Nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano kim loại (coban, bạc, sắt và đồng) đến quá trình chuyển gen vào giống đậu tương việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ---Nguyễn Trung Anh “Nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano kim loại coban, bạc, sắt và đồng đến quá trình chuyển gen vào giống đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-Nguyễn Trung Anh

“Nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano kim loại (coban, bạc, sắt và đồng) đến quá trình chuyển gen

vào giống đậu tương Việt Nam”

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày… tháng… năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Trung Anh

LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Nguyễn Văn Đồng, Giám đốc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật,

Viện Di truyền Nông nghiệp – người thầy luôn kiên nhẫn và hết lòng hướng dẫn, giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện luận văn

Tôi xin gửi tới PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên, Viện Công nghệ Sinh học & Công

nghệ Thực phẩm lời cảm ơn chân thành, người đã luôn hỗ trợ và giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình, những ý

kiến đóng góp quý báu cũng như sự chỉ dẫn tận tình của TS Hà Văn Chiến trong

suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn cùng tập thể cán bộ Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông Nghiệp về sự nhiệt tình giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể thực hiện được đề tài này một cách suôn sẻ và thuận lợi

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Công nghệ Môi trường đã hỗ trợ và giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị, người thân cùng bạn bè lời cảm ơn thân thương nhất - những người đã luôn sát cánh, quan tâm và dành cho tôi tình cảm chân thành trong suốt thời gian tôi học tập và hoàn thành luận văn này cũng như đã luôn luôn bên cạnh và ủng hộ tôi trong cuộc sống

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên cao học

Nguyễn Trung Anh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

MỞ ĐẦU 9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 11

1.1 Giới thiệu chung về cây đậu tương 11

1.1.1 Nguồn gốc và tình hình sản xuất đậu tương 11

1.1.2 Giá trị của cây đậu tương đối với con người 14

1.1.3 Một số giống đậu tương ở Việt Nam 15

1.2 Hạt nano kim loại và vai trò của các hạt kim loại lên cây trồng 17

1.2.1 Định nghĩa về vật liệu hạt nano 17

1.2.2 Ảnh hưởng của hạt kim loại nano tới cây trồng 17

1.3 Gen bar 20

1.4 Chọn tạo giống đậu tương bằng phương pháp chuyển gen 21

1.5 Thực trạng nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương 23

1.6 Các nghiên cứu về ứng dụng hạt nano trong nông nghiệp tại Việt Nam 25

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 27

2.2 Vật liệu nghiên cứu 27

2.2.1 Vật liệu 27

2.2.2 Hóa chất và môi trường 28

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 29

2.2.4 Trình tự mồi và enzyme cắt giới hạn sử dụng trong nghiên cứu 29

2.3 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 30

2.3.2 Chọn lọc cây con ra đất bằng Basta 32

2.3.3 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá 32

2.4.4 Phương pháp nhân bản trình tự ADN bằng kỹ thuật PCR 33

2.5 Các chỉ tiêu đánh giá 34

2.5 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hạt nano đến quá trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT22 36

3.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hạt nano đơn lẻ đến từng giai đoạn trong quá trình chuyển gen vào đậu tương ĐT22 bằng A tumefaciens 36

3.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hạt nano kết hợp đôi lên quá trình chuyển gen vào đậu tương ĐT22 bằng Agrobecterium tumefaciens 44

3.2 Phân tích hiệu quả tiếp nhận gen của đậu tương ĐT22 dưới tác động của hạt nano đơn lẻ và nano kết hợp đôi bằng phương pháp PCR 52

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

4.1 Kết luận 56

4.2 Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 64

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tình hình sản xuất đậu tương của 4 quốc gia đứng đầu thế giới trong

những năm gần đây 12

Bảng 1.2: Sản lượng đậu tương của Việt Nam trong những năm gần đây 13

Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm 29

Bảng 2.2:Thành phần phản ứng PCR 33

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của các hạt nano đơn lẻ đến khả năng phát sinh đa chồi của đậu tương 36

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của các loại hạt nano đơn lẻ ở giai đoạn sống sót sau chọn lọc của đậu tương trong quá trình chuyển gen 39

