Nghiên cứu và phân lập Flavonoid của cây hoàng cầm (scutellaria baicalensis)

Để góp phần nghiên cứu thành phần hóa học của cây Hoàng cầm, các nhiệm vụđặt ra như sau: - Xây dựng phương pháp chiết hiệu quả với cây Hoàng cầm.. Nó từng được coi là có học hang gần với

LỜI CẢM ƠN

Báo cáo khoa học này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa Học, Trường Đại học Khoa Học

Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Đậu, người đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện cho chúng em trong quá trình thực hiện nghiên cứu hoa học này.

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn trong phòng Hóa học các hợp chất thiên nhiên, đặc biệt là chị Lại Hoàng Yến đã giúp

đỡ em nhiều trong quá trình nghiên cứu và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành báo cáo nghiên cứu khoa học này.

Hà Nội, ngày 30 tháng 3 năm 2012

Sinh viên

Phùng Thị Tuyền

Mục lục

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN

1.1. Vài nét về họ hoa môi ( Lamiaceae hay Labiata)………

4 1.2. Cây Hoàng cầm……… 5

1.2.1 Đặc điểm thực vật ………5

1.2.2 Nguồn gốc và phân bố……… 6

1.2.3 Hóa thực vật cây Hoàng cầm……… 6

1.3 Công dụng và các hoạt tính sinh học……… 8

1.3.1.Ứng dụng trong y học dân gian……… 8

1.3.2 tác dụng dược lý……… 9

1.3.3 Hoạt tính sinh học của một số chất trong cây Hoàng cầm……… 10

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Các phương pháp nghiên cứu ………11

2.1.1 Chiết các hợp chất từ mẫu thực vật……… …11

2.1.2 Phương pháp khảo sát các lớp chất……… 11

2.1.3 Phương pháp kết tinh lại 13

2.1.4 Phương pháp xác định cấu trúc các chất phân lập 13

2.2 Thực nghiệm 13

2.2.1 Nguyên liệu thực vật 13

2.2.2 Chiết các hoạt chất từ thân và rễ cây Hoàng cầm 13

2.2.3 Phân tích cặn SBD bằng TLC 14

2.2.4 Phân tách cặn SBD bằng CC 14

2.2.5 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất đã phân lập được từ phần chiết điclometan ( SBD) 15

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Điều chế các phần chiết .16

3.2 Phân tích và phân tách cặn chiết diclometan (SBD) 16

3.2.1.Phân tích cặn chiết điclometan (SBD) bằng CC 17

3.4 Hằng số vật lý và cấu trúc các chất phân lập được từ cặn diclometan (SBD1) 18

3.4.1 Chất β-Sitosterol (SBD1) ……… 18

3.4.2 Wogonin (SBD2) ………22

Kết luận ………23 Tài liệu tham khảo

Phổ của SBD1 và SBD 2

LỜI MỞ ĐẦU

Việc tăng cường nghiên cứu, khai thác và phát triển nguồn tài nguyên thực vậtlàm thuốc đang là một định hướng lớn trong chiến lược phát triển ngành công nghiệp vànâng cao sức khỏe cộng đồng.Từ những năm đầu thế kỉ XIX,trong lĩnh vực y-dượchọc,việc kết hợp giữa các phương pháp khoa học kĩ thuật và các loại thực vật xuất phát

từ thiên nhiên đã đưa con người đến một bước lớn trong việc phát minh ra nhiều loạithuốc có khả năng chữa bệnh

Hoàng cầm là một vi thuốc thông dụng,nhưng hiện nay chưa thấy ở nướcta.Hoàng cầm được sử dụng rộng rãi là thuốc thảo dược Trung Quốc được sử dụng trongđiều trị chống viêm và chống ung thư, ức chế mạnh sự tăng trưởng tế bào trong tất cảcác dòng tế bào ung thư thử nghiệm, có tác dụng hạ huyết áp,kháng khuẩn…

Xuất phát từ những lí do trên, bài báo cáo này có tên là: “Nghiên cứu và phân lậpFlavonoid của cây hoàng cầm (scutellaria baicalensis) “

Để góp phần nghiên cứu thành phần hóa học của cây Hoàng cầm, các nhiệm vụđặt ra như sau:

- Xây dựng phương pháp chiết hiệu quả với cây Hoàng cầm

- Khảo sát định tính và phân tách các chất từ cây Hoàng cầm

- Khảo sát cấu trúc các chất phân lập được từ cây Hoàng cầm.

