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84-87% Vận tốc thủy phântinh bột bởi α-amylase vi khuẩn ở giai đọan đầu cao hơn của α-amylase Asp oryzae

tới 25% và giảm mạnh khi đạt được 30-32% sự thủy phân

Điều kiện họat động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường khônggiống nhau pH tối thích cho họat động của α-amylase từ nấm sợi là 4.5-4.8, của đạimạch nảy mầm và thóc mầm là 5.3 và của vi khuẩn là 5.8-6 pH tối thích cho họatđộng dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm enzym amylase cũng khác nhau nhưngthường nằm vùng pH của acid yếu

Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau α-amylase của nấm sợibần vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac subtillis Ở pH

3,6 và 00C , α-amylase của malt bị vô họat hòan tòan sau 15-30 phút ; α-amylase vikhuẩn bị vô họat 50%; trong khi đó họat lực của α-amylase của nấm sợi hình nhưkhông giảm bao nhiêu Trong dunh dịch, α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH 5-5,5;

α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH 2,5-2,8 Ở 00C và pH 2.5nó chỉ bị vô họat hòan tòan sau 1 giơ Ngòai α-amylase không bền acid ra, các loại

nấm sợi, Asp awamori, Asp usamii còn tạo tới 5-10% α-amylase bền acid Trong khi

đó nấm sợi Asp niger 475 lại chỉ tạo ra có một mình α-amylase bền acid Ở pH <4

α-amylase vi khuẩn bị vô họat hòan tòan α-amylase của nấm bền ở vùng Ph 5,3-8còn α-amylase của vi khuẩn bền ở khỏang 5-10 Nhiệt độ tối thích cho họat động xúctác vủa α-amylase từ các nguồn khác nhau thì cũng không đồng nhất, α-amylase củanấm sợi r6át nhạy đối với tác động của nhiệt, trong đó amylase của vi khuẩn là bềnnhiệt hơn cả (nhiệt độ tối thích là 70-750C ) chịu được nhiệt độ lên tới 920C

Trong dung dịch hồ tinh bột, α-amylase vi khuẩn chỉ bắt đầu bị vô họatnhanh khi nhiệt độ cao hơn 770C Ở 700C α-amylase của nấm sợi bị mất 50% hoạt lựccòn amylase của malt hầu như chưa bị mất họat lực

Trong dung dịch đệm pH 4.7, α-amylase của Asp oryzae rất nhạy với tác

động cảu nhiệt độ cao, thậm chí ở 400Ctrong 3 giờ họat lực dextrin hóa của nó chỉcòn 22-29%, họat lực đường hóa còn 27-85% Ở 500C trong 2 giờ α-amylase của nấmnày bị vô họat hòan tòan α-amylase của vi khuẩn có thể giữ được một phần họat lựcthậm chí ngay cả khi đun sôi trong nước một thời gian ngắn Tính bền nhiệt cao củaamylase vi khuẩn là một ưu điểm lớn Trong một lọat sản xúât, amylase vi khuẩnđược sử dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đọan phải dùng nhiệt độ cao

Những khác biệt về tính chất và mức độ thủy phân và đặc tính thủy phân cûua

α-amylase từ các nguồn khác nhau đang mở ra nhiều khả năng to lớn trong việc ứngdụng chúng một cách thích hợp và đầu hiệu quả ở các giai đọan khác nhau của quátrình sản xuất

3.1.2/ Đặc tính của vi sinh vật tổng hợp nên α -amylase :

Bac subtilis là vi khuẩn

được ứng dụng nhiều

trong sản xuất enzym và

các hóa chất đặc biệt

như: amylase, protease, inosine, ribosides, and amino acids Bacillus subtilis là khuẩngram dương, được tìm thấy trong đất, là 1 khuẩn que Có khả năng thành lập 1 dạngnội bào tử mạnh hơn bảo vệ, cho phép sinh vật chịu được những điều kiện ngọaicảnh khắc nghiệt, không phải là sinh vật hiếu khí bắt buộc

