Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt

Công nghệ gen co phép đưa gen có lợi vào thực vật nhằm tạo ra những loại cây trồng mang lại những tính trạng mà ta mong muốn mà ở đây là cây cải ngọt có mang gen kháng sâu bệnh nhằm hạn

LỜI MỞ ĐẦU

Cải ngọt là một loại rau được sử dụng rất nhiều trong đời sống bởi vì thành phần dinh dưỡng trong cải ngọt khá cao, đặc biệt là thành phần diệp hoàng tố và vitamin K Ngoài ra, cải xanh còn có rất nhiều vitamin A, B, C,

D, chất caroten, anbumin, a-xit nicotic

Những năm gần đây, an toàn thực phẩm đang là vấn đề được xã hội quan tâm Phần lớn vụ ngộ độc đều do an toàn thực phẩm không được đảm bảo Nhưng muốn có được thực phẩm an toàn thì từ khâu sản xuất nguyên liệu, thu hoạch cho đến bảo quản, chế biến và lưu thông phân phối phải tuân theo các quy trình kỹ thuật, công nghệ nhất định Trong thực tế sản xuất hiện nay, nhiều nông dân lạm dụng phân hóa học và các loại nông dược nên tốn nhiều chi phí sản xuất và gây ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường, sự

đa dạng sinh học và cân bằng sinh thái bị phá vỡ Vì thế, xây dựng một nền nông nghiệp bền vững là một việc có ý nghĩa chiến lược trong công cuộc phát triển chung của đất nước, đặc biệt với vị trí quan trọng của khu vực nông thôn trong sự nghiệp phát triển kinh tế xã hội của nước ta hiện nay Khi khoa học và kỹ thuật phát triển phát triển thì một phương pháp mang lại nhiều hiệu quả là sử dụng công nghệ gen Công nghệ gen co phép đưa gen

có lợi vào thực vật nhằm tạo ra những loại cây trồng mang lại những tính trạng mà ta mong muốn mà ở đây là cây cải ngọt có mang gen kháng sâu bệnh nhằm hạn chế việc sử dụng thuốc trừ sâu … nhằm đảm bảo nguồn thực phẩm an toàn và giảm ô nhiễm môi trường

Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens theo

hướng dùng vi khuẩn để chuyển nạp tạo ra cây cải ngọt chuyển gen đáp ứng nhu cầu hiện nay

1

-I KHÁI QUÁT VỀ CÂY CẢI NGỌT

I.1 ĐẶC ĐIỂM VÀ THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG

Cải ngọt thuộc họ Brassicaceae rất giàu chất dinh dưỡng Trong

100 g cải có chứa: 1,1 g protein; 0,2 lipit; 2,1 g cacbohidrat; 61 mg canxi;

37 mg photpho; 0,5 mg sắt; 0,01 mg caroten; 0,02 thiamin (B1); 0,04 mg ribopalavin (B2); 0,3 mg niaxin (B3); 20 mg axit ascorbic (C) Cải ngọt được nhận biết do màu lá xanh nhạt và có hoa nhỏ màu vàng và và được coi

là một trong những loại rau ngon nhất trong họ cải pak choy Chiều cao của cây từ 20 – 30 cm Lá hình ô van mang màu xanh nhạt hoặc xanh thẫm Cây bắt đầu có hoa khi có từ 7 đến 8 lá Rễ chùm sâu khoảng 12 cm và có bán kính 12 cm Đường kính chum lá khoảng từ 15 đến 45 cm Được trồng quanh năm, vụ chính là đông xuân, thời gian sinh trưởng 35 - 45 ngày

I.2 CÔNG DỤNG CÂY CẢI NGỌT

Theo Đông y, cải ngọt tính ôn, có công dụng thông lợi trường vị, làm

đỡ tức ngực, tiêu thực hạ khí có thể dùng để chữa các chứng ho, táo bón,

ăn nhiều giúp cho việc phòng ngừa bệnh trĩ và ung thư ruột kết và cũng giúp chống suy nhược thần kinh, giảm đau nhức phòng chống các bệnh ung thư, tim mạch và nhiều loại bệnh khác

Cải có nhiều công dụng rất tốt như có tác dụng ngăn ngừa ung thư gan và kết hợp điều trị bệnh ung thư và xơ cứng gan

