Thông qua chuyển gen các nhà sinh lý, hóa sinh và di truyền có thể nghiên cứu vai trò của từng gen đối với đời sống thực vật, nghiên cứu các quá trình điều khiển, thể hiện và ảnh hưởng c
Trang 1MỤC LỤC
2.2 Một số thành tựu đã đạt được 5
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 2PHẦN I: MỞ ĐẦU
Loài người đang sống giữa thập niên đầu tiên của thế kỷ XXI – thế kỷ Công nghệ sinh học Công nghệ sinh học đang là một khoa học mũi nhọn trong các khoa học sự sống Cùng với công nghệ thông tin, công nghệ vật liệu mới, Công nghệ sinh học đang góp phần tích cực trong sự phát triển mọi mặt của xã hội loài người Cách mạng công nghệ sinh học đã thực sự ra đời vào đầu thập niên 70 của thế kỷ
XX Trong gần 40 năm qua, công nghệ sinh học phát triển mạnh với nhiều thành tựu rực rỡ và rất xứng đáng được mang danh của thế kỷ mới
Kỹ thuật chuyển gen là một công cụ có tiềm năng trong việc giải quyết một
số vấn đề hiện đại của sinh lý học, sinh hóa học, sinh học phát triển và di truyền học Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa to lớn về mặt khoa học và thực tiễn Nó khẳng định tính khách quan tự nhiên của vật chất di truyền: khả năng mã hóa cho các tính trạng nhất định, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền Thông qua chuyển gen các nhà sinh lý, hóa sinh và di truyền có thể nghiên cứu vai trò của từng gen đối với đời sống thực vật, nghiên cứu các quá trình điều khiển, thể hiện và ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và ngoại cảnh lên hoạt động của gen
Qua một số thập kỷ nghiên cứu, kỹ thuật này đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể trong rất nhiều lĩnh vực
Chính vì những lý do trên, tôi thực hiện tiểu luận: “Kỹ thuật chuyển gen thực vật và những thành tựu đã đạt được”.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Trang 3PHẦN II: NỘI DUNG
2.1 Một số vấn đề chung nhẩt về chuyển gen ở thực vật [2].
2.1.1 Khái niệm về cây chuyển gen.
Cây chuyển gen là cây mang một hoặc nhiều gen được đưa vào nhân tạo thay
vì thông qua lai tạo
Những gen được đưa vào có thể được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn
Thực vật được tạo ra như thế gọi là “cây chuyển gen” mặc dù trên thực tế tất
cả các loài thực vật đều được chuyển gen từ các loài tổ tiên hoang dại của chúng bởi quá trình thuần hóa, chọn lọc và lai giống có kiểm soát trong một thời gian dài
2.1.2 Các thao tác cơ bản của quá trình chuyển gen.
Chuyển gen được thực hiên qua các bước sau:
- Xác định được gen liên quan đến tính trạng quan tâm và nhân được gen đó
- Gắn gen vào vector biến nạp
- Biến nạp vào E coli để tạo dòng
- Thiết kế vector chuyển gen, chuyển gen vào tế bào vật chủ
- Nuôi cấy mô tế bào để tạo mô sẹo
- Tạo cây chuyển gen trong ống nghiệm
- Mang cây chuyển gen ra thực tế
- Đánh giá và chứng minh sự có mặt của gen biến nạp trong cây tái sinh
2.1.3 Một số phương pháp chuyển gen cơ bản[1]
2.1.3.1 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp
* Chuyển gen bằng Agrobacterium
Trang 4Agrobacterium là một loại vi khuẩn đất thuộc loại G(-) Trong thực tế loại vi
khuẩn này gây bệnh u thân cây, nó có thể lây nhiễm vào thực vật qua vết xước trên thân cây
Trong phương pháp này người ta dùng plasmit Ti hoặc plasmit Ri của
Agrobacterium để làm vector đưa ADN vào tế bào.
Có 2 loại vector được thiết kế và sử dụng trong phương pháp này để chuyển gen:
- Vector liên hợp: là vector có sự kết hợp của cả plasmit Ti và vector mang
đoạn ADN đã gắn vào Plasmit Ti đã cắt bỏ gen gây khối u, cắt bỏ vùng opin, giữ lại vùng vir, bờ trái, bờ phải và thay vào những đoạn cắt bỏ là plasmit thứ 2 có gen cần chuyển
- Vector nhị thể: có cả 2 loại vector cùng tồn tại trong Agrobacterium trong
đó loại 1 được tách từ E.coli có gen cần chuyển, bờ trái, bờ phải của plasmit Ti,
loại 2 chỉ có plasmit Ti với vùng vir Cả 2 plasmit này đều được đưa vào
Agrobacterium.