Bacillus subtilis sán xuất enzym tiêu hóa protein subtilis, đây được xem như 1 cơsở tiềm tàng để chữa bệnh ung thư Bào tử của Bacillus subtillis có thể chịu nóng tốt

ở nhiệt độ nấu ăn, gây ra sự đặc quánh làm hỏng bánh mì

Bacillus sibtilis có thể bị chia cắt không đối xứng, sản xuất ra những nội bào tửkháng cự những yếu tố bên ngòai như nhiệt, axit, muối, tồn tại lâu trong môi trườngsuốt thời gian dài Nội bào tử hình thành do sự thiếu dinh dưỡng, giúp vi sinh vật tồntại lâu đến khi môi trường sống thuận lợi hơn

Bacillus subtilis chịu ảnh hưởng cao của di truyền, được dùng làm mô hình vikhuẩn trong phòng thí nghiệm, dùng như vi khuẩn gram dương của trực khuẩn ruộtgià

Những men được sản xuất từ Bacillus subtilis được dùng nhìêu để làm phụ giathuốc tẩy

Ứng dụng:

 Mô hình thí nghiệm Sinh học

 Biến dạng của nó là vi khuẩn que natto được dùng để sản xuất natto của NhậtBản và thức ăn cheonggukjang của Hàn quốc

 Trừ kí sinh nấm tự nhiên, được dùng như 1 chất kiểm tra sinh học.

 Chuyển đổi những chất nổ hạt nhân thành những hỗn hợp nitơ vô hại, CO2 và

H2O

 Tham gia tiêu hủy những đồng vị phân vị an tòan của Plutonium và Thprium

 Những chất tái tổ hộp Bacillus subtilis như pBE2C1AB được dùng để sản xúâtpolyhydroxyaloctest (PHA)

Bacillus subtilis có 4120 gen, trong đó có 192 gen rất cần thiết 79 gen quan trọng

Đa số những gen quan trọng phân bố ở khu vực trao đổi chất của tế bào, trong đó ½tham gia xử lý thông tin, 1/5 tham gia tổng hợp thành tế bào, định hình thành tế bào.Những gen này có mặt trên khắp tế bào, trên 1 phạm vi rộng mà 70% trong số đĩ cóthể tìm thấy trong Archaea và Eucarya

b/ Bacillus coagulans:

- vi khuẩn gram dương

- kỵ khí không bắt buộc

- có khả năng làm hư thực phẩm chứa axit ( có thể

xuất hiện gram âm) khi vào pha ổn định của sự

phát triển

- cũng như các lòai khác của giống Bacillus thì Bac

coagulans cũng tạo nội bào tử

- có khả năng chịu đựng các tác nhân vật lý và hóa

chất Nhiệt độ tối thích cho sự sinh trưởng là 370C Bac coagulans có khả năng dichuyển pH tối thích cho sự sinh trưởng là khỏng 4,2

c/ Bacillus cereus:

- vi khuẩn dạng que,

- là vi khuẩn gram dương

- hiếu khí bắt buộc

- Có thành tế bào lớn và không làm bào tử phình lên

Bacillus cereus trong môi trường máu

Bacillus cereus khuẩn que

Điều này cũng những đặc trưng hóa sinh khác được dùng để phân biệt BacillusCereus Cả Bacillus Thringiensis và Bacillus anthrasis cũng có tính chất này Việcxác định các vi khuẩn này chủ yếu dựa vào những biến đổi (đa số Bacillus Cereus dichuyển được), sự có mặt của những tinh thể độc tố ( Bacillus thrungiensis), sự hoạtđộng của Hemolytic ( Bacillus Cereus, còn Bacillus anthrasis là nonhemolytic) Sựtăng trưởng dạng rễ là đặc trưng của Bacillus Cereus

d/ Các loài vi khuẩn tổng hợp khác :

Đặc tính : là vi khuẩn gram dương , di chuyển được , kỵ khí không bắt buộc

Bacillus licheniformis chủ yếu dùng để sản xuất thuốc kháng sinh.

