ENZYME PECTINASE

- Độ bền vững của pectin trước các enzym pectinase sẽ được tăng lên khi có mặt của các cation, nhất là Al3+ và Fe3+ + Pectin hoà tan dưới tác dụng của kiềm loãng hay enzyme pectase sẽ gi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI BÁO CÁO VI SINH THỰC PHẨM

Giáo Viên: cô Lại Mai Hương Nhóm : Phạm Ngọc Anh Thy

Nguyễn Việt Hoài

Hoàng Thị Thoa

Phạm Trương Thị Thanh Thủy

Nguyễn Diệu Linh

Lê Thị Ngọc Đào

Tháng 4-2007

1

LỜI NÓI ĐẦU

Môn học vi sinh thực phẩm giúp ích rất nhiều cho chúng em trong việc mở rộng kiến thức của mình về thế giới nhỏ bé xung quanh ta, đồng thời còn tạo một nền tảng tri thức vững chắc cho chúng em về lĩnh vực chuyên môn của mình sau này.

Để hoàn thành được bài báo cáo này “ENZYME PECTINASE”, trứơc tiên chúng em xin chân thành cám ơn cô Hương đã giúp chúng em rất nhiều trong việc tìm tài liệu Cám ơn cô đã gợi mở cho chúng em hướng đi cơ bản, những yêu cầu thiết yếu cần có cũng như những điểm cần chú trọng trong một bài báo cáo.

Qua bài báo cáo “ENZYME PECTINASE”, chúng em đã thu được những kinh nghiệm quý báu qua những lần làm việc tập thể, cùng thảo luận và cùng đóng góp ý kiến Hơn nữa, chúng em đã tổng hợp được một đề tài rất thú vị, bổ sung thêm kiến thức cho mình và đồng thời, dùng để làm nguồn tư liệu về sau

MỤC LỤC

I Enzyme pectinase và cơ chất

1 Cơ chất pectin

2 Enzyme pectase

II Vi sinh vật tổng hợp pectase

III Nuôi cấy thu nhận pectinase

1 Nguyên liệu

2 Chuẩn bị môi trường

3 Phương pháp nuôi cấy

4 Thu nhận enzyme pectinase

5 Tinh sạch enzyme pectinase

6 Sản phẩm của enzyme pectinase

IV Ứng dụng của enzyme pectinase

1 Trong sản xuất rượu vang

2 Trong sản xuất nứơc quả

3 Trong sản xuất các mặt hàng từ quả

4 Trong sản xuất cà phê

5 Trong chăn nuôi

6 Trong trích ly dược liệu đông y

3

I ENZYME PECTINASE VÀ CƠ CHẤT:

1 Cơ chất pectin:

1.1 Cấu tạo pectin :

- Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, có cấu tạo từ sự kết hợp của các acid galacturonic qua các liên kết α -1,4-glucoside Tuỳ thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử từ 80.000 - 200.000

- Pectin là cơ chất của enzyme pectinase Pectin rất phổ biến trong thực vật, là hợp chất polimer tự nhiên tồn tại có 3 dạng: protopectin, pectin và acid pectinic Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất khác nhau, trong đó pectinic acid là thành phần chủ yếu

- Pectin có nhiều trong các loại quả (1 – 1,5%) Các vỏ, cùi cam, chanh, dứa có nhiều pectin Trong rau cũng có pectin như cà rốt, bắp cải, bí

- Các pectin tự nhiên định vị trong thành tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin không tan Trong quả xanh, pectin ở dạng không hoà tan gọi là protopectin làm cho quả rất cứng Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hoá học phức tạp Protopectin tồn tại chủ yếu ở thành tế bào, thường ở dạng liên kết với polysaccharide khác như arabin, tinh bột, cellulose… Khi quả chín, dưới tác dụng của enzyme protopectinase cũng như acid hữu cơ có trong quả làm cho protopectin chuyển thành pectin hoà tan,

Pectin hoà tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hoá bằng methanol

Tính chất quan trọng nhất của pectin là dễ tạo gel Pectin được ester hoá cao sẽ tạo gel đặc trong môi trường acid 1% và trong dung dịch đường có nồng độ 65%

- Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được ester hoá bằng methanol Pectinate là muối của pectinic acid

Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm methoxy, tức là trong đó có chứa một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vị polygalacturonic acid Pectate là muối của pectic acid

