III. NUÔICẤY THU NHẬN PECTINASE:
3.1.1.Phương pháp nuôicấy bề mặt:
2. Chuẩn bị môi trường: 1 Cơ sở lý thuyết:
3.1.1.Phương pháp nuôicấy bề mặt:
Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc (sinh tổng hợp các enzyme amylase, cellulase, pectinase, protease) do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi, nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu
Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh, bộ ngô, mảnh hẹt bo bo có chất phụ gia là trấu để làm cơ chất. Cám mì cần phải lớn và có hơn 20% tinh bột. Cám được thêm một ít formalin và acid chlohydric để tăng hiệu quả thanh trùng dưới áp lực hơi nước nóng 1 atm trong khoảng 1-2h.
Cám trấu có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỷ lệ các chất phụ gia (chất độn) phải đảm bảo sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn Nitơ vô cơ (NH4)2SO4, (NH4)2CO, photpho P2O5, H3PO4 kỹ thuật, Nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Trong nuôi cấy bề mặt, người ta sử dụng môi trường lỏng hoặc sử dụng môi trường đặc.
Môi trường lỏng:
Ơû môi trường lỏng, vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí (không khí). Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hoà tan vào dung dịch môi trường.
Nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme trên môi trường lỏng the phương pháp nuôi cấy bề mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều dài và chiều rộng được thiết kế tuỳ theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác.
Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, vi sinh vật sẽ không có khả năng đồng hoá hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy.
Nếu chiều cao môi trường nhỏ sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme không cao.
Trong nhiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong khay nuôi cấy có chiều cao môi trường từ 5-7 cm là hợp lý.
Môi trường đặc
Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc. Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường.
Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme ngoại bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường.
Vi sinh vật không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn (môi trường) và pha khí (không khí) mà còn phát triển trên bề mặt
các môi trường, năm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm cao quá sẽ làm bết môi trường, nếu độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% là hợp lý.
- Nói chung nuôi cấy đường hóa theo phương pháp bề mặt gồm 4 giai đoạn:
+ Chuẩn bị giống và nhân giống để thu được mốc trung gian + Chuẩn bị và thanh trùng môi trường nuôi cấy
+ Nuôi cấy mốc trên khay, mành, nong, nia… trên các giá trong các buồng nuôi mốc có những điều kiện thích hợp để mốc sinh ra enzyme tối đa
+ Đập nhỏ, sấy và đóng gói mốc cám khô
Quy trình công nghệ
Làm ẩm môi trường
Có ý nghĩa quan trọng trong điều kiện sản xuất lớn, hàm ẩm tối ưu của môi trường cám là 58-60%. Khi được nuôicấy trong điều kiện nghiêm ngặt thì sẽ đạt hoạt độ enzyme cao nhất khi hàm ẩm 65-68%. Tuy nhiên, nếu môi trường quá ẩm sẽ bị bết dính (khi hấp thanh trùng, làm tơi khi nuôi cấy),dễ bị nhiễm vi sinh vật tạp (bị lên men rượu, lên men dấm…)
Nguyên liệu Trộn Làm ẩm
Thanh trùng bằng nhiệt Làm nguội, làm tơi Gieo giống vi sinh vật Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy
Nuôi cấy, theo dõi, xử lý
Để làm ẩm có thể dùng nước trộn vơi nguyên liệu (nhào) rồi thanh trùng hoặc làm ẩm sơ bộ rồi thanh trùng (nước ngưng tụ, nước đun sôi để nguội) để điều chỉnh lại độ ẩm của khối nguyên liệu. Cách sau có thể rút ngắn thời gian làm nguội, khống chế được độ ẩm chính xác hơn nhưng đòi hỏi phải thanh trùng ở nhiệt độ và áp suất cao hơn.
Thanh trùng bằng hơi nhiệt
Làm cho môi trường được tinh khiết hơn về phương diện vi sinh vật và làm cho chín (biến hình) môi trường (tinh bột, protein). Thông thường, người ta thanh trùng bằng hơi nước trực tiếp ở nhiệt độ 120-130oC trong 2-3h
Làm nguội và làm tơi môi trường để gieo giống
Khối môi trường vừa hấp xong còn nóng và dính bết. Vì vậy, phải làm nguội và làm tơi để thuận tiện cho việc gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi. Yêu cầu thời gian này phải ngắn để hạn chế nhiễm khuẩn từ bên ngoài. Nhiệt độ yêu cầu đạt được dể gieo giống là 35-39oC.
Nuôi cấy nấm mốc giống (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhằm đủ lượng bào tử giống cho toàn bộ môi trường nuôi cấy
Quy trình công nghệ phải được thực hiện trong các điều kiện kỹ thuật đặc biệt và khắt khe như: nguyên liệu phải tốt, giàu chất dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy khống chế nghiêm ngặt, thời gian nuôi cấy dài để nấm mốc hình thành nhiều bào tử và đều.
Tiến hành quá trình nuôi cấy
Sau khi gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi (mành hay khay đục lỗ) rồi chuyển vào phòng nuôi có điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm tương đối của không khí (ϕ) cũng như mức độ không khí. Quá trình nuôi cấy nấm mốc kéo dài 33-48h/mẻ được trải qua 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1:từ khi nuôi cấy mốc giống đến giờ nuôi thứ 10-12, xảy ra sự trương nở bào tử và xuất hiện cuống nấm. Để đảm bảo sự nảy mầm nhanh và hạn chế nhiễm tạp, cần giữ độ ẩm nguyên liệu 55-60%, ϕ=96- 100%, T=30-32oC.
- Giai đoạn 2: kéo dài trong 10-18h, nma61 mốc phát triển mạnh, lan khăp bề mặt và trong toàn khối môi trường (khuẩn ty ăn sâu vào cơ chất) dẫn đến hiện tượng kết bánh. Quá trình hô hấp và tỏa nhiệt mạnh làm môi trường bị khô xốp, tăng hàm lượng CO2, nhiệt độ phòng nuôi tăng lên đến 38-40oC. để khống chế nhiệt độ thích hợp 28-30oC cần thông gió (quạt) và bão hòa không khí ẩm phòng nuôi.
- Giai đoạn 3: kéo dài trong 10-20h và đặc trưng nhất vì tạo enzyme nhiều nhất. Cường độ trao đổi chất giảm đi chút ít, nhiệt tỏa ra ít hơn nên tốc độ bốc hơi nước của môi trường nuôi cấy cũng giảm theo. Quá trình
nuôi cấy được chấm dứt khi nấm mốc đạt độ già chín sinh lý và bắt đầu tạo thành bào tử.
• Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là
- Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Trong công nghiệp rượu, muốn đường hoá 100kg tinh bột chỉ cần 5kg chế phẩm nấm mốc bề mặt nhưng phải cần đến 100 lít nấm mốc chìm đã lọc bã và tế bào vi sinh vật
- Chế phẩm sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme
- Tốn ít năng lượng (điện, hơi nước, công nhân), thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thự hiện ở quy mô gia đình, trang trại cũng như ở quy mô ớn đến 20T/ngày
- Dễ thực hiện và khi bị nhiễm bởi vi sinh vật lạ thường xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ, ta rất dễ dàng xử lý. Nuôi cấy trong điều kiện không cần vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào, chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó.
• Nhược điểm rất lớn là năng suất thấp, tốn nhiều diện tích và rất khó cơ giới hóa, tự động hóa, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đều.