I.3 TÌNH HÌNH RAU CẢI NGỌT HIỆN NAY

Cải ngọt là rau ngắn ngày có thể trồng quanh năm, không cần vốn nhiều mà tiêu thụ dễ dàng Tuy nhiên, cải ngọt, cải xanh lại dễ gây ngộ độc nhất cho người tiêu dùng bởi nhiều sâu bệnh hại khó trừ, thời gian sinh trưởng ngắn mà phần lớn các thuốc hóa học lại có thời gian cách ly dài trong khi thuốc vi sinh và điều hòa sinh trưởng kém tác dụng với một số sâu Hơn nữa, nông dân hòa phân đạm tưới nhiều lần để cây sinh trưởng

nhanh Đó chính là nguyên nhân khiến dư lượng thuốc trừ sâu và dư lượng nitrat thường cao ở 2 chủng loại rau này và dẫn đến tình trạng ngộ độc cho người tiêu dùng

Ngày nay, rau cải ngọt ngày càng được trồng phổ biến và cho thu nhập khá cao Do vậy nông dân sản xuất rau đã dùng đủ mọt cách để nâng cao năng xuất cây trồng này Và ứng dụng công nghệ gen là biện pháp thông minh và bền vững nhằm giúp cay trồng chống lại sâu bệnh mà còn đảm bảo được an toàn thực phẩm

II QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO VI KHUẨN

II.1 VẬT LIỆU DÙNG ĐỂ CHUYỂN GEN

II.1.1 Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA 105

Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh ghẻ khối u trên

cây, phát sinh ung thư, tạo ra kết quả trực tiếp hình thành khối u để tổng hợp ra một loại dinh dưỡng đặc biệt giúp cho vi khuẩn phát triển

Gen Agrobacterium là nhóm genus có tính chất sinh sản trong đất, gram âm, cùng họ với Rhizobium Có bốn species đã được ghi nhận Agrobacterium tumefaciens tạo ra khối u trong tế bào tumor chưa được phân hóa và chưa được tổ chức một vài dòng của Agrobacterium tumefaciens không tạo khối u nhưng kích thích sự tăng trưởng của

teratomas (thẻ dị thường, khác thường) tuy nhiên thực vật thuộc đơn tử

diệp tỏ ra kháng đối với Agrobacterium, chỉ trừ một vài loài của Asparagus.

Khả năng chuyển DNA của Agrobacterium tumefaciens được sử

dụng trong công nghiệp gen hiện đại

3

-Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens a: Dưới kính hiển vi điện tử.

Plasmid pCAMBIA

I.I.3 Plasmid pCAMBIA 3301, Plasmid pUbi.cryIA(b) và Plasmid pUbi.cryIA(c)

Plasmid pCAMBIA 3301 có độ dài là 12Kb chứa gen gusA và gen bar.

Plasmid pUbi.cryIA(b) và Plasmid pUbi.cryIA(c) có chứa gen cryA

có độ dài 4 kb ở hai đầu có vị trí cắt của enzyme hin III

II.2 QUY TRÌNH CHUYỂN PLASMID VÀO VI KHUẨN

II.2.1 Tạo plasmid

Sử dụng enzyme hind III Enzyme hind III là một loại endonuclease

Cấu trúc của HindIII là khá phức tạp, và bao gồm homodimer một Giống như endonucleases loại khác hạn chế II, được cho là chứa một lõi phổ biến cấu trúc bao gồm bốn β-tờ và một α-xoắn Tiểu đơn vị chứa 300 axit amin và khối lượng phân tử dự đoán là 34.950 Da Mặc dù tầm quan trọng của enzyme này trong sinh học phân tử và công nghệ DNA Tuy nhiên, người ta

tin rằng HindIII sử dụng một cơ chế chung của công nhận và xúc tác của DNA được tìm thấy trong các loại enzyme như EcoRI , Bam HI , và mức

BGL II Không giống như hầu hết các endonucleases loại tài liệu hạn chế,

HindIII là duy nhất ở chỗ nó hoạt động kém khi không có xúc tác khi Mg 2 + Vị trí cắt của hind III:

