Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR

MÔN: SINH HỌC PHÂN MÔN: SINH HỌC PHÂN TỬ TỬ GVHD: GVHD: NGUYỄN THỊ DUY KHOA NGUYỄN THỊ DUY KHOA GVHD: GVHD: NGUYỄN THỊ DUY KHOA NGUYỄN THỊ DUY KHOA 1. 1. NGUYỄN ĐÌNH BẢO NGUYỄN ĐÌNH BẢO 2. 2. TRẦN QUỐC HỌC TRẦN QUỐC HỌC 3. 3. NGUYỄN HỮU SĨ NGUYỄN HỮU SĨ 4. 4. PHAN NGỌC THỊNH PHAN NGỌC THỊNH 5. 5. TRẦN XUÂN ÁI TRẦN XUÂN ÁI 6. 6. QUÁCH THỊ QUỲNH MAI QUÁCH THỊ QUỲNH MAI 7. 7. HỒ THỊ NHƯ SANG HỒ THỊ NHƯ SANG 8. 8. PHẠM THỊ TỈNH PHẠM THỊ TỈNH 9. 9. VÕ THỊ BẢO ÁI VÕ THỊ BẢO ÁI 10. 10. NGUYỄN THỊ THU LỰU NGUYỄN THỊ THU LỰU 11. 11. NGUYỄN MINH THẬT NGUYỄN MINH THẬT  TRẦN QUỐC HỌC TRẦN QUỐC HỌC  NGUYỄN HỮU SĨ NGUYỄN HỮU SĨ PHAN NGỌC THỊNH PHAN NGỌC THỊNH TRẦN XUÂN ÁI TRẦN XUÂN ÁI QUÁCH THỊ QUỲNH MAI QUÁCH THỊ QUỲNH MAI PHẠM THỊ TỈNH PHẠM THỊ TỈNH VÕ THỊ BẢO ÁI VÕ THỊ BẢO ÁI NGUYỄN THỊ THU LỰU NGUYỄN THỊ THU LỰU NGUYỄN MINH THẬT NGUYỄN MINH THẬT TRẦN ĐÔNG ANH TRẦN ĐÔNG ANH NGUYỄN ĐÌNH BẢO NGUYỄN ĐÌNH BẢO I. KHÁI NIỆM I. KHÁI NIỆM  PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction  PCR là Phản ứng chuỗi trùng hợp hay gọi là "phản ứng khuếch đại gen".  PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men.  PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống II. II. LỊCH SỬ LỊCH SỬ Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase III. THỰC NGHIỆM III. THỰC NGHIỆM PCR PCR  PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen.  PCR cần rất nhiều thành phần. - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồi(primer), - DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA. - Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyên liệu cho DNA- polymerase để xây dựng DNA mới. - Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA- polymerase III. THỰC NGHIỆM PCR III. THỰC NGHIỆM PCR PCR machine chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng. Năm 2004, giá máy khoảng 2500 USD Phản ứng PCR được thực hiện trong III.1 Đoạn mồi Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá 50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base (bp); chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides) III.2 Quy trình Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: - Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. - Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. - Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài IV. Những ứng dụng của PCR IV. Những ứng dụng của PCR  Vân tay di truyền  Kiểm tra huyết thống  Chuẩn đoán bệnh di truyền  Tách dòng gen  Gây đột biến điểm  Phân tích mẫu DNA cổ  Xác định gen của các đột biến  So sánh mức độ biểu hiện của gen [...]... nucleotid Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR 5 Nhuộm ADN: Chất lượng điện di và kết quả nhân ADN đặc hiệu chỉ có thể hiện rõ trên bản gel với quy trình nhuộm ADN được tối ưu hoá và phương pháp nhuộm thích hợp được lựa chọn Ngoài ra, kinh nghiệm và kỹ năng của kỹ thuật viên cũng rất cần thiết, góp phần hạ giá thành chung Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR 6... xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR 3 Nhân ADN đặc hiệu: Đây là khâu quan trọng nhất của quy trình Các hỗn hợp hoá chất khác nhau và các chu trình nhiệt khác nhau đã được thử nghiệm cho từng cặp mồi Trên cơ sở đó, đã tối ưu hoá thành phần của từng hỗn hợp, từng chu trình nhiệt cho từng cặp mồi, dựa vào những hoá chất sẵn có trên thị trường trong nước Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR. .. lạnh Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR 2 Tách chiết ADN: Nhiều quy trình tách chiết ADN khác nhau của thế giới đã được nghiên cứu, thử nghiệm và thích ứng với điều kiện nước ta Do vậy, góp phần giảm giá thành, tiết kiệm kinh phí Với mỗi