1.2 Tính chất của pectin:

- Pectin là chất bột trắng xám nhạt hay có màu nâu

- Pectin không tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác, không khử oxy Pectin hoà tan trong nước, amoniac, dung dịch kiềm, cacbonate natri và trong glycerine nóng

+ Độ hoà tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hoá trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm Khi đó, độ nhớt của dung dịch pectin sẽ tăng lên không tỷ lệ với nồng độ

+ Pectin dễ bị kết tủa bởi ethanol, isopropanol, acetone, sulfat amon, chlorua nhôm, các muối đồng, muối canxi và acid

- Độ bền vững của pectin trước các enzym pectinase sẽ được tăng lên khi có mặt của các cation, nhất là Al3+ và Fe3+

+ Pectin hoà tan dưới tác dụng của kiềm loãng hay enzyme pectase sẽ giải phóng nhóm methoxy tạo thành rượu methylic và acid pectic tự do Pectin chuyển sang dạng keo khi có đường và acid hay kim loại hóa trị cao

- Khi có đường và acid, pectin có tính chất làm đông Pectin của quả có khả năng đông tốt hơn pectin của rau vì cấu tạo có nhiều nhóm methoxy hơn

+ Độ kết đông càng cao khi nhóm methoxy càng nhiều

• Khi nhóm methoxy chiếm 11%, pectin đông tốt ở pH = 3,5

• Khi nhóm methoxy chiếm 5%, pectin đông tốt ở pH = 2,9

• Khi hàm lượng pectin khoảng 1%, độ acid từ 1 – 1,3%, pH = 2,8 – 3,2 ; độ đường 65 – 70% thì sản phẩm có thể đông tốt

- Pectin thường được sản xuất từ táo, cà rốt, vỏ bưởi, lúa mạch nha…

5

2 Enzyme pectinase:

2.1 Khái niệm:

- Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân huỷ của các

polymer pectin, làm giảm độ nhớt và giảm khối lượng phân tử của các sản

phẩm tạo thành

- Enzyme pectinase được ứng dụng nhiều trong quá trình chế

biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả

- Sản phẩm của quá trình thuỷ phân bởi enzyme pectinase là

acid galacturonic, galactose, methanol…

2.2 Các loại pectinaza

Theo quan điểm hiện đại, enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ

chế tác dụng của chúng, trong phức hệ enzime có những enzime sau:

- Pectinesterase

- Polygalacturonase

- Transeliminase

a Pectinesterase (PE) (pectase, pectin pectylhydrolase, EC 3.1.1.11)

phân cắt liên kết ester giữa methanol và nhóm carboxyl của acid galaturonic

theo sơ đồ:

Pectin + nH2O → methanol + acid pectinic

Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị

galacturonate nằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy

(-OCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid

pectic và methanol

Vị trí tấn công nhóm methoxy ở vị trí 5 dễ hơn ở vị trí 3 và 7 (2 gốc –

COOH)

Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác

nhau: pH tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn của

chế phẩm đã loại bỏ enzime polygalacturonase sẽ có PH tối ưu từ 2,0 đến 6,5

trái lại PH tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật thượng đẳng là từ 6

COOH COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOH COOCH3 COOCH3 COOCH3

Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 450C Từ 55 đến

620C thì enzime bị vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzime pectinesterase từ thực vật thượng đẳng cao hơn: từ 55 – 600C

Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger có nhiệt

độ tối ưu là 30 – 45oC, pHopt= 4,5-5,5 và bị vô hoạt ở 55- 62oC và từ thực vật (pHopt=7,5-8, to

opt= 55-60oC) Khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc vào nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin Ion natri và đặc biệt là ion canxi, cũng như chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ nấm

mốc Conithyrium diplodiella và từ A.niger Trái lại các cation hóa trị 3 và 4

(thủy ngân nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác dụng của pectinesterase

Ngoài ra, người ta đã thu được enzime pectinesterase ở trạng thái đông thể Và người ta cũng đã xác lập được rằng N-axit cuối trong phân tử enzime là phenylalanin

Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm methylester nằm ở giữa hai nhóm carboxyl tự do Và enzime sẽ thủy phân lần lượt cắt liên kết ester dọc theo phân tử pectin Hoạt động của pectinesterase phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hóa của pectin và tỷ lệ thuận vào mức độ ester

hóa Chẳng hạn, đối với tác động của pectinesterase từ nấm mốc A.niger, cần

thiết phải có pectin ester hóa ở mức độ cao không ít hơn 70%

Cấu trúc của pectinesterase từ carrot

b.Polygalacturonase(PG)(polyα -1,4-galacturoniglucanohydrolase)

(pectinase 3.2.1.12) thuỷ phân liên kết gắn với nhóm –COOH tự do ở đầu hay mỗi mạch, tức là thủy phân liên kết α - 1,4 – D – galactoside giữa các phần tử axit galacturonic trong pectin và trong các axit polygalacturonic khác

7

Enzyme này ít gặp trong thực vật, chủ yếu có trong vi khuẩn và nấm mốc Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất Dựa vào đó người ta chia ra 4 kiêûu sau:

- Polymethyl galacturonase (PMG-poly-α methyl ester glucanhydrolase.3.2.1.41.EC) PMG lại đựơc phân thành 2 nhóm nhỏ phụ thuộc vào vị trí phân cắt liên kết α -1,4 ở trong hay ở cuối và đầu đoạn mạch

-1,4-galacturonid-• Endo glucosidase polymethyl galacturonase kiểu I (endo-PMG-I) Đây là enzyme có tính chất dịch hoá, pectin ở mức độ methyl hoá càng cao (nhiều gốc methoxy-OCH3) thì bị thuỷ phân càng nhanh và triệt để Trong môi trường khi có mặt pectinesterase (PE) thì enzyme này thường bị giảm hoạt lực

Endo-PMG-I rất phổ biến trong các nòi nấm mốc: Asp.niger, Asp.awamori, Botrytis cinezea, Neurispora crassa)

Cơ chế tác dụng như hình vẽ:

• Exo-glucozidase polymethyl galacturonase kiểu III (exo – PMG- III) Đây là enzyme có tính chất đường hoá, có khả năng cắt từng gốc monome acid galacturonic ra khỏi mạch bắt đầu từ đầu không khử có nhóm methoxy (-OCH3)

Cơ chế tác dụng như hình vẽ:

- Enzyme tác dụng lên acid pectinic hay acid pectic – gọi là polygalacturonase (PG) cũng được phân thành 2 nhóm nhỏ:

7 6

5 4

3 2

1

COOH COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3

7 6

5 4

3 2

1

COOH COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOH COOCH3 COOCH3

COOCH 3

• Endo glucosidase polygalacturonase kiểu II (endo – PG – II) Đây là enzyme có tính chất dịch hoá, chỉ thuỷ phân cơ chất khi có mặt nhóm –COOH tự do Hoạt độ của endo – PG – II tăng lên nhiều khi cơ chất được xử lý trước bằng pectinesterase (để tạo nhiều gốc –COOH tự do) Nấm mốc và vi khuẩn tổng hợp đựơc enzyme này.

Cơ chế tác dụng như hình vẽ:

• Exo – glucosidase polygalacturonase kiểu IV (exo-PG-IV)

Endopolygalacturonase cũng có tên nữa là polygalacturonase dịch hóa Còn exopolygalacturonase thì có tên là polygalacturonase đường hóa

Các sản phẩm trung gian của quá trình thủy phân pectin bởi polygalacturonase có thể là các axit penta -, tetra -, tri- và digalacturonic

pH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vào nguồn thu và cơ chất Chẳng hạn polygalacturonase dịch hóa (Endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì PH tối ưu nằm trong khoảng từ 4,0 – 5,5 Cũng enzime đó nhưng khi tác dụng trên pectin thì lại có PH tối ưu trong khoảng 5,5 – 6 Còn polygalacturonase đường hóa khi tác dụng trên pectin thì pH tối ưu từ 3 – 4 nhưng khi tác dụng trên acid pectinic thì pH tối ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6

Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng PH từ 4 – 6

Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger nếu được hoạt hóa bằng

thủy ngân thì có thể bền vững khi pH 2,5

Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40 -450C Trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vô hoạt hóa khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 650C

Các polygalacturonase cũng như pectinesterase đều được hoạt hóa bởi các caiton của kim loại kiềm cũng như cation amon