Bảng 3.3: Tỉ lệ cây con sống sót sau khi phun basta 42

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của hạt nano kết hợp đôi tới việc tạo đa chổi trong chuyển gen vào đậu tương ĐT22 45

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của hạt nano kết hợp đôi đến khả năng sống sót sau chọn lọc của đậu tương trong quá trình chuyển gen 47

Bảng 3.6: Tỉ lệ cây con sống sót sau khi phun basta 50

Bảng 3.7: Kết quả phân tích PCR các dòng đậu tương chuyển gen 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn 19 Hình 2.1: Sơ đồ cấu trúc vector pZY101 28 Hình 3.1: Khả năng phát sinh đa chồi của đậu tương ở các công thức thí nghiệm 37 Hình 3.2: Khả năng đa chồi sống sót trong môi trường chọn lọc của đậu tương ở các công thức thí nghiệm 40 Hình 3.3: Các chồi của đậu tương được kéo dài trên môi trường SEM 41 Hình 3.4: Cây đậu tuơng chuyển gen trên môi trường ra rễ RM 42 Hình 3.5: Cây đậu tuơng chuyển gen và đối chứng trước khi phun và sau 6 ngày phun Basta nồng độ 100 mg/l 43 Hình 3.6: Ảnh hưởng của hạt nano kim loại đơn lẻ (Ag, Co, Fe, Cu) trong quá trình chuyển gen 44 Hình 3.7: Khả năng phát sinh đa chồi của đậu tương ở các công thức thí nghiệm sau

14 ngày trên môi trường kích thích ra chồi 46 Hình 3.8: Khả năng đa chồi sống sót trong môi trường chọn lọc của đậu tương ở các công thức thí nghiệm 48 Hình 3.9: Các chồi của đậu tương trong môi trường kéo dài và môi trường ra rễ 49 Hình 3.10: Cây đậu tuơng chuyển gen và đối chứng trước khi phun và sau 6 ngày phun Basta nồng độ 100 mg/l 50 Hình 3.11: Ảnh hưởng của hạt nano kim loại đơn lẻ (Ag, Co, Fe, Cu) trong quá trình chuyển gen 51 Hình 3.12: Kết quả tách chiết DNA tổng số của các dòng đậu tương chuyển gen To 52

Hình 3.13: Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen bar trong cây đậu tương chuyển gen T0 53

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

ADN Axit deoxyribonucleic

ĐT22 Giống đậu tương ĐT22

ĐT26 Giống đậu tương ĐT26

DT84 Giống đậu tương DT84

ĐVN9 Giống đậu tương ĐVN9

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic

GA3 Gibberelic acid

GM Germination medium – môi trường nảy mầm hạt

IBA Indole-3-butyric acid

PCR Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi polymerase

RM Rooting medium – môi trường ra rễ

SDS Sodium dodecysulfat

SEM Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi

SIM Shoot induction medium – môi trường tạo đa chồi

TAE Tris – acetate – EDTA

MỞ ĐẦU

Đậu tương (Glycine max L Merr) hay còn gọi là đỗ tương, là cây trồng có giá trị

dinh dưỡng cao được các nhà khoa học xếp vào một trong những “thực phẩm chức năng” [2] và đóng vai trò thiết yếu để nâng cao tiêu chuẩn thực phẩm cho con người ở những nước đang phát triển trong tình trạng thiếu hụt protein [26] Lượng dầu của cây đậu tương đứng ở vị trí thứ nhất trong tổng số dầu thực vật được tiêu thụ ở thế giới (http://worldvegetableoil) Đây cũng là loại cây trồng có tác dụng trong việc luân xen canh, cải tạo đất rất hiệu quả

Ngày nay, công nghệ nano đã được triển khai nghiên cứu rộng rãi trên phạm vi toàn cầu, trong nhiều lĩnh vực khác nhau và bước đầu tạo ra những sản phẩm được ứng dụng trong đời sống của con nguời, đặc biệt trong lĩnh vực nông nghiệp Một số những nghiên cứu đã ứng dụng các hạt nano để xử lý hạt giống nhằm cải thiện tốc độ nảy mầm và sinh trưởng, chất lượng và năng suất thu hoạch của nông sản [20] Công nghệ nano cũng được ứng dụng trong phân bón lá bao gồm các nguyên tố vi lượng cần thiết trong từng giai đoạn phát triển của cây trồng Việc sử dụng các công cụ hỗ trợ như cảm biến, công nghệ nano cũng có thể phát hiện và chẩn đoán nhanh các chứng bệnh do vi sinh vật gây ra cho cây trồng Trong các nghiên cứu ứng dụng của các hạt nano trong nông nghiệp, phương pháp được sử dụng nhiều là xử lý hạt giống cây trồng với hạt nano trước khi trồng Năm 2010, Roghayyeh và cộng sự đã nghiên cứu

