Khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên từ thực vật và các phương pháp thử nghiệm invitro và invivo

MỞ ĐẦU Ngày nay, với công phát triển kinh tế việc chăm sóc sức khỏe ban đầu bảo vệ sức khỏe cộng đồng trở nên cấp thiết quốc gia giới Do nhu cầu sử dụng thuốc để phòng ngừa chữa trị bệnh tật ngày tăng cao Việt Nam quốc gia nằm vùng nhiệt đới nóng ẩm, có thảm thực vật phong phú đa dạng với gần 14.600 lồi thực vật có 12.000 thực vật bậc cao chưa kể rêu, tảo, loại nấm Nhiều lồi số sử dụng y học cổ truyền mục đích khác phục vụ chữa bệnh cho nhân dân việt nam suốt trình lịch sử phát triển đất nước Hiện hướng để phịng ngừa chữa trị bệnh tật nghiên cứu tìm kiếm hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên Theo đánh giá tổ chức y tế giới (WHO), 80% dân số toàn giới tin dùng lồi thảo dược cho việc chăm sóc sức khỏe ban đầu khoảng 60% tác nhân hóa trị liệu có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên Việc nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học khơng giúp sử dụng thuốc cách hiệu mà sở cịn phân lập hợp chất để tiến hành tổng hợp hay bán tổng hợp hoạt chất có hoạt tính cao tác dụng phụ điều trị Việc nghiên cứu kế thừa phát huy vốn quí dân tộc đặt lúc vừa vận hội thử thách nhà khoa học nói chung cho nhà nghiên cứu lĩnh vực cơng nghiệp dược nói riêng Bằng nhiều phương pháp thử nghiệm khác nhau, có nhiều nghiên cứu chứng minh ứng dụng hợp chất tự nhiên như: ankaloid, flavonoid, saponin, glycozid, steroid, tinh dầu lĩnh vực y học, dược học thực phẩm chức Bởi tiến hành: Khảo sát hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên từ thực vật và các phương pháp thử nghiệm invitro và invivo Phần Hoạt tính sinh học hợp chất tự nhiên từ thực vật Khái niệm và phân loại hợp chất tự nhiên Hợp chất thiên nhiên sản phẩm hữu trình trao đổi chất thể sống Ngành hóa học nghiên cứu tính chất cấu trúc hợp chất thiên nhiên gọi hóa học hợp chất thiên nhiên Dựa vào chức sinh học người ta chia hợp chất chứa thành hai nhóm lớn: Chất trao đổi bậc : Là chất tham gia vào trình sinh trưởng hydrat cacbon, lipit axit amin, chúng thành phần thiếu cỏ Chất trao đổi bậc hai: Là chất mà vai trị chủ yếu chúng khơng phải để nuôi sống phát triển Chúng có vắng mặt Các chất trao đổi bậc hai thường đối tượng nghiên cứu quan trọng tác dụng sinh lí dược lí chúng, tác dụng kháng sinh, tác dụng diệt nấm, tác dụng ức chế kích thích sinh trưởng tác dụng dược lí, sinh lí khác Ngồi cịn số thành phần vơ Trong hợp chất thiên nhiên thường có nhóm chức bản:        Hợp chất hidrocacbon chưa no Ancol - phenol - ete Andehit- xeton Axit hữu dẫn xuất Amin Dị vòng Hợp chất tạp chức … Dựa vào khung cacbon, nhóm chức theo tính phổ biến hợp chất, hợp chất thiên nhiên thường phân loại thành:        Chất béo - lipit Hidratcacbon- Gluxit Tecpenoit Steroit Coumarin Flavonoit Ankaloit  Tanin  Chất kháng sinh  Vitamin… Hoạt chất sinh học hợp chất hóa học - giống vitamin khoáng chất – cung cấp lượng cho hoạt động sống thể Hoạt tính sinh học hợp chất 2.1 PHENOL - AXÍT PHENOL VÀ DẪN XUẤT * Đặc điểm và phân bơ: Phenol nhóm hợp chất hữu phân tử có nhóm OH liên kết trực tiếp với nhân thơm Các hợp chất phenol nói chung dễ tan nước thiên nhiên chúng thường tồn dạng glycozit Trong hàng ngàn hợp chất phenol thiên nhiên biết rõ cấu tạo hợp chất flavonoit nhóm hợp chất quan trọng Ngồi hợp chất phenol đơn chức vịng, phenylpropanoit quinon chiếm tỉ lệ đáng kể Về poliphenol có lignin, melanin, tanin Các phenol axit phenol thường nghiên cứu chung chúng thường song song tồn với Một số phenol có là: hydroquinon (1,4-dihidroxibenzen), rezocxinol (1,3-dihidroxibenzen), ocxinol (1,3-dihidroxi-5-metylbenzen), phlorogluxinol (1,3,5trihidroxibenzen),catechol (1,2-dihidroxibenzen),pyrogalol (1,2,3-trihidroxibenzen), Các axit phenol thường gặp là: axit p-hydroxibenzoic,axit protocatechic (axit 3,4dihidroxibenzoic), axit vanilic (axit 4-hidroxi-3-metoxi benzoic), axit syringic (axit 4hidroxi-2,3-dimetoxi benzoic),… Các axit phenol tồn dạng kết hợp với lignin tạo thành este với oza dạng glycozit Các axit phenol thường gặp là: axit p-hydroxibenzoic, axit pyrocatechic, axit vanilic, axit syringic, axit gặp axit salixylic, axit o- protocatechic (axit 2,3-dihydroxibenzoic), Ngược với axit phenolic, phenol tự thấy Hydroquinon chất thường gặp cả, tiếp đến catechol, ocxinol, phlorogluxinol, pyrogalol Hợp chất phổ biến axit hydroxyxinamic H3C-O R HO R= H: R= OH: CH=CH-COOH HO CH=CH-COOH R axit p-cumaric axit cafeic R= H :axit ferulic R= OCH3: axit sinapic Các axit hidroxixynamic tồn chủ yếu dạng este, dễ bị thủy phân kiềm cho axit