loại mẫu có một quy trình tách chiết thích hợp riêng Đảm bảo chất lượng và số lượng ADN từ những lượng mẫu nhỏ Sáu khâu chính của quy trình xét. .. mẫu ngoài phong bì Bảo quản mẫu ở 40C (ngăn rau của tủ lạnh), nếu chưa đi gửi ngay  Kiểm tra lại xem các phong bì đã dán kín chưa Sau đó, gộp tất cả các phong bì nhỏ lại, cho vào một phong bì lớn cùng với đơn xin xét nghiệm và lệ phí xét nghiệm, rồi gửi ngay bằng dịch vụ chuyển phát nhanh (EMS)  Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR 1 Lấy mẫu: ADN có thể tách chiết từ những mẫu... alen : Thang alen chuẩn của locus D7S820 với 7 alen khác nhau được phân tách bằng kỹ thuật điện trên gel PA Xác định quan hệ huyết thống: Đạt chính xác 99,9% GS Lê Đình Lương và các cộng sự đã tự bỏ tiền túi để nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này trong việc xác định quan hệ huyết thống Đến năm 2000, với đề tài "Xác định nhanh, chính xác các đặc trưng cá thể ở người bằng kỹ thuật PCR" Với các mẫu máu, tóc,... bình 1,75 và hàm lượng >50ng/ml b Kỹ thuật PCR: Quá trình PCR với các giai đoạn cơ bản: biến tính, gắn mồi và tổng hợp Quá trình được thực hiện với các nhiệt độ gắn mồi khác nhau được lựa chọn từ 50oC đến 58oC Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra trên gel agaroza 2%, nhuộm ethidium bromide (25mg/ml) 2 Phương pháp: c Kỹ thuật điện di: Các mẫu sau khi thực hiện quá trình PCR đã được kiểm tra trên gel agaroza... công nghệ PCR Real-time trong xét nghiệm bệnh tôm Việc xét nghiệm bệnh tôm bằng hệ thống PCR Real-time được tiến hành theo qui trình khép kín Trước tiên, mẫu tôm Post được nghiền nhuyễn trong một dung dịch tách chiết gen di truyền (DNA) Sau đó, hỗn hợp này được đưa qua nồi hấp cách thủy trong vòng 10 phút nhằm làm sốc nhiệt để trích ly DNA Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time trong xét nghiệm bệnh... các alen đã khảo sát được theo quy ước quốc tế Alen của locus D7S820 được ký hiệu từ 6 đến 14 căn cứ vào số đoạn lặp của mỗi alen II Kết quả 1 Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi quá trình PCR : ở tất cả các điều kiện nhiệt độ gắn mồi từ 50oC đến 58oC đều có sự hình thành sản phẩm PCR thể hiện ở sự có mặt của các băng ADN trên bản gel agaroza Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR ở một số mẫu trên gel agaroza... DNA Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time trong xét nghiệm bệnh tôm Dùng thiết bị chuyên dụng lấy khoảng 2 µl (microlít) dung dịch này cho vào một ống có chứa hóa chất gọi là ống phản ứng Ống phản ứng được đặt vào máy lưu nhiệt trong vòng 2 tiếng đồng hồ Tại đây sẽ diễn ra quá trình phản ứng nhân bản DNA ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SƠ BỘ TẦN SUẤT PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS D7S820 NGƯỜI VIỆT NAM... liệu: - Máu tươi của những người khoẻ mạnh không có cùng quan hệ huyết thống do Viện Quân y 108 cung cấp - Hoá chất: Hoá chất cho tách chiết ADN (hãng Sigma); hoá chất dùng cho quá trình PCR đối với locus D7S820 (mồi đặc hiệu cho locus D7S820 của hãng Pharmacia-Thuỵ Điển; Taq ADN polymeraza -của Viện Sốt rét Ký sinh trùng và Côn trùng Trung ương); hoá chất dùng cho điện di và nhuộm băng ADN (của các hãng . hiện của gen Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time trong xét nghiệm bệnh tôm trong xét nghiệm bệnh tôm Việc xét nghiệm bệnh tôm bằng hệ thống PCR. ra quá trình phản ứng nhân bản DNA. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SƠ BỘ TẦN SUẤT PHÂN KHẢO SÁT SƠ BỘ TẦN SUẤT PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS D7S820 BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS. III. THỰC NGHIỆM III. THỰC NGHIỆM PCR PCR  PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen.  PCR cần rất nhiều