bài giảng vi sinh đại cương

Khi gây nhiễm mẫu vsv phân lập trên động vật nhạy cảm, chúngphảigây bệnh với các triệu chứng đặc trưng của bệnh.. Một số cột mốc trong nghiên cứu vi sinh vật học- 1684 Anton van Leeuwen

Vi sinh đại cương

Introduction to Microbiology

Hồ Thị Kim Hoa Khoa Chăn nuôi – Thú y Đại học Nông Lâm Tp HCM Email: hoa.hothikim@hcmuaf.edu.vn

Vi sinh đại cương

Co Sơ lược lịch sử phát triển ngành Vi sinh vật học (3 t)

C1 Cấu trúc vi khuẩn (3 t)

C2 Dinh dưỡng và phát triển (3 t)

C3 Định danh & phân loại vi khuẩn (3 t)

Sơ lược lịch sử ngành Vi sinh vật học

- Vi sinh vật học (Microbiogy): Môn học/khoa học về vi sinh vật

- Vi sinh vật:Sinh vật đơn bào, có kích thước vi thể

Bao gồm:

Vi khuẩn (bacteria), vi nấm (fungi)

Virus - có kích thước vi thể, nhưng không là sinh vật “đơn bào”

- Tế bào vi khuẩn khác với tế bào động-thực vật:

• Tế bào vi khuẩn: phát triển, sinh trưởng độc lập (từng tế bào)

• Tế bào động-thực vật:

- mỗi tế bào không thể tồn tại độc lập trong tự nhiên, mà

- tạo thành các mô có chức năng chuyên biệt, nhưng

- phối hợp/phụ thuộc nhau trong một cá thể sinh vật

 Vi sinh vật học(Microbiogy): xoay quanh 2 vấn đề chính:

- hiểu thế giới vi sinh vật sống;

- dùng những hiểu biết này để đem lại lợi ích cho con người & trái đất:

• là đơn vị cơ bản để nghiên cứu tế bào sống;

• có vai trò quan trọng trong: y học, thú ý, nông nghiệp, công nghiệp

Lịch sử

- 1664, Robert Hooke (Anh) – nhà triết học tự nhiên, toán học

lần đầu tiên mô tả hình dáng các sợi vi nấm

- 1684, Anton van Leeuwenhoek (Hà Lan)

lần đầu tiên quan sát & mô tả hình dáng vi khuẩn

bằng kính hiển vi do ông tự sáng chế

Leeuwenhoek’s drawings of bacteria, published in 1684.

(Madigan et al., 1997; p 21)

A replica of Leeuwenhoek’s microscope (Madigan et al., 1997; p 21)

Leeuwenhoek’s microscope.

(Davidson & The Florida State University)

- Louis Pasteur(Pháp) cho rằng vsv làm hư

thực phẩm có nguồn gốc từ không khí

1880 – 1890: vaccine nhiệt thán, fowl

cholera, dại

Thí nghiệm của Pasteur với bình cổ cong

(nay được gọi là bình “Pasteur).

(Madigan et al., 1997; p 22) (a) Dung dịch

chưa tiệt trùng Đốt cổ bìnhđể tiệt trùng Đun sôi dung dịchđể tiệt trùng.

Không khí bị đây

ra khỏi bình

(c) Bình được đặt nghiêng, vsv trong bụi tiếp xúc với chất lỏng tiệt trùng

Vsv phát triển trong chất lỏng

Bụi và vsv bị giữ lại

ở khúc uốn cong

(b) Dung dịch được

để nguội từ từ Dung dịch vẫn tiệttrùng trong nhiều năm

Miệng bình được để mở

Illustration of Louis Pasteur vaccinating animals against Anthrax

(© Stefano Bianchetti/Corbis)

- Robert Koch (Đức) & Koch’s postulates (Định đề Koch, 1884):

Ứng dụng trong việc mô tả nguyên nhân gây bệnh dịch tả & lao

1 Vsv gây bệnh luôn hiện diện trong cơ thể động vật mắc bệnh,

khônghiện diện trong động vật khỏe mạnh

2 Vsv gây bệnh nàyphảiđược phân lập trong môi trường ngoài cơ thể

3 Khi gây nhiễm mẫu vsv phân lập trên động vật nhạy cảm, chúngphảigây

bệnh với các triệu chứng đặc trưng của bệnh

4 Từ động vật mắc bệnh thứ hai này, vsv ban đầu vẫn được phân lập lại

trong phòng thí nghiệm

- Dựa vào thuyết Koch, các nhà khoa học

• đã phát hiện ra nhiều vsv gây bệnh quan trọng trên người và động vật;