 Micrococcus :

Đặc tính : là giống vi khuẩn gram dương ,

aerobic, không di chuyển đựơc Gồm nhiều lòai như :

+ Micrococcus luteus : liên quan đến sự hư hỏng

cảu sản phẩm làm từ cá

+ Serratia fonticola :di chuyển nhờ roi có vành lông rung

+ Serratia marcescens : là vi khuẩn có ảnh hưởng tới sự giảm của kitin

3.1.2.2/ Loại naám:

a/ Aspergillus niger:

Aspergillus Niger

- Đây là loài nấm phát triển nhanh, sản sinh khuẩn lạc màu đen khi ủ ở 25

độ C trong 10 ngày Nó sinh ra mùi mốc Loài nấm này phân bố rộng khắp Nó đượcphân lập từ đất, không khí, cát biển, đầm lầy, sợi cây đước, nước ngọt chứa nguồn hữu

cơ, nước bùn, thực phẩm, đặc biệt là trái cây và rau… Nó xuất hiện chủ yếu như là tácnhân gây ra nhiễm trùng mãn tính và thỉnh thoảng gây ra bệnh nấm phổi

- Hiện nay người ta sử dụng rộng rãi loài Aspergillus niger trong công nghiệp

thực phẩm và một số ngành kinh tế khác để thu axit hữu cơ và enzym

-Loài Aspergillus phân bố rất nhiều trong tự nhiên, ở đất, ở xác thực vật, hoa quả

và đặc biệt có nhiều ở vùng có khí hậu ấm áp Một trong những chủng của loài đó được

nghiên cứu kĩ trong các phòng thí nghiệm và qua quá trình sản xuất là Aspergillus niger.

Chủng này trong quá trình phân hủy các chất gluxit và các chất khác có khả năng tíchluỹ ở môi trường một lượng axit hữu cơ và enzym khá lớn

- Asp niger này phát triển mạnh trong môi trường thạch malt, các khuẩn lạc bao

gồm các màu cơ bản là màu trắng hoặc vàng mọc thành từng lớp dày đặc với đầu màunâu tối hoặc màu đen và tạo thành bào tử dài khoảng 7-10µm, trong một số trường hợp

có thể dày tới vài mm về chiều dài và có thể hơn 20µm về đường kính, khuẩn lạc có màuđen, trên những cuống bào tử có vô số những bào tử Những bào tử này có thể nhìn rõqua kính hiển vi Hình dạng của cuống bào tử đính và sự hình thành hắc tố là điểm đặc

trưng của Aspergillus niger Cuống bào tử có 2 phần:

o Phần thứ nhất: dài và to, có kích thước khác nhau, khoảng 10-20 µm vềchiều dày

o Phần thứ hai ngắn hơn khoảng 2-3 µm, có màu nâu nhạt hay hoàn toàn đen

- Đầu bào tử được chia thành 2 phần bởi vách ngăn: phần dạng túi màu nâu mọc ởtrên và phần cuống ở dưới Bào tử tự do có dạng cầu hoặc gần cầu, đường kính 3,5-5

µm, có thành nhám, màu nâu tối hoặc màu đen

Các khối thuộc giống nấm này phát triển tối ưu ở khoảng nhiệt độ từ 25 đến 300C

và có thể nhanh chóng bao phủ cả môi trường sống của chúng Những khối nấm có thểđạt chiều cao tới vài xentimet với màu trắng và sợi lông màu có lõi màu nâu nhạt.Những khối nấm già sẽ có màu xám hoặc nâu do sự tạo thành bào tử

Các đặc tính vi mô

Những khối nấm này phát triển rất nhanh, từ lớp lông nhung thành lớp lông măng,

từ màu trắng thành màu vàng, và chuyển sang màu xám tối do sự phát triển của túi bào

tử Loài Sporangiophores dạng thẳng, một sợi hoặc nhiều nhánh, càng về cuối càng lớnvới đường kính từ 60-300 µm; đỉnh khối cầu, là túi bào tử chứa rất nhiều bào tử, không

có mấu, và được giữ vững trên cuống Những tàn dư của lớp túi bào tử thường thấy ởphần gốc cuống nối tiếp với túi bào tử sẽ theo bào tử túi phát tán đi xa Túi bào tử làtrong suốt, bên trong màu xám hoặc nâu, hình cầu hoặc hình bầu dục, có vách mịn.Không có thân bò lan và rễ giả, tuy nhiên chlamydoconidia và hợp tử có thể xuất hiện