* Phương pháp thông qua virus
Bên cạnh vi khuẩn Agrobacterium còn có các hệ thống dùng virus làm vector
chuyển gen vào thực vật Virus dễ xâm nhập và lây lan nhanh trong cơ thể thực vật, đồng thời có thế mang đoạn ADN lớn hơn so với khả năng của các plasmit Tuy nhiên, các axitnucleic của virus không ghép nối với bộ gen của thực vật bởi vậy ADN tái tổ hợp không di truyền được cho các thế hệ sau thông qua hạt, hơn nữa sự lây nhiễm virus thường làm yếu tế bào thực vật ở các mữc độ khác nhau vì thế chuyển gen nhờ virus nhìn chung ít được sử dụng
2.1.3.2 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp
Trang 5vonfram) rất nhỏ, được bọc plasmit tái tổ hợp mang gen cần chuyển Viên đạn này
sẽ được bắn vào khối mô nhờ áp lực cao của luồng khí helium do một thiết bị cung cấp Nhờ tiếp xúc với tế bào, trong một số trường hợp quá trình chuyển gen đã xảy ra
* Phương pháp xung điện
Là phương pháp dùng dòng điện với điện thế cao trong một thời gian ngắn
để giúp cho màng tế bào tạo các lỗ để ADN tái tổ hợp có thế thâm nhập vào
* Phương pháp siêu âm
Sử dụng máy siêu âm để tạo các lỗ thủng trên màng tế bào, giúp cho ADN tái tổ hợp có thể thâm nhập vào hệ gen của tế bào vật chủ
* Phương pháp sử dụng hóa chất
Sử dụng hóa chất polyethylenglycol để làm thay đổi màng của tế bào trần giúp cho ADN tái tổ hợp có thể thâm nhập vào tế bào trần
* Phương pháp chuyển gen bằng vi tiêm
Tế bào được giữ trong ống thủy tinh bằng một lực hút yếu và ADN được tiêm trực tiếp vào nhân tế bào qua pipet thủy tinh rất nhỏ Quá trình này cần có sự
hỗ trợ của kính hiển vi và thiết bị vi thao tác
* Phương pháp chuyển gen qua ống phấn
Phương pháp này được Ray Wu và đồng nghiệp đưa ra năm 1988 Trong phương pháp này, ADN cần chuyển có thể theo đường ống phấn chui vào bầu nhụy cái Quá trình chuyển gen xảy ra ngay sau khi ống phấn mọc qua vòi nhụy và đưa tinh tử vào thụ tinh cho tế bào trứng Chuyển gen qua ống phấn đạt kết quả tốt nhất ngay sau quá trình thụ tinh nhưng hợp tử chưa phân chia Do đó chuyển gen chỉ xảy ra đối với một tế bào trứng và khi tái sinh sẽ không tạo ra thể khảm
2.2 Một số thành tựu đã đạt được
2.2.1 Thành tựu trong tạo cây chuyển gen
2.2.1.1 Cây trồng chuyển gen kháng sâu
Trang 6* Một số thành tựu ở lúa
- Chuyển nạp gen cryIA trong cây lúa: Datta và Cs (1998) đã thực hiện chuyển thành công gen cryIA với 2 promoter có tính chất câu trúc là 35SCaMV và Actin – 1 vào cây lúa với 2 dạng hình khác nhau là indica và japonica bằng phương pháp bắn gen trên tế bào trần Các tác giả sử dụng phân tích Southern kết quả thấy rằng có 100 cây được chuyển nạp được xác nhận là có sự hợp nhất của gen cryIA
và genome của cây lúa Có 81 cây lúa trong 800 cây sau khi có kết quả dương về
phân tích Southern được thanh lọc với sâu đục thân màu vàng (Scirpophaga
incertulas) cho thấy 100% sâu non chết [4].