• phát triển thành công các pp phòng và trị nhiều bệnh truyền nhiễm

Môi trường nuôi cấy phân lập vi sinh vật thuần (pure culture)

- Robert Koch (Giải Nobel Y học, 1905 cho n/c bệnh lao)

Lần đầu tiên nuôi cấy vsv trên cáclát cắt khoai tây

Sau đó, phát triểnmôi trường đặc dinh dưỡng gelatin,

nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh: các miếng gelatin, đậy bằng cốc thủy tinh

tuy nhiên, gelatin không đông đặc ở 37 oC, trong khi 37oC là nhiệt độ tối

ưu cho hầu hết vsv gây bệnh trên người & động vật

- Walter Hesse (và vợ, Angelina Hesse) – đồng sự với Koch:

Dùng thạch (agar) làm môi trường nuôi cấy phân lập vsv

- Richard Petri (Đức), 1887 mô tả cải tiến pp Kock đĩa Petri

Koch: phiến gelatin nuối cấy vk, đậy bằng cốc thủy tinh.

(Royal Society of Chemistry,

http://www.rsc.org/chemistryworld/issues/2010/february/petridish.asp.

Retrieved 16/8/2014).

Một số cột mốc trong nghiên cứu vi sinh vật học

- 1684 Anton van Leeuwenhoek Phát hiện vi khuẩn

- 1798 Edward Jenner Vaccine đậu mùa (smallpox)

- 1864 Louis Pasteur Xác định sự vấy nhiễm vsv trong thực phẩm

- 1867 Robert Lister Nguyên lý sát trùng trong phẩu thuật

- 1880’s Robert Koch Nuôi cấy gốc vsv thuần; Định đề Koch

- 1884 Hans Christian Gram PP nhuộm Gram

- 1889 Martinus Beijerinck Khái niệm virus

- 1908 Paul Ehrlich K/niệm về hóa trị liệu (đặt nền tảng cho ngành dược)

- 1915 Frederick Twort Phát hiện virus “giết” vi khuẩn (bactereriophage)

- 1928 Frederick Griffith Phát hiện transformation ở pneumococci

- 1929 Alexander Flemming Phát hiện penicillin

- 1931 Ernest William Goodpasture Nuôi cấy virus cím & 1 số virus khác trên phôi gà

- 1953 James Watson & Francis Crick Cấu trúc DNA

- 1977 Sanger, Niklen, Coullson DNA sequencing

- 1982 Stanley Prusiner Công bố phân lập được prion.

- 1983 Luc Montagnier Phát hiện HIV, virus gây bệnh AIDS

Chương 1 Cấu trúc vi khuẩn

Bacterial Structure

Vi sinh đại cương

Introduction to Microbiology

The phylogenetic tree is based on rRNA data (Woese et al., 1990)Prokaryotes and Eukaryotes

Phylogenetic Tree of Life - Three-domain system

Cây di truyền – Hệ thống “three domains”

Protein synthesis (tổng hợp protein) Initiation factors; ribosomal proteins; elongation factors of

Archaea are more similar to those of eukaryotes than eubacteria

So sánh một số tính chất giữa Bacteria, Archaea, & Eukaryotes

Microbiology and ImmuKhônglogy Online University of South Carolina School of Medicine http://www.tokresource.org/tok_classes/biobiobi

Xoắn khuẩn (spirillum)

Tạo hệ sợi (filamentous bacteria)

- Thường đặc trưng cho loài

Tuy nhiên, có thể thay đổi tùy theo môi trường & điều kiện nuôi cấy

- Hình dạng & đặc tính nhuộm tế bào VK xác định, và

hình dạng khuẩn lạc (colony) xác định trên các môi trường thạch

Hình dạng tế bào (kính hiển vi) & hình dạng khuẩn lạc  các tính chất được

quan sát đầu tiên trong định danh vi khuẩn

 Các protein xác định hình dạng tế bào VK

- Protein MreB có ở hầu hết vi khuẩn

- Là “khung xương tế bào” đơn giản

(giống như cytoskeleton ở eukaryotes)

- Tạo các dãy xoắn xung quanh bên trong tế bào,

Ở ngay bên dưới màng tế bào chất

- Cầu khuẩn không có gene mã hóa MreB;

khi gene mã hóa MreB bị gây đột biến,

trực khuẩn cũng có hình cầu

hình cầu là dạng tế bào bị lỗi (default)!