tự Axit cafeic thường tồn dạng este với axit quinic, gọi axit clorogenic Coumarin nhóm hợp chất thiên nhiên xem dẫn xuất lacton axit ortohydroxixynamic (I) Hầu hết coumarin biết (khoảng 600 chất) tồn chủ yếu dạng tự do, số tồn dạng glycozit glycozit psonolen (II) Coumarin phổ biến chất umbeliferin (III) o (I) o o o o o HO (II) o (III) Về phân bố: Coumarin có nhiều họ thực vật: Leguminosen, Umbeliferae, Ochidaceae, Rutaceae Chúng có mặt hầu hết phận cây: rễ, lá, hoa, Đặc tính vật lý: Coumarin chất phát quang mạnh nhạy với ánh sáng Người ta lợi dụng tính chất để tách hợp chất coumarin * Về tác dụng dược lý Coumarin dicoumarin dùng làm thuốc chống đơng máu Tính chất có liên quan đến nhóm OH vị trí C4 cấu trúc Tính chất chống đơng máu biến giảm nhóm OH vị trí bị biến bị thay nhóm khác Ngồi số coumarin có tác dụng làm giản động mạch vành mạch ngoại vi, có tác dụng chống co thắt Một số coumarin có tác dụng làm tăng cholesterol máu Một số chất có tác dụng ức chế sinh trưởng thực vật, tác dụng kháng khuẩn, diệt nấm chống viêm Coumarin dùng để làm thuốc chống đơng máu Ngồi số coumarin có tác dụng làm giãn động mạch vành mạch ngoại vi Đồng thời có tác dụng chống co thắt Một số chất có tác dụng ức chế sinh trưởng thực vật, tác dụng kháng khuẩn, diệt nấm, chống viêm Đã có thơng báo kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tố tế bào (in vitro) với hai dòng ung thư gan người (Hep-2) phổi (LU) với xeton từ 3-axetyl-4-hiđroxi-Nphenylquinolin-2-on với p-nitrobenzanđehit Kết cho thấy hợp chất cho kết dương tính với hai dịng ung thư Nghiên cứu hoạt tính kháng u hợp chất chuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcomal 80 cho thấy với liều lượng 4mg/kg 8mg/kg đạt hiệu lượng kháng u (++) theo thang đánh giá tiêu chuẩn hoạt tính H.Itokawa (1989) Xeton với liều lượng 4mg/kg có tỉ số ức chế u (IR%) lên tới 68.85% 2.2 FLAVONOIT * Đặc điểm và phân bô Flavonoit chất màu thực vật có cấu trúc sau: 2' O 4' 3' 6' 5' Tại vịng có liên 5kết với hay vài nhóm hydroxyl tự hay thay O phần Vì chất chúng poliphenol có tính axit Dựa vào oxy hóa vòng pyran trung tâm, người ta phân flavonoit thành loại khác Phân bố: Nó loại hợp chất phân bố rộng thiên nhiên ( lớn 2000 chất) Nói chung khơng có mặt tảo nấm Các loại thực vật bậc cao có mặt flavonoit, có mặt liên kết phận : thân, lá, rễ, gỗ… khu trú thành tế bào Flavonoit tham gia vào tạo thành màu sắc (đặc biệt hoa) chức flavonoit * Hoạt tính sinh học của flavonoit -Tác dụng chống oxi hóa Các hợp chất phenol flavonoid điều kiện định dễ tạo gốc tự ArO (aryl bền vững) có khả thay gốc tự bền phản ứng peroxy hóa lipit màng tế bào dây chuyền bị cắt đứt Vì gọi gốc ArO tác nhân thu dọn hủy diệt gốc tự có hại Mặt khác, flavonoid ngăn chặn hình thành gốc tự cách kết hợp với ion kim loại nặng (Fe, Mn) vốn tác nhân xúc tác nhiều trình sinh hóa làm xuất gốc tự - Tác dụng flavonoid enzym sinh học Hạn chế biến chứng bênh tiểu đường: thể người bình thường, aldoreductaza khử glucoza thành dulcitol (D – galactitol) Flavonoid kìm hãm hoạt tính enzym Các bệnh dị ứng, hen phế quản: flavonoid có khả kìm hãm hoạt tính enzym proton ATP.aza màng tế bào mastocyl làm cho tác nhân histamin serotonin chứa tế bào không bị ngồi Các siêu vi trùng (virus) gây bệnh lớp vỏ protein bị tiêu hủy lysoxom với tham gia enzym proton ATP.aza phospholipaza A2 Các enzym bị flavonoid kìm hãm Flavonoid vơ hoạt enzym kinaza tế bào ác tính gây virus trở lại thành tế bào bình thường (nghiên cứu in vitro) Đã có nhiều thử nghiệm dùng flavonoid lâm sàng có kết tốt điều trị ung thư vòm họng thuốc lá, - Tác dụng chống viêm Hiện tượng viêm tấy, sưng, đau có liên quan đến giải phóng prostaglandin, thu hút bạch cầu đến nơi tổn thương, gây cảm giác đau sau di chuyển từ máu đến não làm cân trung tâm điều tiết thân nhiệt gây sốt Do flavonoid có khả kìm hãm hoạt tính enzym protaglandin (cyclooxygenaza lipoxyzenaza) Cơ chế giải thích tác dụng chống co thắt trơn, tượng cứng bắp, đau đầu Điều trị bệnh thấp khớp: sử dụng flavonoid điều trị thấp khớp tổ chức liên kết khơng bị phá hủy mà cịn củng cố thêm Cơ chế kết hợp việc ngăn chặn sinh tổng hợp prostaglandin với việc kích thích phản ứng hydroxyl hóa polin nghĩa tạo liên kết chéo collagen Tác dụng gây tê chỗ flavonoid sử dụng trường hợp bị côn trùng đốt cắn, đơi cịn có hiệu lực cocain Có nhiều loại nọc độc có chứa phospholipaza A2 có khả giải phóng axit arachidonic, chất lại chuyển tiếp thành prostaglandin Đối với màng tế bào, flavonoid tự nhiên có khả làm thay đổi tính thẩm thấu Tác dụng sở làm cho nhiều loại flavonoid có tính sát khuẩn diệt nấm - Khả peroxy hóa