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

Họ hoa môi hay được gọi bằng nhiều tên khác như họ Húng, họ Bạc hà …,là một

họ thực vật có hoa Nó từng được coi là có học hang gần với họ Verbenaceae nhưng một

số nghiên cứu phát sinh gần đây đã chỉ ra rằng một loạt các chi được phân loại trong họVerbenaceae thực chất là thuộc họ Limiaceae, trong khi các chi cốt lõi của họVerbanaceae thì không có quan hệ họ hàng gần với Lamiaceae mà là gần hơn với cácthành viên khác cả bộ Lamiales.Họ Lamiaceae mỏ rộng chứa khoảng 233-263 chi vàkhoảng 6900-7173 loài

Các loài thực vật trong họ này nói chung có hương thơm trong mọi thành phần củacây và bao gồm nhiều loài cây than thảo được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực, như húngquế, bạc hà, hương thảo, ô kinh giới, oải hướng, tía tô, hương nhu….Một số loài là câybụi hay cây gỗ,hiếm gặp hơn là các dạng leo.Nhiều loài được gieo trồng rộng rãi, khôngchỉ vì hương thơm của chúng mà còn vì dễ gieo trồng với mục đích lấy lá để ăn, làm gia

vị, làm cảnh hay lấy hạt

Tên gọi nguyên gốc của họ này là Labiatae, do hoa của chúng thông thường có cáccánh hoa hợp thành môi trên và môi dưới.Nhưng phần lớn các nhà thực vật học hiện tại sửdụng tên gọi Lamiaceae khi nói về họ này

Các lá của chúng mọc chéo chữ thập, nghĩa là lá sau mọc vuông góc với lá trước, hay mọc vòng

Thân cây nói chung có tiết diện hình vuông, nhưng điều này không phải bắt buộc ở tất cả các loài cũng như tiết diện kiểu này cũng có thể xuất hiện ở các họ thực vật khác

Hoa của chúng đối xứng hai bên với 5 cánh hoa hợp, 5 lá đài hợp Chúng thường là lưỡngtính và mọc vòng (cụm hoa trông giống như một vòng hoa nhưng thực tế bao gồm 2 cụm chụm lại).

1.2 Cây Hoàng cầm ( scutellaria baicalensis ).

Tên khoa học là Scutellaria baicalensis (Hoàng cầm), nó còn có các tên khác là Hủ trường, Túc cầm, Hoàng văn, Kinh cầm, Đỗ phụ, Nội hư, Ấn dầu lục, Khổ đốc bưu, Đồn vĩcầm, Thủ vĩ cầm, Điều cầm, Khô cầm, Bắc cầm, Phiến cầm ,Khô trường,Lý hủ thảo, Giangcốc thu, Lý hủ cân thảo, Điều cầm, Tử cầm, Đạm tử cầm, Đạm hoàng cầm, Tủ cầm, Đông cầm, Hoàng kim trà, Lan tâm hoàng

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Hoàng cầm là một loại cỏ sống dai, cao 20-50cm, có rễ phình to thành hình chùy,mặt ngoài màu vàng sẫm bẻ ra có màu vàng Thân mọc đứng, vuông, phân nhánh, nhẵn

hoặc có lông ngắn Lá mọc đối, cuống rất ngắn, hoặc không cuống; phiến lá hình máchẹp, hơi đầu tù, mép nguyên, dài 1.5-4cm, rộng 3-8mm hoặc 1cm, mặt trên màu xanhsẫm, mặt dưới xanh nhạt Hoa mọc thành bông ở đầu cành, màu lam tím Cánh hoa gồm 2môi, 4 nhị (2 nhị lớn dài hơn tràng) màu vàng, bầu có 4 ngăn.