- Ở VKCaulobacter crescentus còn có thêm

Madigan et al., 2012; p 120.

http://en.wikipedia.org/wiki/Bacteria

(+/-) Fimbriae or pili (+/-)

Capsule (+/-)

Plasmid (+/-)

Thành tế bào Màng tế bào

Tế bào chất

(Tiên mao) (Tiêm mao)

Thành tế bào - The cell wall

The cell envelope is composed of the cell wall & the plasma membrane

Chức năng:

- Giữ hình dạng tế bào

- Bảo vệ tế bào khỏi bị ảnh hưởng của các tác động bất lợi từ môi trường

• Không bị phân hủy (lysis, bursting) hay bị phá vở do thay đổi áp suất

thẩm thấu (osmotic pressure)

- Gắn các cấu trúc phụ (pili/fimbriae, flagellum/flagella)

- Thấm không chọn lọc (non-selectively permeable)

Cấu trúc:

- Thành tế bào vi khuẩn có peptidoglycan – một polymer chỉ có ở prokaryote

Peptidoglycan

- poly-N-acetylglucosamine (NAG) & N-acetylmuramic acid (NAM)

- Tạo tính cứng của thành tế bào;

- Tạo hình dạng đặc trưng của tế bào

 Chỉ có ở prokaryotes

Kháng sinh nhóm β-lactam (vd, penicillin) gắn vào

DD-transpeptidase (penicillin-bindingprotein)

ức chế phản ứng tạo cầu nối (cross-linking)

giữa các chuỗi peptidoglycan

thành tế bào yếu đi, dễ bị phá hủy

Lysozyme thủy phân nối 1,4-β-linkages giữa

NAM & NAG

(Không ảnh hưởng tế bào động vật & người.) http://en.wikipedia.org/wiki/Bacterial_cell_structure

Vi khuẩn Gram dương & vi khuẩn Gram âm

Thành tế bào vk Gram dương

• Có thêm lớp màng ngoài (outer lipid

membrane) chứa lipopolysaccharides

(LPS, endotoxin) & lipoproteins.

Có 2 loại cấu trúc thành vi khuẩn

Hans Christian Gram (Đan Mạch) – phát minh pp nhuộm phân biệt

Vi khuẩn Gram dương & vi khuẩn Gram âm

Peptidoglycan Màng tế bào chất Màng ngoài

hiệu kháng nguyên ( phân loại

theo kháng nguyên O).

• Core oligosaccharide: cấu trúc

bảo tồn chung.

• Lipid A: endotoxin – nội độc tố.

http://homepage.ntlworld.com/diamonddove/04a_Gram/G ram.htm University of Warwick, UK

LPS là một “endotoxin”:

- Khi tế bào vi khuẩn bị phân hủy  giải phóng LPS  vào máu

- Kích thích tế bào bạch cầu tiết các pro-inflammatory cytokine, NO

Phản ứng mảnh liệt của cơ chế miễn dịch không đặc hiệu (nhằm loại bỏ vi

sinh vật gây hại):

Gây sốt (LPS - a pyrogen);

Kích hoạt tế bào bạch cầu đơn nhân,

tác động tế bào nội mô mạch máu, giãn mạch, tổn thương thành mạch 

hạ huyết áp, trụy tim mạch, tổn thương nhiều cơ quan (phổi, gan, thận)

shock nội độc tố

Mức độ LPS cao  gây chết

 Kháng sinh phổ rộng, kháng sinh phổ hẹp

Vi khuẩn Gram dương & Gram âm có cấu trúc thành tế bào khác nhau

 Tính nhạy cảm với kháng sinh khác nhau Ví dụ:

- Kháng sinh kháng vk Gram dương

penicillin (ức chế tổng hợp các nối giữa các chuỗi peptidoglycan)

- Kháng sinh kháng vi khuẩn Gram âm

Colistin (tương tác – làm tan outer membrane & cytoplasmic membrane);

Polymycin B gắn với lipid A của LPS

- Kháng sinh phổ rộng

Ức chế tổng hợp protein (vd, oxytetracycline, streptomycin; );

Ức chế tổng hợp DNA, ức chế phân bào (ciprofloxacine)

Kháng β-lactamase (carbapemens)

Nhuộm Gram (Gram staining)

• Nhuộm phân biệt vi khuẩn Gram dương với vi khuẩn Gram âm

Dựa vào cấu trúc thành tế bào khác nhau

- Gram dương – tế bào vk bắt màu tím (purple)