và thấy rằng các hạt nano sắt (Fe) có ảnh hưởng lên các đặc điểm sinh học ở đậu tương [49] Ngoài ra, các hạt nano sắt (Fe), coban (Co) và đồng (Cu) cũng cho hiệu quả lớn khi xử lý hạt giống cây trồng, trong đó có các cây họ đậu

Hiện nay, việc tạo ra cây trồng biến đổi gen bằng kỹ thuật chuyển gen để ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng (trong đó có cây đậu tương) đem lại lợi ích cho nền nông nghiệp là vô cùng quan trọng Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen vào giống đậu tương ĐT22 đang trồng phổ biến tại Việt Nam hiện nay chỉ đạt dưới 1% [13] Ở quy trình chuyển gen vào đậu tương bằng phương pháp tạo cụm

chổi thông qua nuôi cấy in vitro nốt lá mầm của một vài giống đậu tương mô hình

(William Mark, Thom ) đã được triển khai ở một số phòng thí nghiệm, bước đầu đã cho kết quả Tuy nhiên các giống đậu tương mô hình (William, Mark, Thom ) rất khó trồng phổ biến tại các mùa vụ ở Việt Nam, đặc biêt tại các tỉnh thuộc miền Bắc Việt

Nam tỉ lệ đậu quả của các giống đậu tương mô hình này còn rất hạn chế Do đó, với mong muốn nâng cao hiệu suất chuyển gen vào đậu tương Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tìm hiểu ảnh hưởng của các hạt nano kim loại lên quá trình chuyển

gen vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Xuất

phát từ yêu cầu thực tiễn và các nghiên cứu đã tiến hành, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano kim loại (coban, bạc, sắt và đồng) đến quá trình chuyển gen vào giống đậu tương Việt Nam”

Với mong muốn phát triển và tăng hiệu quả của quy trình chuyển gen vào giống đậu tương thương mại Việt Nam

Mục tiêu của đề tài

Chuyển thành công gen chỉ thị kháng thuốc diệt cỏ (bar) vào giống đậu tương

ĐT22 của Việt Nam và xác định ảnh hưởng của hạt nano kim loại đến quá trình chuyển gen

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định ảnh hưởng của hạt nano kim loại đơn lẻ (coban, bạc, sắt, đồng) đến quá quá trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens

Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng của hỗn hợp các hạt nano kim loại (coban, bạc, sắt, đồng) ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT22 thông qua

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Nội dung 3: Phân tích cây chuyển gen và đánh giá hiệu quả chuyển gen của

quy trình

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về cây đậu tương

1.1.1 Nguồn gốc và tình hình sản xuất đậu tương

Nguồn gốc đậu tương

Đậu tương hay còn gọi là đỗ tương là loại cây họ Đậu Fabaceae, có tên khoa học (Glycine max L Merr) và là loài có hàm lượng protein cao được trồng để làm

thức ăn cho người và gia súc [18] Các bằng chứng về lịch sử, địa lý, khảo cổ học chỉ

ra rằng đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc vào khoảng thế kỉ XVII trước công nguyên và được truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỉ thứ VIII, sau đó du nhập vào nhiều nước Châu Á khác như: Indonesia, Philippin, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam,… vài thế kỷ sau đó Đậu tương là nguồn dầu thực vật và protein lớn nhất trên thế giới với quy mô canh tác lớn và tập trung ở vài quốc gia như Mỹ, Argentina, Brazil, Canada, Trung Quốc, Ấn Độ và Paraguay Ngay cả đến ngày nay đậu tương cung cấp một nguồn protein rất quan trọng trong khẩu phần của nhiều quốc gia ở Châu Á