7 6

5 4

3 2

1

COOCH3

9

Polygalacturonase từ ERWINIA CAROTOVORA SSP CAROTOVORA

Cấu trúc của Transeliminase

Đây là nhóm enzyme được tìm ra cách đây chưa lâu lắm (khoảng năm 1960-1961) bao gồm protopectinase xúc tác sự phân cắt araban, galactan ra khỏi protopectin để tạo thành pectin hoà tan và enzyme transeliminase phân cắt phi thuỷ phân (không có sự tham gia của phân tử H2O) pectin để tạo ra các gốc galacturonic có nối kép giữa nguyên tử C4 và C5 Phản ứng xảy ra dễ dàng ở môi trường trung tính hay kiềm yếu

Traseliminase cũng có tính đặc hiệu cao, do đó người ta phân biệt các

Traseliminase từ nguồn khác nhau thì có cơ chế tác dụng và các thuộc tính

khác nhau Chẳng hạn Traseliminase từ Bac.polymxa tác dụng trên uronit cao,

nhưng không tác dụng trên acid trigalacturonic, traseliminase từ nấm mốc hoạt động tối ưu ở pH 5,2 trái lại traseliminase từ vi khuẩn họat động tối ưu ở

pH từ 7 – 8,5

Người ta thường thu pectinase từ canh trường bề mặt hoặc từ canh trường

bề sâu của nấm mốc Các vi khuẩn và nấm men cũng tổng hợp được enzime

này A.niger chủ yếu tổng hợp ra pectinnesterase Con.diplodiella, Pen.citrimin tạo ra chủ yếu là polygalacturonase Nấm men Sacch.fragilis

dường như chỉ tạo ra endopectintraseliminase Vi khuẩn Bac.polymyxa,

Bac.species lại chủ yếu tạo ra transeliminase

Các loại enzyme pectinase

Stt Enzyme

( tên gọi theo hệ thống )

Enzyme ( tên thường gọi )

Thủy phân liên kết galacturonic trong galacturonide khơng theo một trật tự nào.

α-1,4-D-3

Poly-α-1,4-

Dgalacturonidgalacturon-hydrolase (3.2.1.40)

Exo-polygalacturonase (exo-PG)

Thủy phân liên kết galacturonide trong pectat, trong galacturonide với sự đứt mạch của

α-1,4-D-11

Thủy phân liên kết galacturonide trong pectin khơng theo một trật tự nhất định.

α-1,4-D-5 Poly-α-1,4-D galacturonid

digalacturonoliase

(4.2.99.7)

Exo-pectatliase (exo-PKTE)

Thủy phân liên kết galacturonide trong pectat với sự tạo thành ∆-4,5 acid degalacturonic khơng theo một trật tự nhất định.

α-1,4-D-6 Poly-α-1,4-D galacturonid

glycanoliase (4.2.2.1)

Endopectatliase (PETE)

Thủy phân liên kết galacturonide trong pectat, trong galacturonide với sự tạo thành nối đơi khơng theo một trật tự nhất định.

α-1,4-D-7 Poly-α -1,4 D

galacturonid

metylester-glycanoliase (4.2.99.8)

Endopectinliase (Endo-PTE)

Thủy phân liên kết galacturonide trong pectin với sự tạo thành nối đơi khơng theo một trật tự nhất định.

α-1,4-D-II VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP PECTINASE:

Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men, vi khuẩn

Nấm mốc: penicillium glaucum, P.ehrlichii, P.chrysogenum, P.expanam,

P.cilrimim, Aspergillus awamori, A.foetidus, A.niger, A.terrus, A.saitoi,

A.aureus, A.oryzae, A.wentii, Fusarium moniliforme,…

Nấm men: Saccharomyces fragilis

Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella

aerogenes…

Các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các

bộ phận khác của thực vật Khi quả bị hư hỏng, hoặc thực vật chết, chúng sẽ

cùng các loài vi sinh vật khác phá huỷ nhanh quả và các bộ phận của thực

vật

• Polygalacturonase

Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn vi sinh vật PG

thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi

khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: Saccharomyces fragilis, Asperigillus niger,

Lactobacillus plantarum, Cochlibolus carbonum, Neurosrora crassa, các loài

Ascomycete, Rhizopus arrchizus và Fusarium oxysrorum.

• Pectate lyase

Pectate lyase (PEL) là các enzyme vi sinh vật ngoại bào Các enzyme

của giống Erwina và Bacillus được biết đến là tác nhân gây ra triệu chứng

soft-rod ở thực vật Tuy nhiên, chúng cũng được tìm thấy ở Aeromonas, Pseudomonas, Xanthomonas, Asperigillus và Fusarium.