- Gram-negative – tế bào vk bắt màu hồng

Bước kiểm tra đầu tiên trong định danh & phân loại vi khuẩn;

Bước kiểm tra chẩn đoán đầu tiên bệnh nhiễm nhiễm trùng

hổ trợ chẩn đoán & điều trị (kháng sinh)

A Gram stain of mixed Staphylococcus aureus , Gram-positive cocci, in

purple) and Escherichia coli Gram-negative bacilli, in red)

(http://en.wikipedia.org/wiki/Gram_stain Retrieved 18/8/2014)

Nguyên lý nhuộm Gram:

PP nhuộm đặt theo tên nhà vi khuẩn học Hans Christian Gram

Cơ chế phản ứng:

- Vi khuẩn Gram dương : thành tế bào chứa lớp peptidoglycan (PG) dày

 giữ màu nhuộm ban đầu (crystal violet, CV).

- Vi khuẩn Gram âm: lớp PG mỏng, không giữ được CV

 nhuộm màu hồng của thuốc nhuộm thứ hai (safranin hay carboyl fuchsin).

4 bước cơ bản của pp nhuộm Gram:

- Nhuộm với crystal violet, thành tế bào bắt màu tím;

- Rửa với iodine - gắn với crystal violet, phức hợp được giữ chặt trong thành t.bào.

- Khử màu nhuộm bằng cồn (alcohol);

- Nhuộm với chất nhuộm thứ hai có màu hồng- safranin hay carbol fushin.

Kỹ thuật nhuộm Gram:

1) Làm phết kính, cố định tế bào trên đèn

2) Nhuộm với dd crystal violet (30 giây);

CV phân ly tạo CV + (và Cl - ); CV+ thấm qua thành tế bào,

tương tác với các gốc mang điện tích âm  thành tế bào bắt màu tím.

3) Rửa mẫu bằng dd iodine (~30 giây);

4) Rửa mẫu bằng 95% alcohol (~ 10 giây) hay cho tới khi phết kính hết màu;

5) Nhuộm với carboyl fuchsin hay safranin (30 giây)

6) Nghiêng và nhẹ nhàng giũ lam kính trên giấy thấm cho hết nước; chờ mẫu khô.

7) Kiểm tra dưới kính hiển vi, vật kính 100x (dùng dầu soi kính).

Bên ngoài tế bào (môi trường ngoài)

Tế bào chất (cytoplasm)

Protein màng (transmembrane proteins)

Hydrophobic region Hydrophilic region

Hydrophilic region

Phospholipid

bilayer

Màng tế bào – cell membrane, bacterial cytoplasmic membrane

 Màng kép phospholipid (phospholipid bilayer):

• Đầu phosphate ưa nước (hydrophilic) hướng ra ngoài;

• Đầu a xít béo kị nước (hydrophobic) hướng vào trong

 Có gắn nhiều protein  protein màng (embedded proteins)

Protein màng - Transmembrane proteins

Chức năng của màng tế bào

- Rào cản có tính thấm chọn lọc

- Điều tiết sự vận chuyển các chất ra-vào tế bào

- Gắn các enzyme màng

- Nơi tổng hợp các thành phần thành tế bào

- Hổ trợ sự nhân lên DNA (phân bào)

- Nơi quá trình sinh năng lượng diễn ra:

phốt pho hóa ô xy hóa (oxidative phosphorylation)  sinh ATP

(hô hấp hay quang hợp)

 Tương tự chức năng của ty thể hay lạp thể

- “Lắp ráp” và tiết các protein ngoại bào (extracytoplasmic proteins)

Các thành phần bên trong tế bào

 Tế bào chất (protoplasm): Chất nền, có dạng gel, chứa:

nước (70 %), enzyme, các chất dinh dưỡng, các chất thải, & các khí

Các bào quan:

- 1 Phân tử DNA (vòng), cũng được gọi nhiễm sắc thể

(đơn giản hơn NST của eukaryotes)

- Các ribosome: nơi tổng hợp protein

- Plasmid(s): các phân tử DNA vòng có kích thức nhỏ, có các tính chất:

• Có thể tự nhân lên (độc lập với sự nhân lên NST);

• Được truyền từ tế bào này sang tế bào khác qua sự phân bào hay qua hiện

tượng conjugation

• Mang gen đề kháng kháng sinh, gen mã hóa các ngoại độc tố

• Ribosome

Ribosome của prokaryote là 70S (S =Svedberg units),

70S Rb = tiểu đơn vị 50S + tiểu đơn vị 30S

• 50S chứa 23S & 5S rRNA

• 30S chứa 16S rRNA

Ribosome của eukaryote là 80S, lớn hơn

Svedberg unit (ký hiệu S hay Sv) là đơn vị biểu diễn tốc độ lắng

(sedimentation rate)

