BÁO CÁO THỰC HÀNH SÁC KÝ

Phân loại Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại: Trong đó, sắc ký phân bố SKPB được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HÔ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH SÁC KÝ

GVHD: ThS PHÙNG VÕ CẨM HỒNG

M C L C ỤC LỤC ỤC LỤC

BÀI 1 ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C BẰNG SÁC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3

1.1 Khái niệm ……… 3

1.2 Phân loại .3

1.3.Mục đích thực hành 4

1.4 Nguyên tắc 4

1.5 Dụng cụ và thiết bị 4

1.6 Hóa chất 4

1.7 Tiến hành thực hiện 5

BÀI 2 PHÂN TÍCH KIM LOẠI NẶNG TRONG NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP F-AAS 6

1 Nguyên tắc thiết bị 6

1.1 Giới thiệu phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 6

1.2 Nguyên tắc của phép đo 7

1.3 Trang bị của phép đo F-AAS 8

2 Tiến hành thí nghiệm 9

2.1 Chuẩn bị chuẩn 9

2.2 Chuẩn bị mẫu 10

2.3 Tiến hành chạy máy phân tích mẫu 10

2.4 Kết quả chạy máy 10

3 Phân tích kết quả 11

4 Kết luận 12

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ CHẤT LƯỢNG NƯỚC MẶT 12

BÀI 3 SỬ SẮC KÝ KHÍ ĐẦU DÒ ECD ĐỂ ĐO HÀM LƯỢNG CYPERMATHIN TRONG ĐẤT 14

I Giới thiệu về sắc kí khí 14

1 Khái niệm 14

2 Cấu tạo máy sắc kí 15

3 Phương tiến hành pháp thí nghiệm 18 III Kết quả và tính toán 19 Tài liệu tham khảo: 22

NỘI DUNG

BÀI 1 ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C BẰNG SÁC KÝ LỎNG HIỆU

NĂNG CAO (HPLC)1.1 Khái niệm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang

đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừsâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

1.2 Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khốilượng phân tử không quá lớn (<3000)

SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).

Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động Pha tĩnh loại này sẽ có

ái lực với các hợp chất phân cực SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm

SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT

1.7.2 Điều kiện chạy máy sắc ký lỏng cao áp

VTMC Linear (VTMC)

BÀI 2 PHÂN TÍCH KIM LOẠI NẶNG TRONG NƯỚC BẰNG

PHƯƠNG PHÁP F-AAS

1 Nguyên tắc thiết bị

1.1 Giới thiệu phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

Phép đo AAS là một kỹ thuật phân tích hoá lý đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học kỹ thuật, trong sản xuất công nghiệp, nông nghiệp, y dược , địa chất, hoá học ở nhiều nước trên thế giới, nhất là các nước phát triển, phương pháp phân tích phổ AAS đã trở thành một phương pháp tiêu chuẩn để phân tích lượng vết các kim loại trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau như đất, nước ,không khí, dược phẩm, các mẫu y sinh học,

Với các trang bị và kỹ thuật hiện nay, bằng phương pháp phân tích này người ta cóthể định lượng được hầu hết các kim loại (khoảng 65 nguyên tố) và một số á kim đến giớihạn nồng độ cỡ ppm bằng kỹ thuật F-AAS và đến nồng độ ppb bằng kỹ thuật ETA-AAS với sai số không lớn hơn 15%

1.2 Nguyên tắc của phép đo

Cơ sở lý thuyết của phép đo này là sự hấp thụ năng lượng bức xạ đơn sắc của nguyên

tử tự do ở trạng thái hơi (khí) khi chiếu một chùm tia sáng có bước sóng xác định qua đám hơi của nguyên tố cần phân tích trong môi trường hấp thụ Vì thế muốn thực hiện phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố cần phải thực hiện các quá trình sau:

hơi các nguyên tử tự do của nguyên tố phân tích Đám hơi này chính là môi trườnghấp thụ bức xạ

nguyên tử tự do, các nguyên tử của nguyên tố cần xác định trong đám hơi đó sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và sinh ra phổ hấp thụ của nó

và chọn một vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần phân tích để đo cường độ của nó