Trong trường hợp chuyển nạp gen này trên giống lúa japnica Taipei 309 với
promoter Actin – 1, trong vector có gen kháng hygromycine, hph đi kèm với
promoter CaMV 35S, Wu và Cs (1997) đã ghi nhận gen này rất hiệu quả diệt sâu đục thân màu vàng, đặc biệt là protein độc tố thể hiện trong thân lúa
- Lúa thơm là một đối tượng được các nhà nghiên cứu về lai tạo giống lúa quan tâm Trong lĩnh vực chuyển gen, lúa thơm cũng được các nhà nghiên cứu đặc biệt chú ý Hiện nay, người ta đã thành công trong việc chuyển gen vào một số
giống lúa thơm như Khao Dawk Mali (KDML) 105 của Thái Lan [8], Pusa
Basmati của Ấn Độ [6], Tarom Molaii của Iran [5]…
- Nhóm tác giả Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, Karabi Datta, Swapan Kumar Datta thuộc Viện sinh học nhiệt đới và Viện lúa quốc tế đã thành công trong việc tạo cây lúa chuyển gen Nàng Hương Chợ Đào kháng cao đối với sâu đục thân
bằng phương pháp gián tiếp sử dụng vi khuẩn Agorobacterium tumefaciens Trong
nghiên cứu này, các tác giả đã sử dụng chủng vi khuẩn LBA4404 mang plasmit pBin-BAR-UBR-IB mang gen Bt phối hợp (hybrid) giữa CryIA(b) và CryIB Các tác giả đã sử dụng nhiều phương pháp: nuôi cấy mô tế bào thực vật, PCR, lai Southern blot, Western blot, trắc nghiệm ELISA, thử tính kháng thuốc diệt cỏ, thử
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Trang 7tính kháng sâu…Qua thí nghiệm và thử tính kháng sâu thấy rằng trong 100% sâu chết ở tất cả các trường hợp cây chuyển gen, trường hợp đối chứng tỷ lệ sâu chết từ
0 – 14.5% [19]
- Ngoài ra, nhóm tác giả Niranjan Baisakh, Norman Oliva cùng với Nguyễn Hữu Hồ và Nguyễn Văn Uyển cũng đã thành công trong việc tạo ra các cây lúa thơm chuyển gen Jasmine và Nàng Hương Chợ Đào kháng sâu Bt bằng sử dụng phương pháp bắn gen Các tác giả sử dụng các plasmit p302.2 và pROB5 Plasmit p302.2 mang gen Bt phối hợp (hybrid) CryIA (B) – CryIA (C) kháng sâu (1.8 kB,
promoter Actin-1) và plasmit pROB5 mang gen hph kháng hygromycin (1.1 kB,
promoter CaMV35S) cùng đoạn polyA Khi thử tính kháng sâu sau khi tạo ra cây chuyển gen thấy rằng tỷ lệ sâu chết ở những cây này là khoảng 90 - 100% còn những cây đối chứng tỷ lệ sâu chết là không đáng kể [19] Kết quả này phù hợp với
kết quả của một số tác giả khác nghiên cứu trước đây khi sử dụng gen Bt này để
chuyển vào một số giống lúa khác như IR64, IR72, … [4], [13]
- Bằng phương pháp bắn gen, tác giả Nguyễn Hữu Hổ cũng đã tạo được giống lúa Một Bụi chuyển gen kháng sâu Bt mang gen chuyển là gen phối hợp cryIA(b) + cryIA(c) Kết quả cũng đã thu được giống có khả năng kháng sâu cao như các giống lúa trong các thí nghiệm trên [19]
* Sử dụng RNAi để diệt côn trùng gây hại cho cây trồng
Các nhà khoa học của Monsanto ve Devgen N.V đã thực hiện phương pháp này có hiệu quả Báo cáo khoa học được công bố trên tạp chí Nature Biotechnology RNAi làm im lặng những gen cần thiết của côn trùng gây hại cây trồng, làm chúng dừng hấp thu dinh dưỡng và làm chết ấu trùng Các nhà khoa học
này đã ứng dụng RNAi để kiểm soát côn trùng gây hại rễ bắp (western corn
rootworm = WCR) làm mô hình mẫu cho những nghiên cứu tiếp theo Cây chuyển
gen có tác dụng đối với côn trùng gây hại, các côn trùng này ăn lá cây thì thấy