Đơn vị này không thuộc hệ thống đơn vị quốc tế (non-SI unit)

Glycocalyx: Capsule & màng nhầy (slime layers)

- Bao bên ngoài thành tế bào

- Thành phần là các đường và/hay protein

- Có thể hiện diện ở cả vi khuẩn Gram (+) & (-)

- 2 loại:

• Capsule: cấu trúc có tổ chức, gắn chặt vào

thành tế bào

• Slime layer: cấu trúc có tổ chức lỏng lẻo &

gắn lỏng lẻo vào thành tế bào

Các cấu trúc bên ngoài thành tế bào

Figure 3.23Capsules of Acinetobacter

species (a) andRhizobium trifolii (b).

Chức năng của glycocalyx:

• Bảo vệ tế bào khỏi bị khô

• Giúp tế bào thoát sự thực bào của tế bào miễn dịch (phagocytosis)

là một tính sinh bệnh (pathogenicity)

• Giúp tế bào gắn/bám lên bề mặt khác (adhesin)

Biofilms

• Tạo một môi trường bảo vệ tế bào

Flagella (flagellum) – tiên mao

- Là 1 polymer của protein flagellin(tiểu đơn vị)

- Giúp tế bào di chuyển

- Có thể là kháng nguyên, ví dụ kháng nguyên H (“Hauch”)

của trực khuẩn đường ruột Gram âm (vd, salmonellae)

- Các loài khác nhau có số flagella và phân bố các flagella khác nhau

Monotrichous

Lophotrichous

Amphitrichous

Peritrichous

 Di động

- Flagella xoay giúp vi khuẩn di chuyển theo

nhiều hướng (theo trục tế bào)

- Flagella xoay nhờ “động cơ” xoay (rotary

motor) được tạo bởi 2-4 vòng protein, cắm

trong thành & màng tế bào

- Năng lượng được cung cấp bởi “proton

motive force”

- VK có flagellum(a) ở 2 đầu di chuyển nhanh

hơn vk có nhiều flagella xung quanh tế bào

 Gliding (trượt)

- Có 1 số vk có thể di chuyển nhưng không có

flagella  trượt trên bề mặt cứng, chậm,

đều, theo 1 hướng (trục tế bào) Figure 3.41in Gram-negative bacteria.Structure of the flagellum

(Madigan et al 2012; p 75)

Microbial taxes

- VK có khả năng di động có thể có di chuyển đáp ứng sự chênh lệch (gradient)

nồng độ các chất hóa học hay cường độ của các yếu tố vật lý

di chuyển tới gần, hay

tránh xa nơi có nồng độ/cường độ cao của yếu tố này

- Di chuyển bằng flagella hay bằng cách trượt

- Các loại di chuyển đáp ứng:

• Chemotaxis:di chuyển đáp ứng với một chất hóa học

• Phototaxis:di chuyển đáp ứng với ánh sang

• Aerotaxis: di chuyển đáp ứng với tình trạng ô xy

• Osmotaxis: di chuyển đáp ứng với nồng độ các ion (áp suất thẩm thấu)

 Chemotaxis:

- Di chuyển đáp ứng với một chất hóa học

- Trong lúc di chuyển, VK “theo dõi” sự chênh lệch nồng độ chất kích thích,

bằng cách so sánh nồng độ ở vị trí hiện tại với nồng độ chất này trước đó

- Chemoreceptors- protein màng gắn với chất hóa học

Tính hiệu được truyền qua một loạt các protein, tới flagellum  “hướng

dẫn” hoạt động xoay flagellum

Theo 1 cách gần giống đáp ứng cảm giác của hệ thần kinh ở động vật

 Fimbriae (fimbria) = attachment pili

- Mảnh, ngắn và nhiều, phủ bề mặt tế bào

- Giúp tế bào vi khuẩn gắn bám trên

tế bào động vật, người; trên một bề mặt

• tạo cácpellicle (mảng tế bào mỏng, nổi trên

một dung dịch);

• biofilms(màng mỏng trên 1 bề mặt)

Figure 3.24 Electron micrograph of

a dividing cell of Salmonella Typhi,

showing flagella and fimbriae A single cell is about 0.9 m wide.

(Madigan et al, 2012; p 65).

Flagella

Fimbriae