lipit màng tế bào flavonoid Sự peroxy hóa lipit sinh vật thông qua chế trình gốc tự Những gốc tự sinh từ q trình chuyển hóa thể khơng bền dễ phản ứng Trong đó, gốc tự tạo từ chất flavonoid tự nhiên ArO lại bền vững, khó phản ứng Trong q trình peroxy hóa lipit màng, gốc loại bỏ thay gốc bền dẫn đến cắt đứt q trình Đó chế giải thích chống peroxy hóa lipit flavonoid dẫn tới làm chậm lại q trình lão hóa người 2.3 TINH DẦU * Đặc điểm và phân bơ  Tinh dầu (cịn có tên khác chất thơm, hương thơm, tinh du…) hỗn hợp nhiều chất bay hơi, có mùi đặc biệt có nguồn gốc chủ yếu từ thực vật, thu cách chưng cất chiết dung môi hữu  Nó tan nước, dễ tan ete, dầu béo, dễ bay hơi,  Về phân bố: Cây chứa tinh dầu phân bố rộng nhiều họ thực vật Trong cây, tinh dầu khu trú lá, hoa, quả, rễ,vỏ, thân gỗ…  Thành phần tinh dầu phận giống khác nhau: • Nó hỗn hợp nhiều hợp chất khác nhau: hydrocacbon béo thơm, dẫn xuất chúng ancol, andehit, xeton, este , ete… • Nhưng lại chúng có hai nhóm tecpenoit dẫn xuất phenol Nhóm tecpenoit chủ yếu monotecpen sesquitecpen OH OH • Loại vòng Geraniol linalol myrxen O OH • Loại vòng α -tecpineol tecpinolen limonen O O 1,8- xineol O • Sesquitecpen ln có mặt với monotecpen tinh dầu • Sesquitepen tinh dầu có nhiệt độ sôi 200 oC, fenchon chưng cất camphor αpinen − thujon chúng có hàm lượng khơng cao • Một số sesquitecpen thường gặp * Hoạt tính sinh học Cadinen α − Humulen β − Selinen Caryophyllen • Một số tinh dầu dùng làm thuốc tinh dầu có tác dụng đường tiêu hóa: kích thích tiêu hóa, lợi mật, thơng mật • Tác dụng kháng khuẩn diệt khuẩn: Tác dụng đường hô hấp tinh dầu bạc hà, bạch đàn, tác dụng đường tiết niệu tinh dầu hoa Barosma betulina • Một số có tác dụng kích thích thần kinh trung ương: Dược liệu chứa tinh dầu giàu anethol: đại hồi • Một số có tác dụng diệt ký sinh trùng: trị giun như: tinh dầu giun, santonin, trị sán như: thymol., diệt ký sinh trùng sốt rét như: artemisinin • Rất nhiều tinh dầu có tác dụng chống viêm, làm lành vết thương, sinh cơ, sử dụng ngồi da • Một số dược liệu vừa sử dụng dạng tinh dầu vừa sử dụng dạng dược liệu như: quế, hồi, đinh hương, tiếu hồi, bạc hà, hạt mùi, bạch đàn để dùng làm thuốc, có dược liệu sử dụng tinh dầu: long não, tinh dầu giun Nhưng có nhiều dược liệu chứa tinh dầu sử dụng làm thuốc mà ko sử dụng tinh dầu như: đương qui, bạch truật, thương truật, phịng phong • Một số tinh dầu dùng làm thơm bánh kẹo, loại mứt, đồ đóng hộp: vanilin, menthol • Một số dùng để pha chế rượu mùi: tinh dầu hồi, tinh dầu đinh hương • Một số dùng pha chế đồ uống, sản xuất chè, thuốc lá: tinh dầu vỏ cam, chanh, nhài, bạc hà • Tinh dầu ứng dụng lớn ngành kỹ nghệ pha chế nước hoa, xà phòng, mỹ phẩm 2.4 STEROIT * Đặc điểm và phân bô Steroit hợp chất dẫn xuất xiclopentenophenantren.Chúng gồm nhiều hợp chất thiên nhiên có sterol, axit mật, hocmon giới tính, vitamin D Nhiều steroit có nhiều tính chất quan trọng dùng điều trị bệnh (điều hòa hệ thống nội tiết, chữa viêm khớp…) Hiện steroit dùng điều chế thuốc tránh thai Nhiều ứng dụng steroit chăn nuôi nông nghiệp R R' R'' A C D B xiclopentenophenantren KHUNG STEROIT Sterol phân bố rộng, thường có mặt với ankaloit saponin steroit Chúng có mặt tất phận cây, chủ yếu hạt có dầu dạng tự este, số dạng glycozit * Hoạt tính sinh học Ergosterol tìm năm 1889 cựu lõa mạch, lại tìm thấy men bia nhiều mốc – chất có cơng thức thơ C 28H46O có dãy nối đơi vịng B Bằng cách chiếu tia tử ngoại, biến thành canxiferol vitamin D có tác dụng trị cịi xương Stigmasterol nguồn nguyên liệu để tổng hợp hoocmon nói đến việc sử dụng với khối lượng lớn Vài genin saponozit có nhân sterol (hecogenin, diosgenin) dùng để bán tổng hợp hoocmon sinh dục vỏ thượng thận Ngày nay, người ta dùng sitosterol ngũ cốc chất phòng xơ cứng động mạch, làm chất mềm thành mạch, mặt phịng hấp thụ cholesterol ruột cách tạo phức chất khơng tan, mặt khác có tác dụng trị xơ mỡ động mạch 2.5 SAPONIN * Đặc điểm và phân bô Saponin thuật ngữ để nhóm glucozit có đặc điểm chung hồ tan nước có tác dụng giảm sức căng bề mặt dung dịch tạo nhiều bọt Dưới tác dụng enzym thực vật hay vi khuẩn, axit loãng saponin bị thuỷ phân tạo thành genin (gọi sapogenin) phần đường Phần đường gồm hay số phân tử monosaccarit:phổ biến DGlucoza, D-Galactoza, L-Arabioza, L-Rammoza Dựa vào cấu trúc sapogenin người ta chia thành nhóm lớn  Sapogenin tritecpen  Sapogenin steroid Về phân bố: Saponin phân bố rộng, đà tìm thấy 80 họ thực vật Saponin steroid tập trung chủ yếu mầm saponin tritecpen có nhiều hai mầm * Hoạt tính sinh học 10 trạng thái tự dạng glycozit, chất phổ biến peroxydaza thực vật [10] * Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm hoạt động của enzym peroxydase máu người theo theo phương pháp E xavron [10] Nguyên tắc: Dựa sở xác định tốc độ phản ứng oxy hóa indigocarmin H2O2 mơi trường axit yếu có mặt enzym peroxydaza máu người Trong thí nghiệm sử dụng peroxydaza thuộc nhóm máu A, B, AB O xác định ảnh hưởng polyphenol lên phản ứng oxy hóa indigocarmin Thơng qua thay đổi hoạt độ enzym có mặt dịch chiết khác từ thực vật Tiến hành: Vật liệu: - Máu tươi chống đông ADC, pha loãng 500 lần dung dịch NaCl 0,9 % - Chất thử pha DMSO 100 % thêm vào cho đạt nồng độ 128 μl; 32 μl; μl; μl; 0,5 μl nồng độ DMSO phản ứng không lớn % Sau pha dung dịch RB đĩa elisa thứ Đĩa thứ đĩa phản ứng Phản ứng: Lấy 10 μl chất thử từ đĩa RB vào giếng lấy thêm vào giếng chất sau: - 60 μl đệm axetat natri pH 4,7 0,1N - 60 μl pha loãng 500 lần sau lấy khỏi tủ lạnh sâu - 60 μl H2O2 0,2N - 20 μl Indigocarmin 0,001 N pha trước dùng Riêng giếng Ctr- khơng có enzym, thay enzym dung dịch đệm Điều khiển âm khơng có enzym, điều khiển dương enzym hoạt động 100 % Để thời gian phản ứng 20 phút, đọc kết bước sóng 610 nm Xử lý kết quả: Tính hoạt động enzym peroxydaza (AE %) theo công thức sau: AE % = [ODctr- - ODtest ] / [ ODctr- - ODctr+ ] x 100 % 53 % kìm hãm hoạt động enzym tính cơng thức: IC = 100 − AE % (%) Giá trị IC nồng độ ức chế 50 % hoạt động enzym tính dựa đồ thị điểm giá trị IC ứng với nồng độ chất thử phần mềm Excel D Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống viêm Viêm phản ứng không đặc hiệu mô bị cơng yếu tố hóa học, vật lý hay sinh học Phản ứng viêm phát triển thành hai giai đoạn Giai đoạn thứ tiến triển nhanh giai đoạn cấp tính Giai đoạn thứ hai bao gồm tượng phức tạp, phối hợp tượng viêm q trình sữa chữa, giai đoạn mạn tính Mỗi giai đoạn q trình viêm nghiên cứu phương pháp thích hợp Các phương pháp nghiên cứu phù thực nghiệm 1.1 Thử nghiệm phù chân chuột gây kaolin Dùng chuột cống trắng Trước thí nghiệm, cho chuột uống nước 0,5 ml cho 100g thể trọng Gây phù bàn chân chuột cách tiêm da bề mặt gan bàn chân sau chuột 0,1 ml dịch treo chứa 1g kaolin 10 ml dung dịch có 0,2% gơm adragan, pha chế trước tiêm, để lâu, kaolin lắng xuống Đo thể tích bàn chân sau tới khớp cổ chân dụng cụ đo thể tích nước giờ sau tiêm kaolin (vào lúc phù chân chuột gây kaolin mức độ cao nhất) Mức độ tăng thể tích chân chuột biểu thị mức độ viêm cấp tính theo công thức: X % = (V5 - V0/V0) x 100 Trong đó: X % tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột, V thể tích bàn chân trước tiêm kaolin, V5 thể tích bàn chân giờ sau tiêm kaolin Thuốc thử nghiệm, cho uống cho chuột uống giờ trước tiêm kaolin, tiêm thuốc tiêm 30 phút trước tiêm kaolin Chuột đối chứng cho dung dịch NaCl đẳng trương Tác dụng ức chế phù biểu thị tỷ lệ % giảm mức độ tăng thể tích bàn chân lơ chuột thử thuốc so với mức độ tăng lô đối chứng tính theo cơng thức: 54 Y % = MC - MT/MC x 100 Trong đó: Y % tỷ lệ % giảm mức độ phù bàn chân chuột, M C tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột lô đối chứng, MT tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột lơ thử thuốc 1.2 Thử nghiệm phù chân chuột gây carragenin Trong thử nghiệm này, gây phù bàn chân sau chuột cách tiêm da bề mặt gan bàn chân sau chuột 0,1 ml dịch treo 0,8 % carragenin, pha nước cất hay dung dịch NaCl đẳng trương Cách pha dịch treo: cho carragenin vào cối nhỏ, cho dần nước vào nghiền chầy cho phân tán Để nửa giờ cho phồng lên dùng Chỉ pha trước dùng, để lâu carragenin lắng xuống Trong trình viêm gây carragenin, mức độ viêm tối đa khoảng thời gian - giờ Nên để đánh giá mức độ viêm, thể tích bàn chân tới khớp cổ chân trước giờ sau tiêm carragenin Trừ số đặc điểm nêu trên, thử nghiệm phù chân chuột gây carragenin tiến hành tương tự phù chân chuột gây kaolin Carragenin (viscarin) chất sulfopolygalactosid, chiết xuất từ Chondrus crispus, có tác dụng gây viêm Thử nghiệm ban đỏ gây tia tử ngoại chuột lang Dùng chuột lang trắng, cân nặng tối thiểu 300g Cạo lông thật kỹ bên cột sống (xén lông bôi nước làm rụng lông), giờ sau, chuột sẵn sàng để thử nghiệm Việc chọn chất làm rụng lông quan trọng Một số chế phẩm làm rụng lông gây kích thích da sau để nghỉ giờ, điều làm sai lệch đánh giá ban đỏ Mỗi lô gồm chuột lang chiếu tia tử ngoại làm đối chứng, chuột giữ tư nằm sấp khoảng cách 30 cm với đèn tử ngoại 400w Sự chiếu tia kéo dài 30 phút, giờ sau ban đỏ mức tối đa trông rõ Ngày hôm sau, chuột lang chiếu tia tử ngoại lần thứ hai bên cột sống, cho thuốc thử nghiệm ống thông vào dày Chất tham chiếu aspirin với liều 240 mg/kg cho uống Mọi chế phẩm có hoạt tính phải