1.2.2 Nguồn gốc phân bố

Đang thí nghiệm di thực vào vùng mát của nước ta Cây mọc tốt, nhưng chưa phát triển.Hiện nay vẫn phải nhập của Trung Quốc ( Hắc long Giang, Liêu Ninh, Hà Bắc, Hà Nam, Vân Nam, Nội Mông ) Mọc hoang cả ở Liên Xô cũ được nghiên cứu sử dụng làm thuốc chữa cai huyết áp

Mùa xuân và mùa thu thu hoạch lấy rễ: đào về cất bỏ rễ con, rửa sạch đất cát, phơi hơi khô, cạo bỏ vỏ mỏng, phơi hoặc sấy khô là được

1.2.3 Hóa thực vật của cây Hoàng cầm.

1.2.3.1 Tinh dầu

1.2.3.2 Dẫn xuất flavon

Theo các nghiên cứu thì chất xác định được trong cây hoàng cầm chủ yếu là dẫnxuất của flavon.Trong cả lá, rễ, thân đều có scutelarin hay wooginin ( 8,4-10,3% ),baicalin chỉ có trong rễ, cùng với nhiều chất như baicalein, neo-baicalein, b-sitosterol,benzoic acid, woogonoside, skullcapflavone, oroxylin A, methoxylbaicalei,dihydrooroxylin A, chrysin, 2,5,8-trihydroxy-7-methoxyflavone, 2,5,8-trihydroxy-6,7-dimethoxyflavone, 4,5,7-trihydroxy-6-methoxyflavanone.Ngoài ra còn có tannin và chấtnhựa.Không thấy có ancaloit, glucozit, saponin, vitamin C

Baicalin wogonoside

wogonin

Skullcapflavone 1 Skullcapflavone 2

1.3 Công dụng và các hoạt chất sinh học

1.3.1 Ứng dụng trong y học dân gian

Từ lâu,y học Trung Quốc đã sử dụng hoàng cầm là một vị thuốc để phòng và chữabệnh.Trong đông y: Hoàng cầm là một vị thuốc mát chữa sốt, chữa cảm mạo, ho cảm,cầm máu, kinh nguyệt quá nhiều Theo tài liệu cổ: Hoàng cầm vị đắng tính hàn, vào 5kinh tâm, phế, can, đởm và đại tràng Có tác dụng tả phế hỏa, thanh thấp nhiệt Dùngchữa hàn nhiệt vãng lại, phế nhiệt sinh ho, tả lỵ đau bụng, thấp nhiệt da vàng, đầu nhức,mắt đỏ, đau, động thai

Liều dùng mỗi ngay 6-15g sắc với nước chia 3 lần uống trong ngày Có thể dùngbột Gần đây, hoàng cầm được dùng làm thuốc chữa các triệu chứng nhức đầu, mất ngủcủa bệnh cao huyết áp do thần kinh thực vật và do mạch máu bị cứng, đồng thời đượcdùng điều trị bệnh cao huyết áp Dùng dưới hình thức rượu hoàng cầm (bột hoàng cầm20g, cồn 700 vừa đủ 100ml) Ngày uống 2-3 lần, mỗi lần 20-30 giọt

Đơn thuốc có hoàng cầm trong kinh nghiệm cổ truyền:

1 Thanh kim hoàng: Hoàng cầm sấy khô tán nhỏ làm thành viên to bằng hạt ngô Ngàydùng 20-30 viên Chữa các bệnh đổ máu cam, thổ huyết, kinh nguyệt quá nhiều, cảmmạo, ho cảm

2 Tam hoàng cầm (Theo Thiên kim phương)

-Hoàng cầm (mùa xuân dùng 120g, mùa hạ và mùa thu 240g, mùa đông 120g)

-Hoàng liên (mùa xuân 160g, mùa hạ 280g, mùa thu 120g, mùa đông 80g).

-Đại hoàng (mùa xuân 120g, mùa hạ 40g, mùa thu 120g, mùa đông 200g)

Cả ba vị, liều lượng tùy theo mùa mà thay đổi, tất cả tán nhỏ, dùng mật ong viên thànhviên to bằng hạt đậu đen Ngày uống 3 lần, mỗi lần 5-7 viên Uống luôn trong 1 tháng.Chữa bệnh lao, viêm niêm mạc tử cung