Tính chất vật lý của một số enzyme pectinase được sinh tổng

hợp từ giống Aspergillus

Species and enzyme type Enzyme Mol mass

(kDa) pH opt Topt (°C) pI Endopolygalacturonases

 Giới thiệu về mốc Aspergillus

Đây là loài nấm mốc hiếu khí Tế bào có vỏ, trong tế bào chất có nhân và nhân con, có các tiểu thể Khi phát triển tế bào nấm mốc thành hệ sợi: khuẩn

ty ăn sâu vào cơ chất – khuẩn ty khí sinh

Giống Aspergillus thuộc lớp nấm túi Ascomycetes

Giống mốc này có hệ khuẩn ty (hệ sợi) không màu hoặc vàng nhạt Có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt môi trường và khuẩn ty dinh dưỡng ăn sâu vào môi trường đặc (còn gọi là khuẩn ty cơ chất) Khuẩn ty phân nhánh có nhiều vách ngăn tế bào Tế bào có hạch nhân Cuống đính bào tử không phân nhánh dài và thẳng đầu, có nhiều cuống nhỏ Tùy loại có cuống nhỏ 1 tầng hoặc 2 tầng Tất cả cuống nhỏ có hình chai và gọi là tế bào hình chai, khi trưởng thành sinh ra các đính bào tử ở đầu cuống Các đính bào tử xếp thành chuỗi dài và càng tận cùng càng lớn dần Những chuỗi đính bào tử xếp đối xứng từng quả tròn trên chóp nang trông như đóa hoa cúc Đính bào tử điển hình thường hình cầu, đơn bào, đa hạch bề mặt xù xì Do cuống sinh bào tử và đính bào tử có màu sắc nên màu của chúng trở thành màu của

khuẩn lạc mốc Các khuẩn lạc của mốc Aspergillus thường là: vàng, vàng lục,

đen, tro, nâu…

Đặc điểm của giống Aspergillus giàu các enzyme thủy phân ngoại bào

(amylase, protease, pectinase, lipase…) Màu do các bào tử già có màu sắc gây nên, ta thường gặp lớp mốc có màu đỏ, đen, vàng… Các bào tử này dễ bị gió cuốn đi xa và rơi vào đâu gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới

Seplate hyphoe: sợi nấm

Conidiophore: cuống sinh bào tủ

Vesicle: tề bào hình chai

Phiolides: đính bào tử

Conidiospores: bào tử

15

 Giới thiệu về Aspergillus niger

The effect of radioactive compounds (U) applied in the minimum doses

detectable by the electronic counter (B-2) on the culture of Aspergillus niger:

a) control; growth on a medium without radioactive substances; b) growth on a medium containing uranium Swollen hyphae of the mycelium with degenerative coarsely-granular protoplasm

Aspergillus niger thường được gọi là mốc đen Sợi mốc màu trắng nhưng

đính bào tử màu đen Từ cuống đầu tiên mọc 2-4 nhánh cuống nhỏ rồi mới tiếp đến các bào tử Mốc sinh ra enzyme amylase, protease, pectinase, glucoseoxydase Mốc này được dùng trong sản xuất rượu, sản xuất acid xitric, acid fumaric Protease do mốc này hoạt động ở pH 2.5-3.5

Aspergillus niger có hoạt tính amylase đường hóa khác nhau ở những

chủng khác nhau Một số chủng được sử dụng để đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu hoặc mật-bột siro glucose Mốc này có thể chịu được pH thấp, nhiệt độ thích hợp là 30-33oC và dễ phát triển trên môi trường tinh bột

Aspergillus niger có hàm lượng ecgoxterin khá cao ( là loại sterin chủ yếu

của nấm) Đây là loài vi sinh vật hiếu khí, có khả năng phân giải cellulose mạnh mẽ

Loài aspergillus đang được ứng dụng rộng rãi để thu nhận enzyme và acid hữu cơ Trong đó, chủng Aspergillus niger được nghiên cứu kỹ và đã được đưa

qua các quá trình sản xuất Chủng này trong quá trình phân huỷ các chất glucid và các chất khác có khả năng tích luỹ một lượng khá lớn enzyme và acid hữu cơ