Hinh III cắt tại đầu hind III của chuỗi plasmid pCAMBIA 3301 và

cắt plasmid pUbi.cryIA(b) và plasmid pUbi.cryIA(c) sau đó plasmid pCAMBIA 3301 đã bị cắt ở hai đầu mở ra và được xử lý bởi Alikaline phosphate để chúng không nối lại với nhau Còn plasmid pUbi.cryIA do có hai vị trí cắt tạo nên hai đoạn 6Kb tương ứng với thân và 4Kb tương ứng

với đoạn gen cryIA

Sau đó tiến hành nối 2 đoạn DNA plasmid pCAMBIA 3301 12kb và đoạn gen cryIA 4kb với nhau bởi enzyme ligase ở nhiệt độ 4oC trong 16 giờ thì tạo ra plasmid mới là plasmid pITB-CRY (Institute of Tropical Biology)

5

-dài 16kb Nhân dòng vector nhờ vi khuẩn E.coli nhằm thu được lượng lớn

bản sao plasmid pITB-CRY Tế bào vi khuẩn E.coli không có khả năng biến nạp Tế bào vi khuẩn E.coli có thể được xử lý để trở nên có khả năng tiếp nhận plasmid pITB-CRY Hai plasmid mới vào vi khuẩn biến nạp E.coli, nhân bản E coli và tách chiết AND trần

II.2.2 Đưa plasmid vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Phương pháp sử dụng là phương pháp biến nạp Biến nạp là hiện tượng tiếp nhận DNA trần được tách từ quá trình nhân dòng trong vi khẩn E.coli từ vào tế bào vi sinh vật với much đích khuếch đại số lượng lớn bản sao DNA Plasmid nhờ bộ máy di truyền của vi sinh vật sau đó giúp đua gen mục tiêu vào vật chủ để thể hiện chức năng của gen quá trình được tiến hành như sau:

Sau khi tạo được vector tái tổ hợp mang gen ngoại lai, việc tiếp theo

là biến nạp nó vào tế bào vật chủ Trong trường hợp này tế bào vật chủ

thường được sử dụng là vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để khuếch đại

một lượng lớn DNA plasmid tái tổ hợp dùng cho nghiên cứu này thông thường ở nước ngoài người ta thường sử dụng phương pháp sử dụng súng bắn gen nhưng ở Việt Nam điều kiện chưa có do đó ta có thể sử dung phương pháp sốc nhiệt để đưa plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens Phương pháp sốc nhiệt là phương pháp lý học

dựa vào nguyên lý giãn nở của màng tế bào để đưa plasmid mới tạo thành vào tế bào vi khuẩn

Dùng que cấy vô trùng gạt lấy một khuẩn lạc Agrobacterium tumefaciens cho vào eppendorf có chứ dung dich biến nạp (dung dịch biến nạp được tạo thành bắng cách hòa tan plasmid mới vào 100ul nước cất) vê tròn làm cho vi khuẩn trộn đều trong dung dịch Sau đó đạt vào ngăn đá khoảng 10 phút sau đó lấy ra cho vào nước ấm khoảng 40oC trong khoảng

50 giây sau đó mang vào ủ lạnh tiếp tục nhằm gây sốc nhiệt làm cho màng

tế bào vi khuẩn giãn ra plasmid chứa enzyme cần thiết xâm nhập vào và tạo

ra vi khuẩn mang gen tái tổ hợp cần thiết Sau đó cấy chủng này lên dung dịch thích hợp lắc đều Quy trình có thể được mô tả bằng sơ đồ hình:

7

-III QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO CÂY

Quá trình chuyển gen vào cây là một quá trình phức tạp và khó thực hiện để đạt được hiệu quả cao phải làm trong điều kiện vô trùng và sử dụng cây trong phòng thí nghiệm

Cây trong ống nghiệm hoặc cây con nảy mầm từ hạt được sử dụng làm vật liệu chuyển gen và sử dụng Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid mang gen bar, gen gus và CryIA đã tạo ra ở trên

III.1 CÁCH CHUYỂN GEN VÀO CÂY CẢI NGỌT

Chuẩn bị cây cải ngọt thuộc loài Brassica integrifolia L. từ hạt nảy mầm khoảng 5-6 ngày có lá mầm cuống dài 1-2 mm hoặc cây trong nuôi cấy mô

Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được biến nạp gen CryIA lắc qua đêm để gây nhiễm mẫu, sau đó các lá mầm được nuôi cấy

trên môi trường tái sinh tạo chồi

Môi trường tái sinh tạo chồi là môi trường MS bao gồm:

- 2mg/l NAA

Rau cải ngọt 5 ngày tuổi

- 4mg/l BA

- 3.3 mg/l AgNO3

Trong hai ngày ( có bổ sung acetosyringone nồng độ 100µM) Sau

đó rủa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch kháng sinh 500mg/l cefotaxime trong thời gian 30 phút

Sau đó chuyển mẫu sang môi trường tái sinh tạo chồi có chúa chất chọn lọc PPT và 500mg/l cefotaxime Tiếp tục cấy chuyền 2 tuần/ lần trên cùng một loại môi trường Sau 4-5 tuần mẫu có chồi tái sinh được chuyển qua môi trường ra rễ sau đó được đưa ra ngoài môi trường

III.2 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CÂY CHUYỂN GEN

Kiểm tra bằng chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc bằng cách ngâm các mảnh lá chồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 giờ ở 37oC, mẫu chuyển gen sẽ có màu xanh chàm đặ trưng, mẫu đới chứng tức không mang gen sẽ không chuyển màu

PCR gen cryIA(c) DNA thực vật được chạy PCR với cặp mồi chuyên biệt, quy trình tách DNA thực vật được thực hiện theo phương pháp của Dellaporta (1983)

Các cây chuyền gen được kiểm tra sự biểu hiện của gen cryIA ( c )

qua khả năng kháng sâu bằng cách thả sâu xanh Heliothis armigera lên các

mẫu lá trong đĩa petri

9

-III.KẾT LUẬN

Thực phẩm biến đổi gen (GMF-genetically modified food) là thực phẩm mà bản thân chúng hoặc chế biến từ các cơ thể động, thực vật mang các gen tái tổ hợp được chuyển vào một cách nhân tạo nhằm phục vụ các lợi ích kinh tế Nhờ sử dụng Plasmid ITB để chuyển gen chúng ta đã thu

nhận cây cải ngọt chuyển gen mang gen cryIA(c) kháng sâu xanh Heliothis armigera Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử và sinh học chúng ta có thể

xác định được của gen này hiện diện cây cải ngọt chuyển gen và gen chuyển đã có biểu hiện tính trạng khá rõ rệt

Cây trồng chuyển gen là một thành tựu của khoa học và công nghệ, việc ứng dụng quy trình này trên nhiều loại thực vật không những mang lại giá trị kinh tế mà góp phần bảo vệ môi trường và xây dựng hệ sinh thái bền vững Qua đề tài ta có thể biết được quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh vào cây cải ngọt và có thể ứng dụng vào thực tế mang lại hiệu quả kinh tế đảm bảo nhu cầu của thị trường mà vẫn đảm bảo an toàn cho người sử dụng Ứng dụng công nghệ sinh học phân tử ta đã và sẽ tạo ra được nhiều thành phẩm mới mang ý nghĩa quan trọng đảm bảo nguồn thực phẩm sạch đảm bảo được vấn đề an ninh lương thực toàn cầu

Việt Nam đang từng bước tiếp cận với công nghệ gen nhằm tạo ra những cây trồng có khả năng chống sâu bệnh, chống hạn, chống kim loại nặng… và việc tạo ra cây cải ngọt chuyển gen mang một ý nghĩa hết sức quan trọng và cần thiết

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu sách

Trang Quan Sen Kỹ thuật ghép gen, một công nghệ hàng đầu của thế kỷ 21, Kỹ thuật ghép gen Nhà xuất bản Tổng hợp TPHCM,2011

Đỗ Năng Vinh và Ngô Xuân Bình Công nghệ sinh học đại cương.

Nhà xuất bản Nông nghiệp 2008

PGS.TS Đào Xuân Vinh Bài giảng Công nghệ sinh học phân tử và ứng dụng,2010

Tài liệu trên internet

http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/kien-thuc-cn-sinh-hoc-cay-trong-chuyen-gen-va-moi-truong-pocket-no-4-.900332.html

http://vietsciences.free.fr/thuctap_khoahoc/thanhtuukhoahoc/thucpha mchuyengen.htm

http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1118

11