3 Hoàng cầm-mạch môn đông, mỗi vị 10g Sắc uống trong ngày thay nước Dùng saukhi sinh nở bị mất máu nhiều, khát nước

+ Tác dụng kháng khuẩn: Hoàng cầm có kháng phổ rộng Trong thí nghiệm, nó cótác dụng ức chế đối với nhiều khuẩn bệnh gồm tụ cầu vàng, phế cầu khuẩn, não mô viêm Neisseria.Nhiều thí nghiệm báo cáo cho thấy thuốc có tác dụng kháng lại trực khuẩn lao, kháng lại với nấm da và có khả năng diệt Leptospira (Chinese herbal medicine)

+ Tác dụng điều hòa nhiệt độ: từ năm 1935, có báo cáo cho biết rễ Hoàng cầm có tác dụng hạ nhiệt

+ Tác dụng đối với huyết áp: nước sắc, cồn chiết, dịch truyền, kể cả nước và cồn trích Hoàng cầm đều có tác dụng hạ huyết áp

1.3.3 Hoạt tính sinh học của một số chất có trong cây Hoàng cầm.

Trong cây Hoàng cầm chủ yếu chứa Flavonoid là dẫn xuất của phenol có hầu hết

ở người, động thực vật và vi sinh vật do đưa trực tiếp vào từ nguồn thức ăn Bản thâncon người không có khả năng tự tổng hợp được phenol Flavonoid tham gia vào tất cảcác quá trình trao đổi chất, sinh tổng hợp và quá trình enzym Về mặt cấu tạo, flavonoid

là các polyphenol có tính axit, đính nhóm hydroxy tự do ở các vòng

Trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) vàdạng liên kết với glucid (glycosid) Trong đó, dạng aglycol thường tan trong các dungmôi hữu cơ như ete, axeton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước, còn dạngglycosid thì tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực nhưaxeton, benzen, cloroform

Hoạt tính sinh học của flavonoid: Có tác dụng với khối u và một số dạng ung thưnhư enpatin (3,5,3'-trihydroxy-6,7,4'-trimetoxyflavon), enpatoretin (3,3'-dihydroxy-5,6,7,4'-tetrametoxyflavon) Nâng cao tính bền của thành mạch máu như rutin Có tácdụng estrogen như glycosid quecrcetin và kaempferol- 3-3-ramnogalacto-7-ramnorid Flavonoids có hoạt chất chống oxy hóa Một số hoạt độ tính của flavonoid baogồm: chống dị ứng, chống ung thư, chất chống oxy hóa, chống viêm và chống virus,chống dị ứng, chống co giật… Các flavonoid quercetin được biết đến với khả năngcủa nó để làm giảm sốt, eszema, viêm xoang và bệnh suyễn Đặc biệt, flavonoid còn

có hoạt tính vitamin P, làm bền những mao mạch và giảm tính giòn của thành mạch

Do khả năng ức chế quá trình oxy hoá nên chúng có hiệu ứng chống u lành tính và u

ác tính Các flavonoid còn được ứng dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùngnhư chống viêm loét dạ dày, viêm mật cấp tính và mãn tính, viêm gan, thận, thươnghàn, lị

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM2.1 Các phương pháp nghiên cứu

Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản silica gel tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254, dày 0,2 mm (Merck), sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau để khảo sát

và chọn ra một hệ tách tốt nhất cho sắc ký cột

Các dung môi thường được dùng để triển khai sắc kí là n-hexan, axeton,diclomentan, etyl axetat và metanol Chúng được làm khan và chưng cất lại trước khipha theo tỷ lệ phù hợp

Các vệt chất trên lớp mỏng được phát hiện dưới ánh sáng tử ngọai (λ=254 nm),vớidung dịch vanilin/H2SO4 đặc 1%, tiếp theo hơ nóng ở 120 0C và dung dịch FeCl3/ethanol96%

Đối với sắc kí bản mỏng, việc lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy sắc kí cho

Rf tốt là quan trọng nhất Cụ thể với yêu cầu khảo sát hỗn hợp thì chọn dung môi sao chocác vệt tròn, sắc nét, rải đều trên toàn bản và có Rf càng xa nhau càng tốt

2.1.2.2 Phương pháp sắc kí cột

Sau khi khảo sát bản mỏng, tiến hành sắc kí cột để tách một số hợp chất trong phần chiết

Có 3 phương pháp sắc kí cột (để phân lập các chất trong hỗn hợp và tinh chế các chất.Column Chrotomatography, CC: sắc kí cột thường, Flash Chromatography, FC: sắc kí cộtnhanh.