Chủng Aspergillus phát triển mạnh trên môi trường thạch malt và tạo

thành bào tử dài khoảng 7-10 micromet, khuẩn lạc màu đen, trên những cuống bào tử có vô số những bào tử Cuống bào tử có hai phần: phần thứ nhất dài và to, khoảng 2-3 micromet có màu nâu nhạt hay hoàn toàn đen

 Giới thiệu về Aspergillus awamori

Aspergillus Awamori Aspergillus Awamori có khả năng sinh nhiều dextrinase và

glucomylase sinh ra ít hoặc trung bình

 Giới thiệu về Saccharomyces fragilis

Saccharomyces Yeast Cells

Saccharomyces fragilis là loài vi sinh vật hiếu khí không bắt buộc, thuộc

lớp nấm túi Sinh bào tử nang

Saccharomyces fragilis có hàm lượng ecgoxterin khá cao ( là loại sterin

chủ yếu của nấm)

Thành tế bào dày khoảng 25nm (chiếm 25% khối lượng khô của tế bào), có thành tế bào cấu tạo bởi glucan và mannan Trong thành tế bào còn chứa 10% protein (tính theo khối lượng khô), trong đó có một phần là các enzyme

19

Ngoài ra, trên thành tế bào còn có một lượng nhỏ lipid, nước chiếm khoảng 75% Khi loại bỏ 85% lượng nước từ nấm men ở nhiệt độ dưới 50oC hầu như không ảnh hưởng đến hoạt động của chúng

Lấy tế bào trần của nấm men rồi đưa vào trong dung dịch có áp suất thẩm thấu thấp, ly tâm để lấy màng tế bào chất, rửa và ly tâm lại bằng nước cất và quan sát dưới kính hiển vi, thấy màng tế bào chất có 3 tầng kết cấu khác nhau Chủ yếu là protein (50% khối lượng khô), lipid (40%, gồm lipid glycerol-mono, di, triester, glycerol-phospho lipid, sterol) và hidratcarbon Nhân tế bào được bao bọc bởi một màng nhân, màng nhân có cấu trúc 2 lớp và có rất nhiều lỗ thủng AND cuả ty thể là một phân tử dạng vòng có khối lượng phân tử là 50 x 106 Da Khi già sẽ xuất hiện không bào, chứa các enzyme thủy phân polyphosphate, lipoid, ion kim loại, các sản phẩm trao đổi chất trung gian

Saccharomyces fragilis sinh sản vô tính bằng phương pháp nảy chồi Ở điều kiện thuận lợi, Saccharomyces fragilis sinh sôi nảy nở nhanh Khi một

chồi xuất hiện, enzyme thủy phân sẽ làm phân giải phần polysaccharide của thành tế bào làm cho chồi chui ra khỏi tế bào mẹ Vật chất mới được tổng hợp sẽ được huy động đến chồi và làm chồi phình to dần lên, khi đó sẽ xuất hiện một vách ngăn giữa chồi và tế bào mẹ Khi tế bào chồi tách khỏi tế bào mẹ ở chỗ tách ra còn giữ lại một vết sẹo của chồi, trên tế bào con cũng mang một vết sẹo

Saccharomyces fragilis có khả năng lên men glucose, saccharose,

galactose, lactose và raffinose trong môi trường thuận lợi

Saccharomyces fragilis là một chi nấm men được sử dụng rộng rãi trong

ngành thực phẩm như làm bánh mì, sản xuất cồn Quá trình nuôi dưỡng

Saccharomyces fragilis là quá trình hiếu khí vì vậy người ta phải thổi vào bồn lên men một lượng khí rất lớn

Nguyên liệu chính dùng sản xuất nấm men là mật rỉ Trong quá trình nuôi người ta phải kiểm soát lượng mật rỉ nạp vào bồn lên men theo lượng cồn có trong môi trường lên men Nếu lượng mật nạp vào nhiều quá nấm men sẽ không sinh sản mà sẽ thực hiện quá trình lên men tạo ra cồn khến nồng độ cồn tăng cao và năng suất men sẽ giảm, nhưng nếu lượng mật nạp vào quá ít nấm men sẽ thiếu chất dinh dưỡng cho sinh trưởng

