IV/ THU NHAƠN ENZYM AMYLASE TỪ VI SINH VAƠT:
4.2.4/ Ạnh hưởng cụa pH nguyeđn lieơu :
Khi nuođi cây baỉng pương pháp beă maịt pH mođi trường ạnh hưởng ít , do mođi trường có dung lượng đeơm cao và hàm aơm thâp , pH khođng thay đoơi mây trong quá trình nuođi . Tuy nhieđn , pH ban đaău cụa mođi trường cũng ạnh hưởng khođng nhỏ tới sự phát trieơn cụa nâm môc và sự táo enzym . Nêu dùng nước máy đeơ làm aơm cám thì pH mođi trường là 5-6 . Nêu dùng HCl , H2SO4 và lactic acid đeơ làm aơm mođi trường thì pH cụa cám aơm xuông tới 4,5-5 táo đieău kieơn chĩn lĩc cho nâm môc phát trieơn (đa sô nâm môc sinh trưởng tôt và táo anyzm trong mođi trường acid yêu ) trong khi đó vi khuaơn haău như khođng có theơ phát tri6ẹn ở đieău kieơn này . Ở pH 4,5-5 nâm môc táo heơ amylase tôt nhât , thụ mới đên heơ pectinase còn proteinase thì kém hơn theơ hieơn ở bạng.
Các chât làm aơm cám mì tới đoơ aăm
60%
pH Hĩat đoơ enzym trong môc thành
phaơm đv/g
Mođi trường Môc thành phaơm
α-
amylase glucosidaseOligo-1,6- maltase Trước thanh trùng Sau thanh trùng Nước máy HCl(0,1N) HCl(0,2N) HCl(0,25) HCl(0,3N) 6 5 4,5 4 3,6 6,1 6,7 6,8 6,1 6 6 6,7 6,8 6,1 6 25 27,3 24,7 10,4 8,7 1008 1230 1172 1100 1130 130 134 127 134 133
Đôi với Asp. awamori pH ban đaău là 6,3 thì nâm môc táo α-amylase cực lớn. Nêu pH ban đaău là 3 thì nâm sợi sẽ táo nhieău oligo-1,6-glucosidase và α- 1,4-amyloglucosidase, còn pH = 7,4 thì sinh toơng hợp cạ Bac. subtilis enzym đeău giạm. Đôi với vi khuaơn pH tôt nhât đeơ táo enzym là 6.6-7.4.
4.2/ Các phương pháp thu nhaơn enzyme amylase:
Muôn thu được các enzym amylase với hieơu suât cao caăn phại tiên hành phađn laơp và chĩn giông vi sinh vaơt đeơ tuyeơn lây những chụng hĩat đoơng mánh, đoăng thời phại tiên hành lựa chĩn cơ chât cạm ứng và thành phaăn mođi
trường tôi thích cũng như tieđu chuaơn hóa các đieău kieơn nuođi. Như vaơy là sự toơng hợp enzym amylase khođng những chư phú thuoơc vào các tính chât di truyeăn cụa vi sinh vaơt mà còn phú thuoơc vào vieơc tuyeơn chĩn các đieău kieơn nuođi đaịc hieơu.
Ngòai các yêu tô hóa hĩc (thành phaăn mođi trường ) ra , các đieău kieơn lý hóa quạ quá trình nuođi cũng có moơt ý nghĩa rât lớn đôi với sinh toơng hợp các enzym amylase. Người ta đã chứng minh raỉng có theơ dùng đieău kieơn nuođi khác nhau đeơ thu các chê phaơm có tỷ leơ và thành phaăn enzym khác nhau ở quy mođ cođng nghieơp. Ví dú, có theơ dùng Bac. subtilis đeơ thu chụ yêu là phức heơ amylase hoaịc chụ yêu là phức heơ protease.
Trong sô những yêu tô có ạnh hưởng lớn đên sinh toơng hợp các enzym amylase trong quá trình nuođi vi sinh vaơt , thì thành phaăn mođi trường , tính chât cơ lý cụa mođi trường , đoơ tieđït trùng , đoơ aơm ban đaău , đoơ thóang khí , nhieơt đoơ nuođi và pHmođi trường … là những yêu tô cơ bạn tôi quan trĩng . Có hai phương pháp nuođi vi sinh vaơt là phương pháp beă maịt (phương pháp noơi) và phương pháp beă sađu (phương pháp chìm ). Phương pháp nuođi quyêt định sơ đoă cođng ngheơ nuođi.