Trang 8chúng bị chết Việc sử dụng RNAi để kiểm soát côn trùng gây hại cây trồng sẽ bổ sung đáng kể cho chiến lược giống chuyển gen Bt (protein diệt côn trùng) trên cây bắp, bông vải, đậu nành [22]
2.2.1.2 Cây trồng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ
* Lúa chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ
Lúa “ma” (lúa cỏ) đã xuất hiện khắp nơi trên đồng ruộng tại vựa lúa ĐBSCL, mức thiệt hại do lúa “ma” trung bình 5 - 10%, có vùng đến 50% Một khảo sát mới đây của Viện lúa ĐBSCL cho thấy lúa “ma” gây thiệt hại cho nhiều ruộng lúa và cảnh báo là nguy hiểm vì hạt lúa “ma” tự rụng, tích lũy nhiều dần trong đất và hàng năm mọc trở lại càng nhiều hơn Các nhà khoa học của viện đã nghiên cứu thành công giải pháp tiêu diệt lúa “ma”, cỏ dại thông thường bằng cách tạo ra giống lúa mới
Viện lúa ĐBSCL và tập đoàn BASF, Đại học Louisia (Mỹ) đã tiến hành nghiên cứu cách xử lý lúa “ma” từ năm 2003 đến nay Chương trình đẩy mạnh
nghiên cứu, lai tạo các giống lúa indica có gen kháng thuốc diệt cỏ thuộc nhóm
imidazolinon để sau đó sử dụng các loại thuốc diệt cỏ thuộc nhóm này phun diệt lúa ma và cỏ dại trên ruộng lúa Việt Nam mà cây lúa trồng không bị ảnh hưởng Giống lúa kháng thuốc diệt cỏ imidazolinon được gọi là lúa ClearField, không phải
là cây lúa chuyển gen
Các giống lúa có gen kháng thuốc thuộc nhóm imidazolinon (gọi tắt là lúa kháng IMI) đã được du nhập nghiên cứu tại Viện lúa ĐBSCL, đó là giống lúa japonica, tên của giống lúa này là CL 161 Các nhà di truyền giống tại Viện lúa ĐBSCL đã chuyển được gen kháng thuốc diệt cỏ nhóm imidazolinon từ giống japonica CL 161 sang giống lúa indica thành công Các giống đã thuần có gen này
có tên là OMCF 6, OMCF 9, OMCF 39, OMCF 48 (OMCF là viết tắt của Ô Môn ClearField) Các giống này hiện đang khảo nghiệm cho kết quả tốt và đang trong
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Trang 9Hình 2.2.1.1: Lúa chuyển gen kháng mặn
giai đoạn chuẩn bị đăng ký để được công nhận Trong vụ hè thu 2006, Viện đã khảo nghiệm giống có gen kháng thuốc imidazolinon, ruộng sạ khô, kết quả diệt lúa ma là 99,9%, cỏ lồng vực 100%, cỏ đuôi phụng 99,9%, các loài cỏ lá rộng 100% Năng suất trung bình của ruộng lúa phun thuốc diệt cỏ nhóm imidazolinon
là 1,83 tấn/ha (ruộng không phun là 0,91 tấn/ha) Kết quả sạ ướt với giống lúa có gen kháng imidazolinon, lúa ma bị diệt 100%, năng suất lúa đạt 2,15 tấn/ha (không phun thuốc diệt cỏ, năng suất 0,88 tấn/ha; nhổ cỏ bằng tay (2 lần) năng suất 1,16 tấn/ha)
Như vậy, lúa “ma” và các loại cỏ dại thông thường bị diệt bằng thuốc diệt cỏ thuộc nhóm imidazolinon phun trên ruộng lúa trồng bằng giống lúa kháng IMI Đây được xem là giải pháp kiểm soát lúa ma và cỏ dại thông thường hiệu quả trên ruộng lúa sạ tại các tỉnh phía Nam [21]
2.2.1.3 Cây trồng chuyển gen chống chịu stress
* Thể hiện thành công gen NAC giúp cây lúa chịu hạn, chống chịu stress.
Khô hạn và mặn là hai stress phi sinh học quan trọng đối với sản xuất lúa và
giống lúa tốt hơn Để khắc phục những điều
kiện bất lợi này, cây trồng phải phát triển các
chiến lược hoá sinh và sinh lý như là bằng
cách kích hoạt các gen liên quan tới stress và
tổng hợp nhiều protein chức năng thay đổi
Việc biểu thị của các protein này
được điều khiển bởi các nhân tố giải mã
đặc biệt đó là NAM, ATAF và CUC (Viết tắt NAC).