và là một thực phẩm và sản phẩm công nghiệp cực kỳ có giá trị trên khắp Châu Á

Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu tương

và 7 nước công nghiệp, đã canh tác cây trồng BĐG Trong đó, 54% diện tích được trồng tại các quốc gia đang phát triển và 46% diện tích tại các nước công nghiệp Các quốc gia dẫn đầu trong việc canh tác cây trồng BĐG là Mỹ, Brazil, Argentina, Canada

và Ấn Độ Diện tích canh tác cây trồng BĐG tại 5 quốc gia này chiếm tới 91% tổng diện tích canh tác toàn cầu Đứng đầu trong việc trồng cây trồng BĐG là Mỹ (72,9 triệu ha) tiếp đến là Brazil (49,1 triệu ha), Argentina (23,8 triệu ha), Canada (11,6 triệu ha), Ấn Độ (10,8 triệu ha) Trong số các cây trồng biến đổi gen, đậu tương luôn

là cây được nghiên cứu, trồng thử nghiệm và thương mại hóa với quy mô và diện tích lớn Trong tổng số 181,1 triệu ha cây trồng BĐG thì diện tích trồng các giống đậu tương BĐG chiếm 50% diện tích canh tác cây trồng biến đổi gen trên toàn thế giới (ISAAA, 2016) Đây là sự đóng góp to lớn của các nhà chọn tạo giống đậu tương thế giới góp phần vào sự phát triển của ngành nông nghiệp toàn cầu Theo thống kê của

Tổ chức Quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học trong Nông nghiệp (ISAAA 2016), diện tích canh tác cây trồng biến đổi gen đã tăng gấp 110 lần sau 21 năm thương mại hoá

Trong năm 2016 diện tích đậu tương công nghệ sinh học chiếm 50% tổng số diện tích cây trồng trong công nghệ sinh học trên thế giới giảm 1% so với năm 2015 nhưng diện tích trồng cây đậu tương chống chịu được thuốc trừ cỏ trong năm 2016 là 23,4 triệu ha, tăng khoảng 82% so với năm 2015 Hiện nay, có 3 quốc gia sản xuất đậu tương lớn nhất thế giới là Mỹ, Brazil, Argentina Trong đó, năm 2016 Brazil là nước sản xuất, tiêu thụ và xuất khẩu đậu tương lớn nhất cụ thể ở bảng 2

Bảng 1.1: Tình hình sản xuất đậu tương của 4 quốc gia đứng đầu thế giới trong

Sản lượng (triệu tấn)

Diện tích gieo trồng (triệu ha)

Sản lượng (triệu tấn)

(Nguồn FAOSTAT, 2016) Trên thế giới có 28 nước đã báo cáo việc tăng năng suất của cây đậu tương công nghệ sinh học có khả năng chịu được thuốc diệt cỏ Ba nước phát triển lớn nhất như Mỹ, Braxin, Argentina có khu vực trồng giống đậu tương chống chịu thuốc diệt

cỏ lần lượt trong năm 2016 là: Mỹ (31,84 triệu ha) giảm nhẹ so với năm 2015 là 1,7%, Braxin (12,43 triệu ha) và Argentina (18,6 triệu ha) (https://www.isaaa.org Báo cáo ISAAA 2016) Có nhiều nguyên nhân gây ra sự không ổn định về năng suất và sản

lượng đậu tương , một trong những nguyên nhân là do diện tích đất canh tác đậu tương ở một số nước giảm nhẹ nhưng chỉ riêng Braxin là tăng diện tích trồng đậu tương Đáng chú ý là do tình hình biến đổi khí hậu và hạn hán là yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất đậu tương trên toàn thế giới

Ở Việt Nam

Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, cục trồng trọt năm

2016 cho thấy: Năm 2016, là một năm vô cùng khó khăn với ngành Nông nghiệp nói chung và lĩnh vực trồng tro ̣t nói riêng Việc ảnh hưởng của điều kiện khí hậu tới năng suất của cây trồng trên cả nước trong đó có đậu tương là yếu tố quan trọng Nhưng do những giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như giá trị về mặt công nghiệp của cây đậu tương rất lớn nên hằng năm Việt Nam nhập khẩu một lượng lớn đậu tương từ các quốc gia khác trên thế giới (Năm 2016 diện tích trồng đậu tương đạt khoảng 98 ngàn ha, giảm 2 ngàn ha so với năm 2015, sản lượng đạt 145 ngàn tấn giảm khoảng hơn 1 nghìn tấn so với năm 2015 Dự báo trong năm 2017 Việt Nam sẽ nhập 5,2 triệu tấn đậu tương và là nước nhập khẩu đậu tương nhiều nhất thế giới)