Moơt sô yeđu caău đôi với thành phaăn và tính chât cơ lý cụa mođi trường cung là các đieău kieơn nuođi có ạnh hưởng trực tiêp đên sinh toơng hợp các enzym amylase baỉng vi sinh vaơt .
Nuođi vi sinh vaơt táo amylase baỉng phương pháp beă maịt :
Yeđu caău đôi với thành phaăn mođi trường dinh dưỡng . Yeđu caău cơ bạn đôi với thành phaăn cụa mođi trường nuođi vi sinh vaơt táo amylase cũng giông như yeđu caău đôi với mođi trường nuođi vi sinh vaơt táo các enzym khác là tính hòan thieơn . Haău hêt vi sinh vaơt táo amylase đeău hâp thú carbon chụ yêu ở dáng các hợp chât hữu cơ (tinh boơt , deztrin…) hydro ở dáng H2O và cụa các hợp chât hữu cơ , oxy ở trong thành phaăn câu tử cơ bạn cụa mođi trường và ở dáng oxy phađn tử.
Câu tử chính cụa mođi trường vi sinh vaơt táo amylase baỉng phương pháp beă maịt là cám mì , cám gáo . cám mì , cám gáo là nguyeđn lieơu hòan hạo và có theơ là moơt câu tử duy nhât cụa mođi trường đeơ nuođi vi sinh vaơt khođng boơ sung theđm các chât khác nữa . cám mì có 16-22% tinh boơt , 10-12% protein , trong đó có các amino acid quan trĩng như methionine (0,19%) , cystine (0,3%) , arginine (1%), lysine (6%) , trytophan (0,3%) , 3-4% chât béo , 10,3 % celulose , các nguyeđn tô tro (Na-0,09% , K-1% ,Ca-0,16% , P-0,94%) và nguyeđn tô vi lượng cùng các chât khác . Cám gáo có khỏang 20% tinh boơt 10-15% chât béo , 10- 14% protein , 8-16% celulose , các chât hòa tan khođng chứa nitơ (37-59%).
Chât lượng cụa cám gáo , cám mì có ạnh hưởng lớn tới hĩat lực cụa các enzym amylase . Cám khođng được chứa tinh boơt dưới 20-30% . Neđn dùng cám tôt , cám mới khođng có dư vị chua hay đaĩng , khođng hođi mùi môc . Đoơ aơm cụa cám khođng quá 15% , táp chât đoơc khođng quá 0,05%... Tuy là phê lieơu cụa cođng nghieơp xay xát , nhưng cám cũng tương đôi đaĩt tieăn , hơn nữa trong quá trình nuođi vi sinh vaơt , các chât dinh dưỡng khođng được sử dúng hêt , vì thê có theơ thay cám baỉng moơt sô câu tử deê tieăn hơn . Câu tử boơ sung được đưa vào có theơ là chât làm xôp mođi trường hoaịc làm giàu theđm các chât dinh dưỡng và chât sinh trưởng mà cám khođng có đụ . Các câu tử này thường là maăm mách (15-20%) , trâu (2-25%) , mùn cưa (5-10%) … Có theơ dùng caịn bã canh trường raĩn (sau khi trích ly enzym) làm câu tử chính cụa mođi trường , đạm bạo chê đoơ đoơ tieơt trùng . Cám và các chât phú gia chứa nhieău bào tử vi sinh vaơt khác neđn caăn phại thanh trùng đeơ đạm bạo chúng nuođi phát trieơn bình trường và canh trường sạn xuât khođng chứa vi sinh vaơt ngối lai. Caăn thanh trùng dưới áp suât hơi 1-1,5 atm trong vòng 4-6 giờ , có theơ thanh trùng baỉng hơi nóng ở nhieơt đoơ 1200C trong 90 phút . Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin (40%) và 0,8% HCl kỹ thuaơt theo khôi luợng mođi trường.