Túi bào tử - bào tử túi của Mucor

c/ Rhizopus:

Giống Rhizopus được mơ tả với đặc điểm cĩ mặt thân bị lan và rễ giả, sự hình thànhcủa một cây nấm hay một chùm cây nấm từ những nút gắn trực tiếp trên rễ giả, các mấu,cuống, các bào tử, và túi bào tử hỉnh cầu Sau khi phát tán bào tử, các mấu và cuống sẽsụp xuống để hình thành một cấu trúc giống như chiếc dù Túi bào tử hình cầu hoặc hìnhtrứng, thể đơn bào, lớp vỏ trong suốt, bên trong màu nâu và ở nhiều lồi cịn cĩ nếpnhăn Những khối nấm phát triển rất nhanh và phủ dày đặc trên bề mặt agar mà ban đầu

là những đốm trắng chuyển thành màu xám hoặc màu nâu vàng nhạt do quá trình hìnhthành bào tử

Đặc tính của Rhizopus oryzae :

Tiêu biểu là Rhizopus oryzae hay cịn gọi

là Rhizopus arrhizus, là đại diện chung nhất

R oryzae được phân bố ở khắp mọi nơi mà

thường gặp nhất ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt

đới Nĩ được cơ lập từ nhiều chất nền như

những bãi rác rưỡi, cặn bã do phân hủy cây

cỏ, thực phẩm, và phân động vật, chim chĩc…

R oryzae thường được dùng trong sản xuất

thức ăn và đồ uống cĩ cồn ở các nước

Indonesia, Trung Quốc và Nhật Bản Tuy

nhiên, nĩ cũng sản sinh ra chất alkaloid

agroclavine trong hạt cựa lúa mạch, một độc tố đối với con người và động vật

Trên những sản phẩm thủy phân của Sabouraud của agar, những khối nấm phát triển rấtnhanh ở 250C và cao khoảng 5-8 mm, rồi sụp xuống Những cây nấm dài khoảng 1500

µm và rộng khoảng 18 µm, thành trơn, khơng vách ngăn, một hoặc nhiều nhánh, mọclên thành thân bị lan từ rễ giả thành chùm từ 3 cây nấm trở lên Túi bào tử hình cầu, gốcthường dẹp, màu xám đen, đường kính khoảng 175 µm và chứa rất nhiều bào tử Cuống

và mấu gắn vào túi bào tử hình cầu hoặc hình oval, rộng khoảng 130 µm và sẽ sụpxuống tạo thành cấu trúc hình chiếc dù sau khi phát tán bào tử Chúng tăng trưởng tốtnhất ơ 400C, và khơng phát triển được ở 450C

Cuống bào tử và túi bào tử của R oryzae

Mơi trường sống tự nhiên

Giống Acremonium là đều lưỡng hình nhiệt, thường được cơ lập từ đất trồng trọt.Hình thức sinh sản của giống này chưa được xác định rõ Người ta xếp chúng vào ngànhAscomycota vì chúng cĩ cấu trúc tương tự như các giống thuộc ngành này

Các đặc tính vi mơ

Các sợi nấm trong suốt cĩ vách ngăn, thường là những sợi nấm sinh dưỡng, khơngphân nhánh, đơn độc, dạng thẳng đứng Chúng thường xuất hiện thành bĩ, là đơn bàohoặc đa bào, tế bào hình thoi với sợi mảnh uốn cong Cấu trúc và hình dạng của bào tửdính tùy thuộc vào từng lồi Lồi Acremonium falciforme thường sản sinh bào tử dínhhình lưỡi liềm và khơng vách ngăn; trái lại, bào tử của lồi Acremonium kiliense thẳng

và ngắn

Nấm Penicillium ở 250 C

Mơi trường sống tự nhiên

Các thành viên của giống Penicillium đều là nấm sợi (chỉ trừ Penicillium marneffei,

là lồi lưỡng hình nhiệt) Nấm Penicillium rất phổ biến, cĩ thể tìm thấy chúng ở trongđất trồng, trong xác bã cây cỏ bị phân hủy, và trong khơng khí