ức chế 50/100 ban đỏ so với mức ban đỏ đối chứng, chuột lang đối chứng thân nó, làm thử nghiệm trắng ngày hôm trước hôm thử nghiệm thuốc 55 Cần kiểm tra đặn hoạt tính aspirin, có lúc khơng thấy aspirin có hoạt tính Việc điều trị với liều lớn buộc phải thẩm tra xuất triệu chứng độc, khoảng thời gian 24 giờ thử nghiệm Trong trường hợp có triệu chứng độc, kết khơng có giá trị Làm lại thí nghiệm với liều thấp khơng cịn có triệu chứng độc Thử nghiệm phương pháp chiếu tia tử ngoại nghiêm ngặt thử nghiệm phù chân chuột, không kích thích tuyến thượng thận Có thể áp dụng để nghiên cứu thuốc chống viêm dạng pomad, lưng chuột lang bôi thuốc trước chiếu tia Các thử nghiệm phù chân chuột với carragenin ban đỏ chiếu tia tử ngoại bổ sung cho Trong thử nghiệm gây ban đỏ, đánh giá mức độ viêm cách đo diện tích ban đỏ Các phương pháp nghiên cứu u hạt thực nghiệm 3.1 Thử nghiệm u hạt thực nghiệm gây amian Thí nghiệm tiến hành chuột cống trắng Một mẩu sợi amian đường kính mặt cắt khoảng 2mm, có trọng lượng 30 ± mg vê tròn sấy tiệt khuẩn giờ nhiệt độ 1600C tủ sấy Chuột gây mê ether Cạo lơng vùng lưng phía trên, dùng kéo phẫu thuật mắt bấm lỗ chếch sang bên, luồn kéo vào hướng lên đầu, mở rộng mũi kéo để tách kỹ da lưng khỏi cơ, cấy da, vào nơi bóc tách, viên sợi amian Đặt kẹp khâu để nối liền chỗ mổ lưng Thuốc cho uống tiêm da buổi sáng ngày liên tục, lần đầu cho thuốc sau cấy viên sợi amian Chuột đối chứng cho nước muối sinh lý với thể tích Chiều ngày thứ kể từ ngày mổ (ngày mổ: ngày 1), giết chuột cloroform, bóc tách u hạt cân tươi u hạt, cân, để miếng giấy khơng hút ẩm Tính trọng lượng thực u hạt cách trừ trọng lượng viên sợi amian (30 mg) Khi mổ chuột, dùng dụng cụ tiệt khuẩn cách luộc nước đun sơi Sau ngâm cốc có chân đựng cồn 90 cho lượng thuốc kháng sinh Mỗi lần dùng xong lại đặt ngâm dụng cụ vào 56 Tác dụng ức chế tạo u hạt biểu thị tỷ lệ % giảm trọng lượng trung bình u hạt lơ thử thuốc so với trọng lượng lô đối chứng Lưu ý tiệt khuẩn viên sợi amian, gói miếng giấy khơng hút ẩm 3.2 Thử nghiệm áp xe gây tinh dầu thông Việc tiêm tinh dầu thông cho chuột cống trắng da gây nên áp xe vô khuẩn Áp xe định hình rõ sau trung bình ngày phát triển, bóc tách lấy áp xe cân Trọng lượng áp xe cho phép đánh giá tầm quan trọng phản ứng viêm Phương pháp dễ áp dụng với điều kiện quan tâm thực số quy định Lượng tinh dầu thông tiêm da khơng q 0,5 ml, tiêm thể tích lớn gây hoại tử rộng da chung quanh chỗ tiêm Cần ý nơi tiêm, nơi tiêm thích hợp chuột cống trắng vùng gian vai, khoảng chỏm xương bả vai, vùng này, mô liên kết da dày đặc lót lớp đáng kể tế bào mỡ ngăn cản lan tỏa chất kích ứng Cuối cùng, cần phải tiêm tinh dầu tuyệt đối vô khuẩn Thử nghiệm gây dịch rỉ màng phổi chuột cống trắng già Dùng chuột cống trắng già 180 – 260 g Cho chuột uống ml nước ống thơng vào dày Sau để chuột nằm ngửa, cạo lông bên sườn phải, chân trước Dùng bình hút ẩm, lót bơng đáy, tẩm ether để gây mê chuột Đồng thời chuẩn bị cốc vại đáy lót bơng tẩm ether để tiếp tục gây mê chuột tỉnh trở lại Chuẩn bị tinh dầu thông Sau cho chuột uống nước giờ, tiến hành gây dịch rỉ màng phổi chuột sau: cho chuột vào bình có ether để gây mê, chuột mê, lấy ra, đặt nằm nghiêng Dùng kéo nhỏ đầu nhọn, rạch nhát dài cm chỗ cạo lông da lớp cơ, để thấy rõ xương sườn Tiêm 0,15 ml tinh dầu thông màng phổi vào khoảng hai xương sườn, dùng kim tiêm dài 1,5 cm, loại kim to Để bơm tiêm theo chiều thẳng đứng bơm tinh dầu thông Đặt kẹp nối liền hai mép vết rạch Sau giờ rưỡi kể từ tiêm tinh dầu thông màng phổi, giết chuột cách cho ngửi cloroform bình kín Sau để chuột nằm ngửa, mổ từ bụng lên, rạch hai 57 vết dọc hai bên hoành Dùng cặp phẫu tích kẹp vào xương ức nâng lên cao Dùng ống nhỏ giọt hút hết dịch rỉ hai màng phổi Khi hết, dựng nửa người chuột lên để dốc dịch rỉ xuống hút lần cho thật hết Cho dịch rỉ vào ống nghiệm có chia độ, đo lượng dịch rỉ với chuột Trong trường hợp cần thiết, định lượng histamin serotonin dịch rỉ Cho giọt heparin vào ống nghiệm trước cho dịch rỉ vào ống Ống nghiệm trường hợp ngâm nước đá cục Thử nghiệm viêm đa khớp thực nghiệm Mycoplasma arthritis 5.1 Việc gây viêm đa khớp gồm ba giai đoạn Giai đoạn thứ nhất: Nghiền mảnh sarcom lympho Murphy chứa Mycoplasma arthritis môi trường tốt cho phát triển yếu tố gây bệnh Cần 20 g khối u để thực gây viêm đa khớp 30 chuột cống trắng cân nặng 120 150 g Chất nghiền làm thành dịch treo phần dung dịch NaCl 0,9 % có cho thêm 400000 đơn vị penicilin 1000000 đơn vị colistin methansulfonat để tránh bội nhiễm vi khuẩn thường Hỗn hợp ly tâm 30 phút phần bên giữ lại Giai đoạn thứ hai: Sản xuất dịch rỉ để gây viêm