Theo tổng cục Thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, mưa bão nặng nề và kéo dài suốt năm đã khiến năng suất cây trồng và diện tích thu hoạch đậu tương giảm và được thống kê ở bảng 2

Bảng 1.2: Sản lượng đậu tương của Việt Nam trong những năm gần đây

Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông

thôn, số liệu dự báo cu ̉a USDA

Ở nước ta, việc ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo giống cây trồng đã được triển khai nghiên cứu một cách đầy đủ từ khá lâu Trong lĩnh vực biến nạp gen ở đậu tương thuộc đề tài: “Tạo các dòng đậu tương biến đổi gen kháng sâu” đã được

triển khai bởi nhóm nghiên cứu của TS Trần Thị Cúc Hòa (Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long) [16] Ngoài ra, Viện Công nghệ Sinh học cũng đã thực hiện các nghiên cứu cấp cơ sở: “Nghiên cứu và hoàn thiện kỹ thuật biến nạp gen ở đậu tương

(2005 - 2006)”; phát triển hệ thống tái sinh in-vitro ở đậu tượng phục vụ cho biến nạp

gen của Nguyễn Thị Thúy Hường và cs, “tạo dòng đậu chịu hạn” tại Viện Di truyền Nông nghiệp [11] Tuy nhiên khả năng ứng dụng triển khai để tạo cây đậu tương biến đổi gen ở Việt Nam vẫn còn hạn chế Do có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen Tuy nhiên, việc cải tiến các yếu tố nhằm tăng hiệu quả của quy trình biến nạp gen là cần thiết để đạt được tỷ lệ gen chuyển thành công cao vào giống đậu tương thương mại Việt Nam

1.1.2 Giá trị của cây đậu tương đối với con người

Đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao và mang lại nhiều lợi ích khác nhau Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt Vì thế cây đậu tương được gọi là "Ông Hoàng trong các loại cây họ đậu" Do vậy, cây đậu tương được đánh giá là cây trồng có giá trị trong nhiều lĩnh vực như:

* Giá trị về dinh dưỡng

Đậu tương là một trong những cây trồng thương mại được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao với protein chiếm khoảng 35,5 - 40%, lipit dao động từ 12-24%, carbohydrate từ 10-16% Trong khi đó protein của gạo chỉ đạt 6,2 - 12%; ngô: 9,8 - 13,2%; thịt bò: 21%; thịt gà: 20%; cá là

17 - 20%; trứng là 13 - 14% Như vậy, protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong các protein có nguồn gốc động vật, thực vật khác [8]

Bên cạnh hàm lượng lớn về protein và lipit, hạt đậu tương còn chứa nhiều loại axit amin trong đó có 8 axit amin không thay thế như: Valine; Leucine; Isoleucine; Methionine; Tryptophan; Threonine; Lysine; Phenylalanine Điều này cho thấy đây là loại hạt mà có đầy đủ các loại axit amin cần thiết Ngoài ra, đậu tương là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng nhất thế giới Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu khác Trong hạt đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin đặc biệt là vitamin B1, B2, A, C (vitamin C có nhiều trong giá đậu tương) [6] Hạt đậu tương có

chứa nhiều hợp chất phenolic như axit chlorogenic, axit caffeic, axit ferulic acid coumaric Đây là những chất chống oxy hóa tác dụng có lợi cho sức khỏe con người

p-* Giá trị về nông nghiệp

- Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc (1 kg hạt đậu tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi) Cây đậu tương gồm: thân, lá, quả, hạt có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc Sản phẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao: N2: 6,2%,

P2O5: 0,7%, K2O: 2,4%, vì thế làm thức ăn cho gia súc rất tốt [6]

- Cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt (1 ha trồng đậu tương nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60 kg N2). Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc bón N2 Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng N2 trong thân chiếm 0,05%, trong lá: 0,19% [18]