Các lồi

Giống Penicillium cĩ rất nhiều lồi Trong đĩ phổ biến nhất là các lồi nhưPenicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Penicillium janthinellum, Penicilliummarneffei, và Penicillium purpurogenum Dựa vào các đặc tính vi mơ và hình thái học vĩ

mơ để xác định cấp độ của từng lồi

Các đặc tính vĩ mơ

Khối nấm của các lồi thuộc giống Penicillium phát triển rất nhanh, cĩ nhiều sợinhỏ, và màu thẫm, như lớp lơng mịn Ban đầu, những khối nấm này màu trắng, chuyểnsang màu xanh lam, màu xanh xám, màu lục vàng, màu vàng hoặc màu hồng nhạt

Đối với lồi P.marneffei, là lồi lương hình nhiệt, sản sinh ra khối nấm cĩ nhiều sợinhỏ, phẳng dẹp và cĩ rãnh khi ở nhiệt độ 250C Khối nấm cĩ màu xanh xám viền trắng

Ở 370C, khối nấm hĩa kem màu hồng nhạt và nhẵn nhụi, khơng cịn những sợi nhỏ, quấnxoắn lại với nhau

Penicillium ở 35 0 C

Penicillium pengo

Penicillium và các loài nấm mốc khác trong môi trường nuôi cấy vô trùng

Penicillium

Penicillium_atramentosum

3.2/ β -amylase: ( α -1,4-glucan-mantohidrolase)

3.2.1/ Đặc tính enzym:

β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4-glucan trong tinh bột,glucogen và polysaccharide đồng lọai, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầukhông khử của mạch Maltose tạo thành có cấu hình β, vì thế amylase này được gọilà β-amylase

Theo đặc tính tác dụng lên tinh bột, β-amylase khác α-amylase ở một số điểm: nóhầu như không thủy phân hạt tinh bột nguyên lành mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinhbột β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose và phân giải 54-58%amylopectin thành maltose Qúa trình thủy phân amylopectin được tiến hành từ đầukhông khử của các nhánh ngòai cùng Mỗi nhánh ngòai có từ 20-26 gốc glucose nêntạo thành được 10-12 phân tử maltose Khi gặp liên kết α-1,4-glucoside đứng kế cậnliên kết α-1,6-glucoside thì β-amylase ngừng tác dụng Phần saccharide còn lại làdextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,4-glucoside và được gọi là β-dextrin cho màu tím đỏ với iodine Độ nhớt của dunh dịch giảm chậm Tác dụng của

β-amylase lên tinh bột có thể biệu hiện bằng sơ đồ sau:

Tinh bột β-amylase 54-58% maltose + 42-46% β-dextrin

Nếu cho cả α-amylase và β-amylase cùng đồng thời tác dụng lên tinh bột thì tinhbột bị thủy phân tới 95% β-amylase là một albumin Trung tâm xúc tác của nó cóchứa các nhóm –SH và nhóm –COOH cùng với vòng imidazol của các gốc histidin

β-amylase là enzym ngoại phân tử ( exoenzym ), có ái lực với các liên kết αglucoside cách đầu không khử của mạch một liên kết α-1,4

-1,4-Khác với α-amylase, nó rất bền khi không có Ca2+, β-amylase bị kìm hãm bởi

Cu2+, Hg2+, urea, iodoacetamide, iodine, ozon… pH tối thích trong dunh dịch nấu(không sôi ) là 5,6 Nhiệt độ tối thích trong dunh dịch tinh bột thuần khiết 40-500C,song trong dịch nấu lại là 60-650C, β-amylase bị vô họat ở 700C β-amylase chỉ phổbiến trong thế giới thực vật, đặc biệt có nhiều trong các hạt nảy mầm Trong vikhuẩn không có β-amylase