khớp Tiêm 30 ml khơng khí vơ khuẩn da lưng chuột cống trắng 120 - 150g để gây tràn khí da, tiêm ml chất bên giữ lại giai đoạn thứ vào Sau - 10 ngày, túi chứa 5-10 ml dịch đục chứa nhiều vi khuẩn Mycoplasma arthritis, lấy dịch cách vơ khuẩn, dịch phải dùng ngay, giữ hoạt tính nhiều tuần nhiệt độ - 200C Giai đoạn thứ ba: Gây viêm đa khớp Trên chuột cống trắng khác cân nặng 120 - 150g, cần tiêm phúc mạc ml hỗn hợp gồm phần dịch rỉ dung dịch dextran % Hỗn hợp gây viêm khớp gây viêm đa khớp 85 % chuột Những triệu chứng viêm khớp xuất vào ngày thứ ba hay thứ tư Các triệu chứng đạt mức tối đa cường độ số lượng vào ngày thứ 9, bắt đầu giảm vào ngày 12 đến ngày 15, hẳn vào ngày 20, để lại cứng khớp thể xơ Chứng viêm đa khớp quan sát thấy nhiều khớp xa nơi tiêm, khớp chày - cổ chân, 58 khớp quay – cổ tay, khớp xương cổ chân, khớp xương cổ tay khớp đốt ngón tay, chân Đầu gối khuỷu tay bị viêm, cột sống thường không bị viêm Ở khớp viêm, da đỏ, nóng, sưng phần mềm tăng thể tích, đơi có tượng viêm tấy Viêm khớp khơng có mủ 5.2 Đo cường độ viêm đa khớp Việc quan sát hàng ngày khớp hay nhóm khớp, qua da cạo nhẵn chân trước sau, cho phép xác định số viêm khớp, điểm tương ứng với trạng thái bình thường, điểm tương ứng với ban đỏ nhẹ, điểm vừa ban đỏ vừa sưng, điểm trạng thái sưng tấy giả Hàng ngày cộng số viêm khớp chuột người ta số viêm mà trị số tối đa lý thuyết 48 Với phương pháp này, ngày thứ ta đạt số viêm 9,45 ± 0,72, ngày thứ số viêm 16,07 ± 0,08 Sau 12 ngày, số viêm giảm dần Những kết có ý nghĩa đạt ngày thứ thứ 10 Lưu ý: Thủ thuật phải thực điều kiện vơ khuẩn, thí nghiệm phải tiến hành với lô dịch rỉ gây viêm khớp Lượng dịch rỉ gây viêm khớp thích hợp 0,5 ml, số viêm tỷ lệ với lượng dịch rỉ viêm liều 0,125, 0,250 0,5 ml Những liều cao không làm tăng số, liều nhỏ làm viêm khớp chậm phát triển 5.3 Thử nghiệm tác dụng chông viêm khớp của thuôc Thuốc thử nghiệm cho uống tiêm da hàng ngày ngày, bắt đầu từ ngày tiêm dịch rỉ để gây viêm khớp Động vật ni giữ tuần trước thí nghiệm tất thời gian thí nghiệm nhiệt độ định 23 0C, cho chế độ ăn tiêu chuẩn hóa nước uống tùy thích Thử nghiệm viêm khớp thực nghiệm gây chất bổ trợ Freund Phương pháp gây bệnh giống viêm khớp bàn chân chuột cống trắng Dùng nhóm chuột cống đực trắng, không mang tác nhân gây bệnh, cân nặng khoảng 200 g Cho chuột uống thử nghiệm Với nhóm thử thuốc, có nhóm đối chứng Một ngày sau, đo bàn chân phải sau độ dày trắc vi kế qua phần dọc 59 Tiêm nội bì bề mặt gan bàn chân bàn chân 0,05 ml chất bổ trợ kim tiêm số 20 Chất bổ trợ Freund hỗn hợp vi khuẩn Mycobacterium chết parafin lỏng, dùng dầu khống dầu thực vật, số trực khuẩn kháng acid, gây hội chứng kiểu viêm khớp Trong phương pháp này, dùng trực khuẩn lao từ chủng người PN, DT C, để vi khuẩn phát triển tuần, diệt vi khuẩn nước, sấy khô vi khuẩn tủ sấy chân không Tiếp tục cho chuột uống thuốc thử nghiệm tới ngày thứ 13, lúc cân thể trọng chuột Đo độ dày bàn chân tiêm tính tỷ lệ % tăng độ dày bàn chân Mức tăng độ dày đến mm ± 0,5 mm chuột đối chứng, 13 ngày sau tiêm dịch treo vi khuẩn Mức độ nghiêm trọng tổn thương thứ phát, sưng bàn chân trái sau, sưng bàn chân trước, sưng tai sưng đuôi đánh giá không, nhẹ, vừa, nặng vừa, nặng Đuôi chuột đối chứng có số hịn dọc theo phần đuôi Tỷ lệ % ức chế tăng độ dày bàn chân tiêm tính theo cơng thức: i =100 [1-(a-x)/(b-y)] Trong i tỷ lệ % ức chế, y độ dài trung bình bàn chân phải sau chuột đối chứng trước tiêm, b độ dày ngày thứ 13, x độ dày trung bình bàn chân phải sau chuột thử thuốc trước tiêm, a độ dày trung bình ngày thứ 13 Phương pháp dựa hội chứng coi gần gũi với viêm khớp dạng thấp so với thử nghiệm khác Hoạt tính chống viêm phần lớn loại thuốc chống sốt rét có liên quan với cloroquin Thử nghiệm viêm đa khớp chuột cống trắng gây chất bổ trợ (chất sáp D) phân lập từ trực khuẩn lao 7.1 Cách tiến hành Chất sáp D phân tán đồng hóa hỗn dịch gồm phần Tween 80, phần dầu parafin phần dung dịch NaCl 0,9 % Chất bổ trợ cuối có mg sáp D ml Hỗn dịch bảo quản lọ, tiệt khuẩn 12 0C tủ sấy nửa giờ, lắc trước dùng Thí nghiệm chuột cống trắng Wistar, 60 từ 30 đến 90 ngày tuổi ( để có tỷ lệ viêm khớp 80 – 100 %) Tiêm da gan bàn chân sau chuột 0,5 ml hỗn dịch vô khuẩn để gây viêm khớp 7.2 Mô tả viêm khớp và những tổn thương khác phủ tạng - Tổn thương khớp: Có hai loại, viêm khớp xuất sớm nơi tiêm viêm đa khớp thứ phát xuất ngày thứ 10 25 sau tiêm chất bổ trợ Viêm khớp xuất sớm khơng đặc trưng, gây nên tác dụng kích ứng chất bổ trợ Phù đỏ da xuất sau 24 giờ, phản ứng viêm tiến triển cách kín đáo - ngày, tăng lên xuất viêm đa khớp thứ phát Viêm đa khớp thứ phát phản