* Giá trị về công nghiệp

Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, vv…, nhưng chủ yếu đậu tương được dùng để ép dầu Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật Đặc điểm của dầu đậu tương: khô chậm, chỉ số iốt cao: 120- 127; ngưng tụ ở nhiệt độ: -15 đến -18oC Từ dầu này người ta chế ra hàng trăm sản phẩm công nghiệp khác như: làm nến, xà phòng, v.v [18]

1.1.3 Một số giống đậu tương ở Việt Nam

Giống đậu tương ĐT22

Tác giả: Trần Đình Long, Trần Thị Trường, Hoàng Minh Tâm, Quách Ngọc Truyền, Nguyễn Thị mỹ Hạnh, Nguyễn Thị Chúc, Lê Tuấn phong, Nguyễn Đạt Thuần Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

Giống ĐT22 do trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo từ dòng đột biến của hạt lai (DT95 x ĐT12) và được Hội đồng Khoa học Công nghệ (Bộ

NN&PTNT) công nhận là giống mới Quyết định số 219 QĐ/BNN-KHCN ngày 19/01/2006

Những đặc điểm chính: Thời gian sinh trưởng trung bình từ 85-90 ngày Hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đâm, quả chín có màu nâu Khối lượng 1000 hạt khoảng 155-160g Có khả năng kháng bệnh phấn trắng Năng suất từ 18-27 tạ/ha, tùy thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh ĐT22 thích hợp gieo trồng trong cả 3 vụ trong năm

Giống đậu tương ĐVN9

Giống đậu tương ĐVN9 do nhóm các nhà khoa học của Viện nghiên cứu Ngô lai tạo và chọn lọc từ tổ hợp lai ĐT12 x VN205

Những đặc tính chính: ĐVN9 là giống đậu tương chín sớm: vụ xuân khoảng

88-90 ngày, vụ hè: từ 75 – 77 ngày, vụ đông: 78-80 ngày Dạng cây đứng, lá hình trứng nhọn, hoa tím, vỏ quả chín màu vàng rơm, hạt vàng, rốn hạt nâu nhạt Chiều cao cây trung bình 27,3 - 56,5 cm; phân cành mạnh khoảng 1,7 – 3,1 cành cấp 1 trên một cây; sai quả khoảng 22,9 – 49,5 quả trên một cây Khối lượng 1000 hạt khoảng 148,5 – 171,8 gam Năng suất trung bình ở vụ xuân đạt 17 tạ/ha, vụ hè đạt 21 tạ/ha

Giống đậu tương ĐT26

Tác giả: Trần Đình Long, Trần Thị Trường, Nguyễn Thị Loan, Nguyễn Thị Chinh, Nguyễn Văn Thắng, Trần Thanh Bình và CTV Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

Giống đậu tương ĐT26 được chọn từ tổ hợp lai ĐT2000 x ĐT12 Được công nhận cho sản xuất thử theo Quyết định số 111/QĐ-TT-CCN ngày 3 tháng 6 năm 2008 Những đặc điểm chính: Thời gian sinh trường trung bình từ 90-95 ngày Chiều cao cây 45-60 cm, hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chính có màu nâu, phân cành khá nhiều từ 2-3 cành/cây, có 30-35 quả chắc/cây, tỷ lệ quả 3 hạt 20-40% Khối lượng 1000 hạt 180-190g Năng suất 21-29 tạ/ha, tùy thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh Giống thích hợp trong vụ xuân và vụ đông

Giống đậu tương DT84

Giống đậu tương DT84 do Viện Di truyền Nông nghiệp chọn tạo bằng phương pháp xử lý đột biến dòng 33-3 (tổ hợp lai ĐT80 x ĐH4) được công nhận giống Quốc gia năm 1995 và đưa vào khảo nghiệm, sản xuất từ năm 1995

Những đặc điểm chính: Thời gian sinh trưởng 85 – 90 ngày Chiều cao cây từ 50 – 60 cm, cây sinh trưởng khỏe, ít phân cành Hạt to, màu vàng sáng, hoa màu tím, khối lượng 1000 hạt 160 – 180 hạt, năng suất đạt 15 – 20 tạ/ha Giống được trồng cả 3 vụ: xuân, hè, đông, thích hợp trồng thâm canh