Trong một giới hạn nhất định của nồng độ, giá trị cường độ này phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C của nguyên tố cần phân tích trong mẫu theo phương trình:

A⋋ = k.C Trong đó, A⋋ : cường độ của vạch phổ hấp thụ

k : hằng số thực nghiệm

C : nồng độ nguyên tố xác định trong mẫu đo phổ

1.3 Trang bị của phép đo F-AAS

Dựa vào nguyên tắc của phép đo, ta có thể mô tả hệ thống trang bị của máy đo phổhấp thụ nguyên tử bao gồm các phần cơ bản sau :

Phần 1 Nguồn phát chùm tia bức xạ đơn sắc của nguyên tố phân tích để chiếu vào môi trường hấp thụ chứa các nguyên tử tự do Đó là các đèn Catot rỗng (HCL- Hollow Cathode Lamp), hay các đèn phóng điện không điện cực (EDL- Electrodeless Discharge Lamp), đèn phát phổ liên tục đã được biến điệu (D2 -Lamp, W2-Lamp )

Phần 2.Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích Hệ thống này được chế tạo theo hailoại kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu : kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa đèn khí (F-AAS) và kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu không ngọn lửa (ETA-AAS)

Hệ thống nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa gồm:

Bộ phận dẫn mẫu vào buồng aerosol hóa và thực hiện quá trình aerosol hóa mẫu (tạo thể sol khí)

Đèn nguyên tử hóa mẫu (burner head) để đốt cháy hỗn hợp khí có chứa mẫu ở thể sol khí

Hình 1.Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo hệ thống máy F-AAS

Phần 3 Là máy quang phổ, nó là bộ đơn sắc, có nhiệm vụ thu, phân ly, và chọn tiasáng (vạch phổ) cần đo hướng vào nhân quang điện để phát hiện tín hiệu hấp thụ AAS của vạch phổ

Phần 4.Hệ thống chỉ thị cường độ hấp thụ của vạch phổ Hệ thống này có thể là các trang bị :

Điện kế chỉ năng lượng hấp thụ ( E) của vạch phổ

Máy tự ghi pic của vạch phổ (Recorder)

Bộ hiện số Digital

Bộ máy tính và máy in (Printer)

Máy tích phân ( Intergrater)

2 Tiến hành thí nghiệm

2.1 Chuẩn bị chuẩn

Từ chuẩn gốc nồng độ 1000ppm pha loãng thành chuẩn có nồng độ 20 ppm rồi tiếp tục pha loãng thành các chuẩn:

Phân tích 1 mẫu nước:

cho đến khi gần cạn ( thể tích dưới 50ml) tiến hành lọc rồi định mức đến 50 ml bằng nước khử ion

Mẫu trắng chuẩn bị tương tự chỉ thay 100 ml mẫu nước phân tích bằng 100 ml nước khử ion

2.3 Tiến hành chạy máy phân tích mẫu.

2.4 Kết quả chạy máy

Nhóm 2 tiến hành phân tích nồng độ Pb và kết quả

Hình 2 Kết quả chạy mẫu phân tích Pb

3 Phân tích kết quả

0 0.05 0.1 0.15 0.2

0.25 f(x) = 0.02 x + 0 R² = 1

Nhóm 4: nồng độ Ni: X = 4.63 mg/LNhóm 5: nồng độ Cu: X = 0.21 mg/L

4 Kết luận

Sử dụng kỉ thuật F-AAS cho phép xác định nồng độ các kim loại nặng có mặt trong nước, từ đó đánh giá được chất lượng nước, kiểm tra được độ an toàn của nguồn nước mà chúng ta sử dụng

Ngoài ra, kỉ thuật F-AAS còn ứng dụng trong việc xác định nồng độ các kim loại

có trong thực phẩm, chế phẩm sinh học, cây dược liệu; xác định Asen trong đất

QCVN 08:2008/BTNMT do Ban soạn thảo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất

lượng nước biên soạn, Tổng cục Môi trường và Vụ Pháp chế trình duyệt, ban hành theo