ứng tăng cảm chậm Đó viêm khớp di trú, thường gây tổn thương khớp chi Những khớp đuôi chuột bị viêm Viêm khớp kèm theo viêm khuếch tán gân bao gân Phản ứng viêm tiến triển theo thể cấp tính hay bán cấp nhiều tuần, kèm theo sút cân, đạt mức tối đa ngày thứ 10 15 sau xuất hiện, sau trung bình tháng, để lại tổn thương dinh dưỡng tiến triển: phì đại xương, cứng khớp co rút mô liên kết quanh khớp Đôi khi, phản ứng viêm nhẹ khơng để lại di chứng, có khớp lành bị mắc bệnh viêm sau, khớp bị viêm trước lại bị viêm lại - Tổn thương phủ tạng: Các tổn thương kèm theo viêm đa khớp số trường hợp, không bao giờ xảy viêm khớp Đó tổn thương hệ bạch huyết, hạch phụ thuộc chân tiêm chất bổ trợ chi bị bệnh luông bị sưng, tổn thương da thể hòn, thể ban khởi phát thời bệnh da mạn tính, tổn thương niêm mạc Các tổn thương niêm mạc diễn mắt: viêm kết mạc, viêm giác mạc, viêm mống mắt-thể mi, máy niệu sinh dục: viêm niệu đạo quy đầu bao, đường tiêu hóa: tiêu chảy, thường phối hợp với viêm quy đầu viêm niệu đạo 7.3 Đánh giá mức độ viêm khớp giai đoạn viêm Có hai phương pháp dùng: 61 - Xác định chủ quan cường độ, đỏ phù khớp chi da cạo nhẵn, nghiên cứu riêng mức độ viêm chân tiêm Cách đánh giá cường độ phản ứng viêm từ đến khớp khớp: khớp xương quay – cổ tay, khớp chày – cổ chân, khớp đốt phía chân trước chân sau Những khớp xương bàn tay – ngón tay khớp xương bàn chân-ngón chân coi khớp Cụ thể: trạng thái bình thường, ban đỏ, vừa đỏ vừa sưng, viêm tấy giả, tổn thương hoại tử chân viêm Chỉ số viêm tối đa 36 viêm đa khớp thứ phát 16 viêm khớp nguyên phát - Đo thay đổi chiều dày bàn chân sau tiêm Cũng có mức độ đánh giá cường độ tổn thương thứ phát: bình thường, nhẹ, vừa, nặng, ý tới thể trọng động vật 7.4 Thử tác dụng thuôc chông thấp khớp viêm khớp nguyên phát Ward (1962) cho thuốc hàng ngày cho động vật thí nghiệm 21 ngày kể từ tiêm chất bổ trợ, trộn lẫn thuốc với thức ăn Kết đạt từ lô thử nghiệm gồm 15 chuột cống trắng chứng 15 chuột thử thuốc, cho liều thuốc Ngày thứ 13, xác định hiệu lực thuốc thử nghiệm Newbould (1963) cho thuốc hàng ngày cho động vật thí nghiệm 14 ngày, liều đầu cho ngày trước tiêm chất bổ trợ Tác dụng thuốc đo ngày thứ 13 kể từ tiêm chất bổ trợ Nghiên cứu dung nạp thuốc chống viêm dày Dùng lô chuột cống trắng đực Wistar cân nặng 200 - 250g, lơ 12 Để chuột nhịn đói khơng cho ăn thức ăn đặc, cho uống nước ngày, hàng ngày cho qua ống thông thực quản thuốc chống viêm, ví dụ như: hay 10 mg indomethacin /kg, 0,05 hay 0,1 mg dexamethason /kg Quan sát đại thể niêm mạc dày chuột xác nhận tác dụng gây loét dexamethason indomethacin Tác dụng gây loét dày đánh giá xét nghiệm đại thể kính lúp Mức độ nặng nhẹ tổn thương ghi nhận phương pháp đánh sau: + Tổn thương nhỏ hình chấm 62 ++ Tổn thương vết cấu móng tay, to hơn, từ 2-5 mm đường kính +++ Vết nứt rạn sâu, lõm xuống Đếm số lượng loại loét, tính tổng cộng số điểm Người ta xác định cách định lượng cường độ trung bình vết loét Khi thử nghiệm dung nạp dày thuốc chống viêm cho lô chuột khác qua ống thông thực quản liều hàng ngày sau: a Liều có tác dụng ức chế phù bàn chân chuột cách rõ ràng (một lần ngày) b Liều gấp đôi liêu (chia làm lần ngày) E Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống ung thư PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỘ ĐỘC TẾ BÀO Thiết bị nghiên cứu - Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170) - Tủ cấy sinh học an toàn cấp II - Máy li tâm (Universal 320R) - Kính hiển vi ngược (Zeizz) - Tủ lạnh sâu - 25 0C, - 80 0C; - Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa Kỳ) - Máy quang phổ (Genios Tecan) - Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào - Các dụng cụ thí nghiệm thơng thường khác Các dịng tế bào Các dòng tế bào ung thư người cung cấp ATCC gồm: KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mơ, dịng ln ln sử dụng phép thử độ độc tế bào; Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan; LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú Phương pháp thử độc tế bào Phương pháp thử độ độc tế bào phép thử nhằm sàng lọc, phát chất có khả kìm hãm phát triển diệt tế bào ung thư điều kiện in vitro 63 Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu nuôi cấy môi trường ni cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết phơi bị (FBS) thành phần cần thiết khác điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37 oC; độ ẩm 98 %; vô trùng tuyệt đối) Tùy thuộc vào đặc tính dịng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển khác Tế bào phát triển pha log sử dụng để thử độc tính Thử độc tế bào: Mẫu thử pha lỗng theo dãy nồng độ 128 µg/ml; 