Sau khi thể hiện thành công gen NAC trong giống lúa Japonical
Nipponbare, ông Honghong HU và các đồng nghiệp thuộc các trung tâm nghiên
Trang 10Hình 2.2.1.2: Đu đủ chuyển gen kháng lạnh
cứu khác nhau tại tỉnh Vũ hán, Trung quốc cho biết “việc biểu hiện thành công một nhân tố giải mã NAM, ATAF và CUC (NAC) giúp làm tăng tính chống hạn và chịu mặn ở cây lúa” Nghiên cứu của họ được đăng trên số ra mới nhất của Kỷ yếu học quốc gia
Các nhà khoa học nhận thấy cây lúa chuyển gen có tính chịu hạn tốt hơn, và
tỷ lệ đậu hạt cao hơn từ 22 đến 35% so với việc kiểm soát trên đồng ruộng trong điều kiện hạn nặng tại thời kỳ sinh sản Cây lúa chuyển gen cũng cho thấy tính chịu hạn và chịu mặn tốt hơn trong giai đoạn sinh dưỡng Trong mọi trường hợp, sự tăng trưởng và năng suất không bị ảnh hưởng bởi cây lúa chuyển gen bởi không có sự khác biệt đáng kể trong tỷ lệ quang hợp giữa cây chuyển gen và kiểm soát Khi các nhà khoa học mô tả sơ lược hình thái gen biểu thị họ nhận thấy một số lớn các gen liên quan tới stress được điều chỉnh mạnh hơn ở cây chuyển gen Tất cả những điều này cho thấy rằng công nghệ này có triển vọng trong việc cải tiến tính kháng hạn và mặn ở cây lúa [23].
* Chuyển gen kháng lạnh vào đu đủ
Đu đủ rất nhạy cảm với sương giá và việc trồng đu đủ ở các vùng cận nhiệt đới có thể bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ thấp thường xảy ra ở những vùng này Hiểu được cơ chế chịu lạnh của cây trồng sẽ giúp các nhà chọn giống phát triển các giống cây trồng chịu được nhiệt độ thấp
Các nhà nghiên cứu tại Đại học Florida và Đại học quốc gia Fort Valley của
Mỹ đang sử dụng kỹ thuật di truyền và các phương pháp di truyền học để xác định xem liệu các gen từ cây cỏ linh lăng
có làm gia tăng tính chịu lạnh ở đu đủ
hay không Họ đã đưa vào hai gen
chuyển đổi thuộc họ gen CBF
(C-repeat binding factor) Qua phân tích
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Trang 11PCR thấy rằng hệ gen của cây đu đủ không có trình tự nào liên quan đến gen CBF
và cũng không có gen nào liên quan đến lạnh Các gen CBF được quan sát thấy là làm tăng tính chống chịu stress thông qua việc gia tăng biểu hiện của gen điều chỉnh lạnh ở cây đu đủ chuyển gen, chính vì vậy sự kháng lạnh trong cây đu đủ hoàn toàn do gen CBF từ cây cỏ linh lăng gây ra [16]
* Khoai tây biến đổi gen (GM) chống chịu nhiều loại stress
Có nhiều loại hình của stress đối với khoai tây như lạnh, nóng, mặn, độc chất hóa học có thể kích thích sự hình thành ROS (reactive oxygen species) trong tế bào khoai tây ROS có thể làm cho tổn thương ở màng tế bào và làm phá vỡ tiến trình phân bào bình thường Cây chống đỡ lại với ROS bằng cách tổng hợp ra các enzyme có tính chất “antioxidant” Các nhà khoa học Hàn Quốc đã thực hiện thành công giống khoai tây biến đổi gen thể hiện tính chống chịu stress có tính chất
“oxidative” như vậy bằng cách cải biên sự thể hiện của những gen “antioxidant”
Họ chuyển vào gen mã hóa “nucleoside diphosphate kinase 2” (NDPK2) từ cây Arabidopsis NDPK2 có chức năng điều hòa sự thể hiện của nhiều gen
“antioxidant” trong tế bào chất Gen mã hóa NDPK2 được thiết kế với một promoter kiểm soát hoạt tính khi bị stress Các dòng cây chuyển gen này thể hiện tính chống chịu với tress có nguồn gốc “oxidative” trong điều kiện nhiệt độ cao, mặn và độc tố hóa học [25]
* Tạo cây chịu hạn tốt bằng cách loại gen
Các nhà khoa học Canada đã phát hiện rằng việc loại bỏ một gen đặc biệt mang tên ERA1 giúp cây phát hiện sớm các dấu hiệu khô hạn và phản ứng bằng cách khép các lỗ khí cực nhỏ trên bề mặt lá nhằm ngăn sự thoát hơi nước