Quyết định số 16/2008/QĐ-BTNMT ngày 31 tháng 12 năm 2008 của Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường

QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA

1.2 Giải thích từ ngữ

Nước mặt nói trong Quy chuẩn này là nước chảy qua hoặc đọng lại trên mặt đất,suối, kênh, mương, khe, rạch, hồ, ao, đầm, …

Ghi chú: Việc phân hạng nguồn nước mặt nhằm đánh giá và kiểm soát chất lượng

nước, phục vụ cho các mục đích sử dụng nước khác nhau:

A1 - Sử dụng tốt cho mục đích cấp nước sinh hoạt và các mục đích khác như loạiA2, B1 và B2.

A2 - Dùng cho mục đích cấp nước sinh hoạt nhưng phải áp dụng công nghệ xử lýphù hợp; bảo tồn động thực vật thủy sinh, hoặc các mục đích sử dụng như loại B1 và B2

B1 - Dùng cho mục đích tưới tiêu thủy lợi hoặc các mục đích sử dụng khác có yêucầu chất lượng nước tương tự hoặc các mục đích sử dụng như loại B2

B2 - Giao thông thuỷ và các mục đích khác với yêu cầu nước chất lượng thấp

 Từ bảng 1, mẫu nước chúng ta phân tích không an toàn để sử dụng cho bất kì

mục đích nào ở hạng mục A, B do hàm lượng Ni, Pb cao hơn mức cho phép rất lớn.

BÀI 3 SỬ DỤNG SẮC KÝ KHÍ ĐẦU DÒ ECD ĐỂ ĐO HÀM

LƯỢNG CYPERMATHIN TRONG ĐẤT

I Giới thiệu về sắc kí khí

1 Khái niệm

Sắc ký khí là một phương pháp chia tách trong đó pha động là 1 chất khí (được gọi là khí mang) và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên bề mặt chất mang trơ dạng rắn hay phủ đều lên thành phía trong của cột Tuỳ thuộc bản chất pha tĩnh chia thành hai loại sắc ký khí:

- Sắc ký khí rắn (gas solid chromatography - GSC): Chất phân tích được hấp phụ trực tiếp trên pha tĩnh là các tiểu phân rắn

- Sắc ký khí lỏng (gas liquid chromatography - GLC): Pha tĩnh là 1 chất lỏng không bay hơi

2 Cấu tạo máy sắc kí

Hình 3: Hệ thống sắc ký khí.

2.1 Nguồn cung cấp khí mang: Bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí( thiết bị cung

cấp khí H2 từ nước cất, thiết bị tách khí H2 từ không khí …

2.2 Lò cột : dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích.

- Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm thay đổi.Khi đưa mẫu vào cột có thể dùng chế dộ chia dòng (split) và không chia dòng (splitless)

- Đưa mẫu vào cột bằng hai cách: tiêm mẫu thủ công; hoặc tiêm mẫu tự động

2.4 Cột phân tích: gồm 2 loại là cột nhồi và cột mao quản

- Cột nhồi (packed column): pha tĩnh được nhồi và trong cột, cột có đường kính 2 - 4mm

và chiều dài 2 - 3m

- Cột mao quản (capillary): pha tĩnh được phủ mặttrong (bề dày 0,2 – 0,5µm), cột cóđường kính trong 0,1 – 0,5mm và chiều dài 30 - 100m.

Hình 4: Cột phân tích trong máy sắc ký khí.

2.5 Đầu dò

Đầu dò dùng phát hiện tín hiệu để định tính và định lượng các chất cần phân tích Cónhiều loại đầu dò khác nhau tùy theo mục đích phân tích ngọn lửa (FID-Flame IoniationDetetor), đầu dò dẫn nhiệt (TCD-Thermal Conductivity Detector) , đầu dò cộng kết điện

tử (ECD-Electron Capture Detector), đầu dò quang hóa ngọn lửa (FPD-FlamePhotometric Detector), đầu dò NPD (NPD-Nitrogen Phospho Detector), đầu dò khối phổ(MS-Mass Spectrometry) …