32µg/ml; 8µg/ml; 2µg/ml; 0,5µg/ml Bổ xung 200µl dung dịch tế bào pha log nồng độ x 10 tế bào/ml vào giếng (đĩa 96 giếng) môi trường RPMI 1640 cho dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, KB; mơi trường DMEM cho LU-1 Giếng điều khiển có 200 µl dung dịch tế bào x 104 tế bào/ml Ủ 37 0C/ % CO2 Sau ngày thêm 50 µl MTT (1mg/ml pha mơi trường ni cấy không huyết thanh) ủ tiếp 37 0C/4 giờ; loại bỏ mơi trường, thêm 100 µl DMSO lắc đọc kết bước sóng 540 nm máy spectrophotometter Genios TECAN Phần trăm kìm hãm phát triển tế bào (Growth inhibition) = (OD điều khiển – OD mẫu) / OD điều khiển Giá trị IC 50 tính dựa kết số liệu phần trăm kìm hãm phát triển tế bào phần mềm máy tính table curve F Một số ví dụ * Tác dụng của polyphenol đôi với bệnh viêm khớp Tiến sĩ Tariq công tác trường đại học Western Reverve Cleveland, Ohio(Mỹ), nhóm nghiên cứu tìm hiểu tác động polyphenol bệnh viêm khớp tiến triển tăng dần với triệu chứng: viêm sưng, đau nhức, thoái hoá khớp Những chuột phịng thí nghiệm cho uống: nước trà xanh với liều lượng tương đương tách ngày người uống nước lã Sau chúng thử nghiệm bị tiêm collagen vào để nhằm mục đích gây bệnh viêm khớp tiến triển tăng dần người Kết nghiên cứu cho thấy chuột uống trà xanh bị viêm khớp so với chuột uống nước lã Tuy nhiên cho dù chúng có mắc bệnh viêm khớp chuột uống trà xanh mắc bệnh sơ sài vào thời gian lâu sau 64 * Tác dụng của lycopene đôi với ung thư tuyến tiền liệt Nhiều chứng khoa học cho thấy, hàm lượng lycopene máu cao có liên quan đến việc làm giảm nguy mắc ung thư tuyến tiền liệt Thí nghiệm Erdman sau: cho chuột lang tiếp xúc với chất gây ung thư tuyến tiền liệt, sau ni chúng theo chế độ dinh dưỡng khác gồm: bột nguyên cà chua, bột lycopene, bột không chứa lycopene Những ăn bột khơng chứa lycopene coi nhóm đối chứng Khi kết thúc thí nghiệm, khác biệt thực rõ nét: bệnh ung thư tuyến tiền liệt tiêu diệt 80% số chuột nhóm đối chứng, 72% nhóm ăn bột lycopene Nhóm ăn bột nguyên cà chua có số tử vong thấp nhất, chiếm khoảng 62% * Tác dụng của polyphenol đôi với bệnh ung thư kết tràng Chất ly trích polyphenol lấy từ trà xanh giúp tránh bệnh ung thư kết tràng (colon cancer) Thí nghiệm đươc thực Đai học Rutgers, Piccataway, New Jersey hướng dẫn giáo sư Hang Xiao Trong thí nghiệm, chuột đươc chích azoxymethane, hóa chất làm phát sinh khối u ung thư kết tràng Các khối u chuột có đặc điểm tương tư khối u kết tràng người Sau chuột mắc bệnh đươc ni theo chế độ ăn uống tây phưong chứa nhiều chất béo vòng 34 tuần lễ Trong thức ăn số chuột có trộn thêm polyphenol E với lương tương đương với khoảng bốn đến sáu tách trà xanh ngày So sánh kết chuột có ăn không ăn polyphenol E nhà khoa học nhận thấy polyphenol Eđã giảm tổng số khối u bình quân cho chuột giảm kích thước khối u * Tác dụng của cucurmin từ củ nghệ đôi với bệnh ung thư vú Trong thử nghiệm, tiến sĩ Bharat Aggarwal, Đại học tổng hợp Texas, cộng tiêm vào chuột tế bào ung thư vú người nuôi cấy từ bệnh nhân ung thư 65 vú bị di tới phổi Người ta khối u tự phát triển chuột, tiến hành phẫu thuật cắt bỏ, giống phẫu thuật mổ vú Sau đó, số chuột bệnh ngẫu nhiên chia thành nhóm để theo dõi khi: khơng tiếp tục điều trị; điều trị curcumin; thuốc có tên Taxol; kết hợp curcumin Taxol Kết cho thấy, nửa số chuột nhóm điều trị curcumin 22% nhóm kết hợp curcumin với Taxol có dấu hiệu di tới phổi Trong đó, tỷ lệ di nhóm dùng Taxol 75% nhóm khơng điều trị 95% Tài liệu tham khảo Đặng Thị Thu tác giả Cơ sở Công nghệ Sinh học, tập – Cơng nghệ Hóa sinh NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, 2009 Nguyễn Văn Bời Trường ĐH Công nghiệp TP Hồ Chí Minh Hợp chất thiên nhiên, 2010 GS TSKH Phạm Trương Thị Thọ Giáo trình Hóa học hợp chất thiên nhiên NXB Giáo dục, 2012 PGS TS Đỗ Thị Hoa Viên Trường ĐH Bách khoa Hà Nội Bài giảng mơn Các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc thực vật, 2012 TS Phan Quốc Kinh Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học NXB Giáo dục, 2011 Viện dược liệu Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ thảo dược cỏ Việt Nam 66 ...Phần Hoạt tính sinh học hợp chất tự nhiên từ thực vật Khái niệm và phân loại hợp chất tự nhiên Hợp chất thiên nhiên sản phẩm hữu trình trao đổi chất thể sống... ODthử)/ODchứng - ODtrắng] x 100 OD: Mật độ quang 2.5 Phương pháp xác định hoạt tính peroxydaza máu người theo phương pháp E.Xavron * Vài nét Enzym Peroxydaza máu Peroxydaza thuộc nhóm... luận chất có tác dụng, chất khơng có tác dụng B Các phương pháp xác định khả kháng nấm Những yếu tố ảnh hưởng 1.1 Về tính tan của chất thử nghiệm Trong môi trường nuôi cấy vi nấm, pH tốt