Trong quá trình làm thí nghiệm, chúng tôi chỉ sử dụng phương pháp sắc kí cộtthường Đây là phương pháp tách chất được thực hiện dưới trọng lực của dung môi

Cột tách sắc kí là một ống thủy tinh hình trụ, phía dưới có khóa Cột có đường kính

và chiều dài tùy theo yêu cầu sử dụng

Trong sắc kí cột, pha tĩnh thường là silicagel (Merk, cỡ hạt 63–100 μm), và phađộng là dung môi, hay các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau ( n-hexan, ete dầu hỏa,điclometan, clorofoc, etyl axetat, axeton, metanol )

Nhồi cột sắc ký: Phương pháp nhồi cột ướt

Một lượng silica gel ứng với cột sắc ký có đường kính thích hợp, có chiều cao là

30 cm, được khuấy đều thành bột nhão trong một lượng vừa đủ dung môi ít phân cựchơn Bột nhão này được đuổi hết bọt khí và được nhồi vào cột sắc ký Có thể dùng bơmnén hoặc để tự dung môi ít phân cực hơn đi qua cột nhiều lần cho đến khi lớp silica gelhoàn toàn ổn định

Đưa mẫu lên cột sắc ký:

+ Phương pháp tẩm mẫu trên silica gel: Mẫu được hòa tan trong một lượng vừa

đủ dung môi dễ bay hơi thích hợp Trộn dung dịch thu được với silica gel với tỷ lệ 1gchất/1,2-1,5g silica gel Hỗn hợp này, sau đó được làm bay hơi dung môi đến khô kiệtthu được bột mịn của mẫu chất hấp phụ trên silica gel Hỗn hợp này đưa lên cột sắc ký

+ Triển khai sắc ký cột: Mở khóa dưới để cho dung môi chảy ra khỏi cột, cho đếnkhi bề mặt dung môi cách bề mặt silica gel khoảng 2mm Cho từ từ mẫu đã tẩm silicagel lên cột Khi đưa mẫu lên chú ý đảm bảo cho bề mặt của lớp chất ở phía trên và phíadưới cột tạo thành mặt phẳng ngang Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi được xácđịnh nhờ vào các khảo sát thăm dò bằng TLC, tốc độ rửa giải 20 giọt/phút, thu các phânđoạn 20-50 ml Với cột sắc ký tinh chế các phân đoạn được thu từ 3-5ml

+ Khảo sát sắc ký các phân đoạn: Tiến hành khảo sát các phân đoạn nhận đượcbằng TLC, gộp các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau lại, sau đó cất loại kiệtdung môi để thu được các nhóm phân đoạn.

2.1.3 Phương pháp kết tinh lại

Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để làm sạch chất rắn Việc làm sạch chấtrắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của các chất và tạp chất trong dungmôi hoặc hệ dung môi đã chọn và độ tan của chất ở các nhiệt độ khác nhau

2.1.4 Phương pháp xác định cấu trúc các chất phân lập

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR ) được ghi trên thiết bị BrukerAvance 500 Spectrometer

TMS (tetrametyl silan) (1H-NMR) là chất chuẩn nội zero Độ chuyển dịch hóa học

δ được biểu thị bằng ppm, J tính theo Hz

Phổ sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS) được ghi trên thiết bị Varian 320-MS

Điểm nóng chảy không hiệu chỉnh được đo trên máy Boetius

2.2 Thực nghiệm

2.2.1 Nguyên liệu thực vật

Mẫu nghiên cứu là 1 kg thân và rễ cây hoàng cầm đã được làm khô

2.2.2 Chiết các hoạt chất từ thân và rễ cây Hoàng cầm.

Phần tổng quan về thành phần hóa học của cây Hoàng cầm nói chung cho thấy chủyếu chứa Flavonoid,việc chiết chủ yếu được thực hiện ở các dung môi có độ phân cựctrung bình trở lên như điclometan, etyl axetat

1kg Hoàng cầm được ngâm trong methanol ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày Sau đó,lọc lấy dịch chiết, bã nguyên liệu lại được ngâm tiếp với methanol Quá trình này đượctiến hành tương tự như vậy 3 lần Tổng thể tích methanol dùng trong 3 lần là 15l Dịch