Đoơ aơm tôi thích cụa mođi trường : trong đieău kieơn sạn xuât , đoơ ạm ban đaău tôi thích (đôi với Asp. niger , Asp. awamori , Asp. flavus, Asp. oryzae) cûua mođi trường là 58-60% và phại giữ cho mođi trường có đoơ aơm đó trong suôt quá trình nuođi . Đoơ aơm mà taíng quá 55-70% sẽ làm giạm đoơ thóang khí , còn thâp hơn 50-55% thì kìm hãm sinh trưởng và phát trieơn cụa vi sinh vaơt cũng như sự táo enzym amylase . trong đieău kieơn tieơt trùng tôt (mođi trường hình tam giác , trong tụ âm phòng thí nghieơm hốt lực amylase cao nhât thu được ở đoơ aơm 65-68%). Caăn nhớ raỉng khi nuođi trong đieău kieơn khođng được vođ trùng tuyeơt đôi (tređn các khay ) , thì đoơ aơm mođi trường sau khi cây giông khođng được vượt quá 60% , vì cao hơn nữa sẽ deê bị nhieêm khụađn . Tuy vaơy , vieơc giữ được đoơ aơm cao (vieơc phòng ngừa và hán chê sự hong khođ cụa canh trường ) trong suôt quá trình sinh trưởng cụa nâm sợi lái còn có ý nghĩa to lớn hơn đôi với sự táo thành enzym. Ạnh hưởng cụa đoơ aơm mođi trường đên sinh toơng hợp enzym amylase được trình bay trong bạng sau :
Phương án thí nghieơm
20 giờ 34 giờ 42 giờ
Đoơ aơm % Hĩat đoơ amylase đv/g canh trường khođ Đoơ aơm % Hĩat đoơ amylase đv/g canh trường khođ
Đoơ aơm %
Hĩat đoơ amylase đv/g canh trường khođ
Khay đaơy naĩp 4,4 20,4 42,4 32,9 42,4 36,7 Qua bạng sô lieơu tređn thây rõ là hĩat lực α-amylase cụa canh trường nuođi nâm sợi , khi bị hong khođ giạm gaăn hai laăn . Đieău đó khẳng định sự caăn thiêt phại giữ aơm cho mođi trường ở mức đoơ tôi thích . Caăn thođng khí lieđn túc trong suôt thời kỳ sinh trưởng cụa vi sinh vaơt . Trong quá trình sinh trưởng cụa mình vi sinh vaơt tieđu thú 25-35% chât dinh dưỡng cụa mođi trường và thại ra moơt lượng lớn nhieơt sinh lý và CO2. Vì vaơt caăn phại thại nhieơt này baỉng thođng gió với khođng khí vođ trùng có đoơ aơm tương đôi khỏang 100% . Chê đoơ thođng khí có theơ lieđn túc. gián đĩan (hoaịc khođng khí tự nhieđn ) tùy thuôc vào chieău dày cụa lớp mođi trường nuođi, vào khỏang cách giữa các taăng khay và đáy khay. Thường là ở giai đĩan sinh trưỡng thứ nhât phại thođng khí vào phòng nuođi khoạng 4-5 laăn theơ tích khođng khí tređn moơt theơ tích phòng trong moơt giờ, còn ở giai đĩan thừ hai là 30-60 theơ tích khođng khí tređn theơ tích phòng nuođi / 1 giơ , còn ở giai đïoan thứ ba giạm đi chư còn 10-12 theơ tích khođng khí mà thođi.
Nhieơt đoơ nuođi : tòan boơ chu kỳ sinh trưởng cụa nâm môc tređn cám có theơ chia làm ba thời kỳ :
+ Thời kỳ trương và nạy maăm cụa đưnh bào tử (đôi với nâm môc 10-11 giờ đaău tieđn , đôi với vi khuaơn 3-4 giờ ). Trong thời kỳ này phại đôt nóng khođng khí phòng nuođi và giữ cho nhieơt đoơ phòng nuođi khođng thâp hơn 23-300C đôi với nâm môc và duy trì nhieơt đoơ 32-380C cho vi khuaơn . Đoơ aơm tương đôi cụa khođng khí là 96-100%.