Trong đề tài nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen vào các giống đậu tương của Việt Nam của Ths Đỗ T.Như Quỳnh tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông Nghiệp đã chỉ ra trong các giống đậu tương của Việt Nam bao gồm giống ĐT22, ĐVN9, ĐT26, DT84 cho thấy giống đậu tương ĐT22

có khả năng tái sinh cụm chồi cao và có tiềm năng tiếp nhận gen tốt nhất trong 4 giống đậu tương nghiên cứu [3] Do vậy, chúng tôi chọn giống ĐT22 làm nguyên liệu cho đề tài nghiên cứu

1.2 Hạt nano kim loại và vai trò của các hạt kim loại lên cây trồng

1.2.1 Định nghĩa về vật liệu hạt nano

Hạt nano kim loại là một khái niệm để chỉ các hạt có hình dáng, kích thước trên quy mô nanomet (nm, 1nm = 10-9 m) được tạo thành từ các kim loại Hạt nano là vật liệu trong đó ít nhất có một chiều có kích thước nm Về trạng thái của vật liệu nano, người ta phân chia thành ba trạng thái, rắn, lỏng và khí Vật liệu nano được tập trung nghiên cứu hiện nay, chủ yếu là vật liệu rắn, sau đó đến chất lỏng và khí Về hình dáng của hạt nano người ta chia thành các loại sau:

Vật liệu nano không chiều: Là cả ba chiều đều có kích thước nano, không còn chiều tự do nào cho điện tử Ví dụ: đám nano, hạt nano…

Vật liệu nano một chiều: Là vật liệu trong đó có hai chiều có kích thước nano, điện tử được tự do trên một chiều Ví dụ; dây nano, ống nano…

Vật liệu nano hai chiều: Là vật liệu trong đó một chiều có kích thước nano, hai chiều tự do Ví dụ: màng mỏng …

Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano hay nanocomposite trong đó chỉ có một phần của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có nano không chiều, một chiều hoặc hai chiều đan xen lẫn

1.2.2 Ảnh hưởng của hạt kim loại nano tới cây trồng

Kim loại đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển của tế bào, trong đó có các tế bào nuôi cấy Mỗi loại kim loại có các đặc tính riêng biệt với từng

loài, từng mô và từng giai đoạn sinh trưởng riêng biệt Trong đất tồn tại lượng kim loại rất lớn, có những yếu tố từ 1 - 10% trọng lượng đất khô như Al, Fe; có yếu tố từ 0,01 - 0,1% đất khô như Zn, Cu; có yếu tố chiếm 0,001 - 0,01% đất khô như Co, Mo Nhưng hàm lượng kim loại cây cần dùng thường rất ít (dưới 0,001%) Nhưng phần lớn cây đều không hấp thụ đủ lượng kim loại cần dùng Theo các nhà khoa học, thì nguyên nhân chính của hiện tượng này là do lượng kim loại nằm trong đất thường là dạng khó hấp thu nhưng đây cũng là những chất vi lượng cần thiết để cây phát triển

và làm tác nhân hoạt hoá trong các hệ thống enzyme của cây trồng

Đối với các kim loại ở dạng tinh thể có (kích thước 40 – 100 nm) là những hạt nano được biết đến là trạng thái siêu phân tán thì các hạt nano kim loại dễ dàng được hấp thụ bởi tế bào thực vật trong quá trình nuôi cấy Hạt nano kim loại có khả năng tạo sức căng bề mặt lớn có tác dụng tăng cường trao đổi chất

Nano kim loại bạc (Ag): Bạc (Ag) và các hợp chất của bạc thể giúp tăng hiệu suất quang hợp thúc đẩy quá trình tổng hợp đường giúp cây trồng tăng trưởng nhanh, khỏe mạnh, tăng khả năng chống chịu bệnh tốt hơn Đặc biệt, đối với hạt nano bạc (Ag) khi gặp các vi khuẩn, virus sẽ thì tương tác với lớp protein trên bề mặt vi khuẩn, virus rồi

từ đó phá hủy màng tế bào làm ức chế phát triển

Do có diện tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn

Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion Ag+ Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó, khả năng hoặt động của vi khuẩn lại có thể được phục hồi Do động vật không có thành tế bào,

vì vậy chúng ta không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này

Có một cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn đáng chú ý được mô tả như sau: Sau khi Ag+ tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó sẽ đi vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm sunfuahydrin – SH của phân tử enzym chuyển hóa oxy và vô hiệu hóa men này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của tế bào vi khuẩn