Chất lượng của nấm men phụ thuộc vào công dụng của nó Nếu sản xuất men bánh mì thì năng lực sinh khí trong bột (hoạt tính) là thông số cần kiểm soát, nếu nấm men dùng cho công nghiệp cồn thì khả năng sản xuất cồn, khả năng chịu nồng độ cồn cao là quan trọng

Hiên nay nhờ vào tiến bộ của công nghệ gen nên người ta có thể tạo ra

(dựa trên 1 kg nguyên liệu chính) Tuy nhiên công nghệ kiểm soát quá trình lên men vẫn đóng vai trò quan trọng để sản xuất các mẻ men chất lượng và sản lượng cao

 Giới thiệu về Penicillium:

Nấm này thuộc lớp nấm túi Sợi có vách ngăn, khi phát triển sinh bào tử trong mốc như cái chổi xể và bào tử có màu xanh Tất cả các loài của giống này lúc đầu phát triển sợi có màu trắng, sau là xanh-xám và cuối cùng là nâu-xám Cuống đính bào tử có vách ngăn và có hình cái chổi, phần cuối là tế bào hình chai cùng với các đính bào tử Khi rụng các bào tử bính có màu xanh lục

Mốc này thấy ở mọi chỗ, thấy cả trên thực phẩm Bào tử của chúng có nhiều trong không khí, rau quả, ở các loại hạt và thóc malt, đặc biệt là ở các loại hạt bị vỡ Để phát triển, mốc này yêu cầu dinh dưỡng ở mức tối thiểu nhưng điều trước tiên là độ ẩm và khoảng nhiệt độ rất rộng, ở các kho nhiệt lạnh nhiệt độ trên dưới 0oC ta vẫn thấy mốc này phát triển

Penicillium thường sống ký sinh ở phôi các loại hạt, phá hỏng phôi và đi

sâu vào trong phá hỏng hạt Ơû thóc malt, mốc này làm hỏng hạt thóc, thay đổi màu sắc, mùi vị, làm giảm hoạt lực diastase và nặng sẽ làm hỏng hạt, các enzyme của thóc malt và không thể dùng nấu bia được

Penicillium dễ sinh enzyme thủy phân ngoại bào (amylase, protease,

pectinase…) và có một số loài có khả năng sinh chất kháng sinh Penicllin

21

Penicillium

Conidia: bào tử

Sterigmata: đính bào tử

Metula: cuống sinh bào tử

III NUÔI CẤY THU NHẬN PECTINASE:

Trình tự tiến hành sản xuất chế phẩm enzyme

- Các chất khác: 28,4

• Nước chiết cà rốt

2 Chuẩn bị môi trường:

2.1 Cơ sở lý thuyết:

Đây là yếu tố đầu tiên ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động sống cũng như khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật Môi trường cần chứa đầy đủ các chất C, N, H, O, các chấtvô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác

• Nguồn carbon:

Quá trình tổng hợp enzyme pectinase có liên quan đến chất cảm ứng pectin Pectin trong môi trường dinh dưỡng các giống vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme pectinase ngoài tác dụng làm chất cảm ứng còn là nguồn carbon

Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác nhau người ta dùng các nồng độ đường khác nhau Với vi khuẩn, xạ khuẩn người ta thường dùng 0,5-0,2% đường, còn đối với nấm men, nấm sợi lại thường dùng 3-10% đường Hầu hết chúng chỉ đồng phân hóa được các loại đường ở dạng đồng phân D

Sử dụng hỗn hợp một số polysaccharide và pectin để nuôi cấy vi sinh vật thì hoạt lực của pectinase ngoại bào có thể tăng lên 4-6 lần so với khi nuôi cấy không có pectin

Chất pectin cảm ứng có thể là bột cà rốt, bột táo, bột linh lăng…

Giống Aspergillus niger được nuôi cấy trên môi trường với những nguồn

carbon khác nhau như: pectin, tinh bột, lactose, saccharosse, maltose, galactose nồng độ 2, 4, 6% sẽ cho pectinase có hiệu suất cao Tuy nhiên trên môi trường nuôi cấy chỉ có monosaccharide và glycerine thì hoàn toàn không thể sinh tổng hợp enzyme này

Đường glucose có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp enzyme pectinase

trên môi trường nuôi cấy, là pectin và lactose đối với loài Asp.niger, Asp.awamori.