+ Thời kỳ sinh trưởng nhanh cụa heơ sợi (kéo dài trong vòng 4-18 giờ ). Ở giai đĩan này nâm môc hođ hâp rât mánh và táo ra moơt lượng nhieơt sinh lý rât
Asp. awamori 22 ), Bacillus subtilis . Mođi trường thích hợp nhât và táo nhieău
amylase ở nhieơt đoơ 370C . Moơt sô vi khuaơn khác lái có nhieơt đoơ sinh trưởng tôi
thích cao hơn . Bac. circulans phát trieơn mánh ở nhieơt đoơ 65-700C song lái táo
nhieău amylase hĩat đoơng ở 500C vì vaơy người ta thường cây giông ở nhieơt đoơ
700C còn tiên hành cho tích lũy amylase ở 500C nuođi giông ở nhieơt đoơ 700C còn
tiên hành cho tích lũy amylase ở 500C nuođi chụng lĩai này baỉng mođi trường
lỏng có nước nâu khoai tađy , pepton và phân . Nhieơt đoơ nuođi có ạnh hưởng rât
lớn tới đoơ beăn nhieơt cụa enzym táo thành amylase cụa Bac. coagulans và Bac.
stearothermophilus được nuođi ở 350C và 550C có đoơ beăn nhieơt khác xa nhau .
Khi giữ ở 900C trong 1 giờthì amylase cụa chúng sinh trưởng ở nhieơt đoơ 350C bị
mât 90-94% hĩat đoơ ban đaău , trong lúc đó amylase cụa chúng nuođi ở đoơ 550C
chư bị vođ hĩat có 10-12% . Các vi sinh vaơt ưa nhiêt (vi khuaơn ) sinh toơng hợp
neđn các amylase beăn nhieơt . Enzym với đoơ beăn nhieơt cao có ưu thê lớm trong nhieău lĩnh vực sạn xuât . Ngòai ra nuođi vi khuaơn ưa nhieơt lái rât tieđn lợi cho sạn xuât cođng nghieơp . Vì nuođi ở nhieơt đoơ cao táo ra đieău kieơn chĩn lĩc và cho phép giạm bớt yeđu caău khaĩt khe veă đoơ tiêt trùng , đoăng thời khi nuođi đỡ bị nhieêm .
Súc khí và khuây troơn : phaăn lớn vi sinh vaơt táo amylase là những vi sinh vaơt hiêu khí . Vì vaơy sinh trưởng cạu chúng phú thuoơc vào lượng oxy phađn tử hòa tan trong dịch nuođi cây . Trong quá trình sinh trưởng cụa mình , vi sinh vaơt sử dúng oxy phađn tử cho hĩat đoơng sông neđn lượng oxy hòa tan trong mođi trường lỏng phại luođn luođn được boơ sung . Chính vì lẽ đó , vieđc súc khí và khuây đạo mođi trường có tacù dúng tôt tới sinh trưởng và tích lũy sinh khôi cũng nư sinh toơng hợp các enzym cuạ vi sinh vaơt .
Vieơc khuây đạo mođi trường dinh dưỡng torng quá trình nuođi vi sinh vaơt có theơ thức hieơn banỉg nhieău cách khác nhau :
-Súc khođng khí vođ trùng vào thiêt bị nuođi -Baỉng máy các kieơu chuyeđn dùng
-Baỉng tác dúng hieơp đoăng cụa cạ súc khí lăn máy khúađy -Baỉng tác dúng cụa các khí sinh ra khi leđn men.
Nhieău cođng trình nghieđn cứu đã xác nhaơn muôn nuođi vi sinh vaơt táo enzym ( cạ nâm sợi , nâm men và vi khuaơn ) có hieơu súađt cao thì phại khúađy đạo mođi trường baỉng súc khí hoaịc máy khuây làm vieơc lieđn túc trong suôt cạ quá trình nuođi . Vieơc chĩn chê đoơ súc khí thích hợp sẽ có tác dúng khá quyêt định khođng chư đôi với sự sinh trưởng và phát trieơn cụa vi sinh vaơt hiêu khí trong đieău kieơn nuođi chìm mà còn đôi với sự sinh toơng hợp enzym amylase nữa .