3.2.2/ Đặc tính của vi sinh vật tổng hợp nên β -amylase :

-Một hoặc nhiều tiêm mao có cực,có khả năng chuyển động

-Vi khuẩn hiếu khí

-Không có sự tạo thành thể nhân

-Kiểm tra hoạt động bằng enzym catalase

Những đặc tính khác liên quan đến một vài loài vi khuẩn trong họ (mặc dùcũng có nhiều ngoại lệ) bao gồm sự bài tiết của pyoverdin (còn có tên khác là

fluorescein) Một vài loài Pseudomonas cũng có thể sản xuất ra siderophore như là

: pyocyanin bởi

Pseudomonas aeruginosa và thioquinolobactin bởi Pseudomonas fluorescens.

Những loài Pseudomonas cũng cho kết quả đặc trưng khi thí nghiệm với enzym

oxidase (sự thiếu glucose trong quần thể do glucose đã bị oxy hóa hoặc lên men)

Giới: Vi khuẩnNgành: ProteobacteriaLớp Gamma ProteobacteriaBộ: PseudomonadalesHọ: PseudomonadaceaeChi: Pseudomonas

Tính chất kháng thuốc kháng sinh

Là một vi khuẩn gram âm, hầu hết Pseudomonas spp chống lại penicillin một

cách tự nhiên nhưng lại dễ bị ảnh hưởng bởi piperacillin, imipenem, tobramycin,hay ciprofloxacin

Chúng có khả năng sống được trong điều kiện khắc nghiệt là do có thành tế

bào dày Sự kháng lại thuốc kháng sinh là do đặc điểm của “efflux pumps” được gọi là “ABC transpotersí, chính cái này đã phun ra chất kháng lại thuốc trước khi

vi khuẩn bị tấn công

Mầm bệnh do loài Pseudomonas

Gây bệnh trên động vật

- P.aeruginosa là một bệnh cơ hội ở người, chúng gây ra bệnh xơ nang,

AIDS là bệnh rất thường gặp do vi khuẩn này gây ra Sự nhiễm trùng có nhiềuđường khác nhau, nhưng qua đường hô hấp là thường thấy nhất gây bởi vi khuẩn

Pneumonia (viêm phổi) trị bệnh này rất khó phải dùng cùng lúc nhiều thuốc

kháng sinh

- P.oryzihabitans, cũng lây nhiễm ở người, mặc dù rất hiếm Chúng gây

nên bệnh chứng viêm màng bụng, nhiễm trùng máu

- P.plecoglossicida là loài gây bệnh ở cá, gây bệnh băng huyết.

Gây bệnh trên thực vật:

- P.syringae gây bệnh trên cây nhiều lứa quả, tồn tại khoảng 50 bệnh lý

khác nhau, và phần nhiều trong số chúng đã chứng minh mức độ cao của tínhchuyên hóa cây chủ Có rất nhiều loài Pseudomonas gây bệnh trên thực vật, đáng

kể là tất cả thành viên của nhóm phụ P.syringae, nhóm này được biết đến nhiều và

được nghiên cứu cũng rất nhiều

- Mặc dù không hoàn toàn gây bệnh trên thực vật, nhưng nhóm P tolaasii

cũng gây nên những vấn đề nghiêm trọng trong nông nghiệp khi chúng ảnh hưởngđến quá trình nhân giống nấm

Sử dụng tác nhân diều khiển:

Từ giữa thập kỷ 80, một vài thành viên của Pseudomonas đã dược ứng dụngtrong hạt giống ngũ cốc, hoặc dùng tực tiếp cho đất trồng như là một cách để ngăn

cản sự phát triển của những loài gây bệnh cho vụ mùa Dùng giống Pseudomonas

fluorescens làm tác nhân điều khiển là cách tốt nhất, mặc dù nó không chính xác

hoàn toàn tuy nhiên thực vật được kích thích phát triển Nhiều ý kiến nói rằng,dùng vi khuẩn này sẽ cản trở vòng tuần hoàn lớn ở thực vật chủ