Tác dụng ức chế còn thấy ở fructose và saccharose với nồng độ cao

23

Vi sinh vật dị dưỡng nguồn thức ăn cacbon làm cả 2 chức năng: nguồn dinh dưỡng và nguồn năng lượng

Trong công nghiệp lên men nguồn rỉ dường là nguồn cacbon rẻ tiền rất thích hợp sử dụng đối với các loại vi sinh vật khác nhau

• Nguồn Nitơ:

Nguồn Nito dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+

Nếu dùng kết hợp Nitơ hữu cơ với vô cơ sẽ có tác dụng tốt đến quá tình sinh tổng hợp pectinase Muối nitrate là nguồn thức ăn Nito thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp với nhiều nấm men và vi khuẩn Và muối nitrate kim loại kiềm lại kìm hãm tổng hợp enzyme này do các ion kim loại kiềm sẽ làm kiềm hóa môi trường Để tránh hiện tượng này, người ta thường sử dụng muối NH4NO3 để làm nguồn Nito cho nhiều loài vi sinh vật Tuy nhiên gốc NH4+ thường được hấp thụ trước rồi mới đến gốc NO3-

Những hợp chất Nitơ hữu cơ: nước chiết từ bột lac, cao ngô, đậu tương, mầm mạch, cám, pepton…

Những hợp chất Nitơ vô cơ: amone sulfat (NH4)2SO4, amone phosphate (NH4)3PO4, amone nitrate NH4NO3

- Đối với Asp.niger, nguồn N tốt nhất để tổng hợp pectinase là phosphate

diamone, muối này cho kết quả còn trội hơn khi dùng các nguồn N hữu cơ như pepton, cazein thuỷ phân

- Đối với Asp.awamori, nguồn N vô tốt nhất là amone sulfat Các nguồn

N hữu cơ: pepton, cazein thuỷ phân hoàn toàn ức chế sự tạo thành enzyme pectinase ở nấm mốc này

- Đối với nấm mốc Asp.foetidus thì amone sulfat, nước chiết cám, nước

chiết nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực polygalacturonase

Nguồn Nito hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là pepton , là chế phẩm thủy phân không triệt để của một nguồn protein nào đó

Nói chung, tỷ lệ thích hợp nhất giữa C và N đối với tổng hợp enzyme pectinase dao động trong khoảng 7:1 – 13:1 còn tỷ số giữa pectin và C là 1:2, 2:2, 3:2, 4:2

• Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sự sinh trưởng

Ngoài Carbon, Nitơ, các nguyên tố vô cơ cũng có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp các enzyme pectinase mà trước tiên là ảnh hưởng đến trạng thái sinh lý của vi sinh vật, trong đó phospho là cấu tử vô cơ cần thiết cho môi trường

Các nguyên tố khoáng dùng trong tổng hợp pectinase: K, Ca, Mg, Fe, Na.

• Các yếu tố khác như pH của môi trường dinh dưỡng, phương pháp nuôi cấy, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đều có ảnh hưởng đến sự hình thành enzyme pectinase

Sự tổng hợp nên enzyme endo-PG, exo-PG và PMG thường xảy ra với sự sinh trưởng của nấm mốc, chỉ có pectinesterase là bị chậm lại do tác dụng ức chế của các sản phẩm thuỷ phân pectin

Polygalacturonase được tổng hợp nên bởi các tế bào sau 8h sinh trưởng đầu tiên, thì pectinesterase lại được tạo nên bởi các tế bào thuần thục hơn từ giờ thứ 6 đến thứ 26 của sự phát triển nấm mốc

Điều kiện nuôi cấy không những ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa pectinesterase và polygalacturonase mà còn ảnh hưởng đến sự tân tạo ra những enzyme khác kèm theo như protease, cellulose…

2.2 Môi trường nuôi cấy:

Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme pectinase thường là cám gạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm

Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối amonium, phosphoric…Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60%

• Đối với Asp.awamori

Mầm mạch: 0,5%

(NH4)2SO4: 0,7%

KH2PO4: 0,1%

MgSO4: 0,05%

Bã củ cải: 4%

• Đối với Asp.niger

Cám gạo: 70%

Trấu nhỏ: 27,5%

Muối (NH4)2SO4: 2,5%

Độ ẩm: 50% - 55%

Thời gian nuôi: 42h

Dịch chiết cà rốt: 25% so với lượng chất lỏng thêm vào

• Đối với Clostridium pectinofermentants 15

Bã củ cài: 2%