2.6 Bộ phận ghi nhận tín hiệu

đến cột sắc ký (pha tĩnh) Mẫu khí qua cột sắc ký sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh, sau

đó các chất sẽ được lần lượt tách khỏi cột và theo dòng khí ra ngoài, được ghi nhận bởiđầu dò Từ các tín hiệu nhận được máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ.Các chất sẽ được xác định nhờ giá trị thời gian lưu trên sắc ký đồ

II Nguyên vật liệu, dụng cụ, thiết bị và phương tiến hành pháp thí nghiệm

1 Nguyên vật liệu

Mẫu đất, Na2SO4, Florisil, Polyethylene (PE), Ethylacetate, aceton

Bước 2: Lấy hỗn hợp có được đem đánh sóng siêu âm 10 phút.

Hình 6: Đánh song siêu âm mẫu đất.

Bước 3: Lọc hỗn hợp sau khi đem đánh sóng siêu âm xong bằng giấy lọc

Hình 7: Lọc mẫu cypermathin sau khi đánh song siêu âm.

Bước 4: Đem dịch lọc cô quay để đổ dung môi Khoảng 1 – 2ml thì dừng lại.Làm sạch mẫu:

Bước 1: Cho 5ml hỗn hợp PE và ethylacetate (95:5) vào cột sắc kí

Bước 2: Thêm vào 2,5g Na2SO4

Bước 3; Thêm vào 5g Florisil cùng với hỗn hợp PE và ethylacetate (lượng vừa đủ)

Bước 4: Cuối cùng cho một lượng Na2SO4 tạo lớp dày khoảng 2cm trong cột sắc ký.Sau khi thực hiện xong các bước trên ta thấy cột sắc ký sẽ được chia làm 3 lớp.

Bước 5: Xả dịch trong cột sắc ký ra nhưng không để cột bị khô (mực nước của hỗn hợp cách lớp Na2SO4 trên cùng khoảng 2cm)

Bước 6: Lấy 5ml hỗn hợp PE và ethylacetate kết hợp với 1 – 2ml dịch chiết mẫu ở trên cho vào cột sắc ký

Bước 7: Xả dịch trong cột sắc ký ra còn khoảng 2cm cách lớp Na2SO4 trên cùng rồi tiến hành rửa giải để thu mẫu

Ta dùng 20ml hỗn hợp PE và ethylacetate để rửa giải rồi hứng khoảng 15ml

Bước 8: Co quay mẫu thu được và đem định mức 5ml/aceton Cuối cùng lọc lấy 0,25ml mẫu để tiến hành chạy máy

Hình 8: Co quay làm cạn mẫu.

3.2.Pha chuẩn Cypermathin dạng rắn

- Có hai phần mềm chạy máy trong sắc ký khí là:

- Phần mềm online: dùng để phân tích mẫu

- Phần mềm opline: dùng trong việc xử ý và đọc kết quả

III Kết quả và tính toán

* Kết quả

Hình 9: Peak mẫu cypermathin khi chay mẫu trên máy

Hình 10: Bảng đường nồng độ và diện tích chuẩn.

Hình 11: Bảng thời gian lưu và diện tích mẫu chạy.

Xây dựng đường chuẩn từ bảng diện tích và nồng độ chuẩn

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 0

100 200 300 400 500 600

700

f(x) = 150.48 x + 18.84 R² = 1

Đường chuẩn Cypermathin

Đường chuẩn Cypermathin Linear (Đường chuẩn Cypermathin)

Thời gian lưu của mẫu chuẩn = 21.157

 Từ bảng “Bảng thời gian lưu và diện tích mẫu chạy” so sánh thời gain lưu 21.157 của mẫu chẩn ta được diện tích mẫu chạy 148,0034

Vậy y = 148.0034 mà ta có pương trình đường chuẩn y = 150.4x + 18.84  X = C o = 0.8588 mg/l

%A2NG_VITAMIN_C_B%E1%BA%B0NG_PH%C6%AF%C6%A0NG_PH

%C3%81P_S%E1%BA%AEC_K%C3%8D_L%E1%BB%8ENG_CAO_%C3%81P