Đôi với nâm sợi , chê đoơ súc khí thích hợp là 10-12 m3 khođng khí vođ trùng (có nhieơt đoơ khođng cao quá 400C ) tređn 1 m3 mođi trường trong 1 giờ với thời gian nuođi trong khỏang 68-72 giờ . Với thời gian nuođi ngaĩn hơn ở các thùng leđn men nhađn giông (48 giờ) và trong các thùng leđn men sạn xuât (48-52 giờ) thì lượng khođng khí caăn súc vào mođi trường đeơ nuođi Asp. oryzae 3-9-15 phại là 30m3/m3 mođi trường / giờ đôi với thùng hađn giông và 40m3/m3 mođi trường / giờ cho thùng sạn xuât . Mức đoơ súc khí tôi ưu đeơ nuođi Asp. oryzae 3-9-15 tương ứng với 180 micromol O2/ lít mođi trường (noăng đoơ oxy hòa tan đo baỉng máy cực phoơ với đieơn cực kieơu clark ). Chụng này có vaơn tôc tieđu thú oxy hòa tan cực lớn vào cuôi pha sinh trưởng logarithm . Vaơn tôc tieđu thú O2 giạm daăn từ lúc baĩt đaău pha oơn định . Nuođi vi sinh vaơt ưa nhieơt đòi hỏi nhieău khođng khí hơn là nuođi vi sinh vaơt ưa aơm . Đieău này cũng deê hieơu thođi , bởi lẽ ở nhieơt đoơ tương đôi cao
(50-600C) , đoơ hòa tan cụa oxy trong mođi trường giạm xuông , maịc dù nhu caău cụa vi sinh vaơt ưa nhieơt veă oxy xho các phạn ứng oxy hóa có taíng leđn.
Người ta nuođi Bac. subtilis trong thùng nhađn giông (15 giờ ở 370C ) có cánh khuây làm vieơc lieđn túc và súc khođng khí vođ trùng vào mođi trường với lượng là 40m3/ m3 mođi trường / giờ . Còn nuođi vi khuaơn này trong thùng leđn men sạn xuât (trong 48 giờ ở 370C ) có cánh khuây làm vieơc lieđn túc và súc khođng khí vođ trùng với lượng 60m3/1m3 mođi trường / giờ . Thời gian nuođi vi sinh vaơt đeơ có lượng amylase cực lớn trong phương pháp nuođi chìm phú thuoơc vào đaịc tính sinh lý cụa chúng , vào phương pháp nuođi và moơt sô yêu tô lieđn quan . Vieơc xác định thời gian nuođi tôi thích cũng được tiên hành baỉng thực nghieơm . Chẳng hán người ta nuođi Asp. oryzae 3-9-15 trong thùng leđn men nhađn giông 48 giờ , còn nuođi trong thùng leđn men sạn xâut thì khỏang 48-52 giờ. Lượng giông đem cây vào thùng leđn men là 8-10 % so với theơ tích mođi trường dinh dưỡng.
Trong cođng nghieơp rượu , khi nuođi nâm Aspergillus baỉng phương pháp gián đĩan thì thời gian nuođi tôi thích là 68-72 giờ . Tuoơi cạu nâm tôt nhaẫt là 24-30 giờ và lượng vaơt lieơu gieo cây là 10% so với theơ tích mođi trường dinh dưỡng . Khi nuođi baỉng phương pháp tuaăn hòan lieđn túc và phương pháp dòng chạy lieđn túc , thời gian nuođi se 4 ngaĩn hơn rât nhieău (30-40 giờ) . Asp. awamori 22 sạn sinh glucoamylase cũng được nuođi trong thùng nhađn giông 48 giờ và nuođi trong thùng leđn men sạn xuât 52 giờ hay hơn nữa . Thời gian nuođi Bac. diastalicus (đeơ thu chê phaơm superbiolase dùng trong cođng nhieơp bia và cođng nghieơp deơt ) trong thùng nhađn giông cũng như thùng leđn men sạn xuât chư có ù 5-6 giờ . Thời gian nuođi Bac. subtilis trong thùng nhađn giông kéo dài 15 giờ , còn trong thùng sạn xuât tới 48 giờ với lượng giông cho vào là 10% so với theơ tích mođi trường dinh dưỡng . Đôi với Endomycopsis sp. thời gian nuođi đeơ có lượng amylase cực lớn phại tới 80 giờ.
•Moơt sô chê phaơm enzym thương mái:
STT Chê phaơm enzym Teđn thương mái Hãng sạn xuât
1 α-Amylase vi khuaơn Tenase
Optiamyl BAN Rapidase Miles lab Miles Kali-chemie Novo-nordisk Gist-brocades 2 α-amylase vi khuẩn chịu
nhiệt Termamyl Taka-them II Taka-lite Opti-therm Maxamyl Novo-nordisk Miles lab Miles Kali-chemie Gist-brocades 3 Amyloglucosidase Diazym Optidex AMG Spezym Amygase Miles lab Miles Kali-chemie Novo-nordisk