Men hoạt hóa + 2 Ag+ Men thụ động + 2H+

Hình 1.1: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn

Ngoài ra các ion bạc còn có khả năng liên kết với các base của DNA và trung hòa điện tích của gốc phosphate do đó ngăn chặn quá trình sao chép DNA

Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt Hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano [9]

Nano kim loại sắt (Fe): Sắt là một yếu tố tác động đến sự phát triển của thực vật Đối với cây trồng sắt (Fe) tham gia hỗ trợ và xây dựng enzyme trong dây truyền tổng hợp sắc tố diệp lục, tham gia vào quá trình phân ly nước, photphoryl hóa quang hóa và

là thành phần bắt buộc trọng hệ enzyme oxy-hóa khử (cytocrom) Kim loại sắt (Fe) tồn tại nhiều trong đất, nhưng hàm lượng sắt có trong cây trồng lại rất thấp Do đó việc thiếu sắt trong nông nghiệp là một vấn đề khá phổ biến

Thực vật có thể hấp thu sắt ở dạng Fe2+ và Fe3+ nhưng hầu hết sắt trên lớp vỏ trái đất tồn tại dưới hình thức Fe3+ Trong cây trồng sắt được hấp thụ và tồn tại nhiều dưới hình thức Fe2+ do trạng thái Fe2+ dễ hòa tan, nhưng lại dễ dàng bị oxy hóa thành Fe3+

và sau đó bị kết tủa Trạng thái Fe3+ không hòa tan trong môi trường trung tính cao Vì vậy hàm lượng sắt là rất ít trong cây trồng ở môi trường đất kiềm và môi trường đất có chứa nhiều canxi Hơn nữa, trong các loại đất, sắt dễ dàng kết hợp với phosphat, carbonat, magiê, canxi và các ion hydroxit

Sắt là một nguyên tố cần thiết cho hệ thống các enzyme để thực hiện phản ứng oxy hóa khử và chuỗi vận chuyển điện tử trong cây, tổng hợp chất diệp lục, duy trì cấu trúc của lục lạp Sắt cũng có vai trò điều hòa hô hấp, quang hợp, khử nitrat và sulfat - những phản ứng cần thiết để thực vật phát triển và sinh sản [31] Hiện nay, trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, sắt chủ yếu được sử dụng dưới dạng chelate (Fe-EDTA) Fe-EDTA cho phép giải phóng từ từ và liên tục ion sắt vào môi trường nuôi cấy và hạn chế sự kết tủa của sắt thành dạng oxide [51] Một số nghiên cứu đã được tiến hành như nghiên cứu của Zhu et al (2008) về sự hấp thu, vận chuyển và tích lũy của nano

Fe3O4 trên cây bí ngô [60]; nghiên cứu về độc tính của nano sắt/sắt oxide và đồng/đồng oxide trên cây rau diếp [54] hay nghiên cứu của Racuciu và Creagna

(2006) về ảnh hưởng nano sắt từ phủ tetramethylammonium hydroxide lên sự phát triển ở cây ngô [47] Tuy nhiên, ảnh hưởng của nano sắt đến các loài thực vật đặc biệt

là trong nuôi cấy mô thực vật vẫn còn rất hạn chế

Nano kim loại coban (Co): Là kim loại có mặt trong khoảng một nửa số lượng môi trường nuôi cấy tế bào thực vật Mục đích bổ sung (Co) vào môi trường chống lại

sự gây độc của các chelat kim loại và có thể ngăn cản các phản ứng oxi hóa gây ra bởi đồng và sắt Coban (Co) đóng vai trò quan trọng trong quá trình cố định nitơ ở rễ cây

họ đậu, là thành phần cần thiết của enzym cobalomin Coban trong cơ thể thực vật thường tồn tại ở dạng ion và trong hợp chất porphyrin của vitamin B12.

Nano kim loại đồng (Cu): Kim loại đồng (Cu) có vai trò quan trọng trong các phản ứng chuyển hóa sinh hóa trong cơ thể sống Tuy nhiên, đồng (Cu) vừa là nguyên

tố vi lượng, vừa là chất độc hại đối với con người, cây trồng và động vật Trong môi trường đất, hàm lượng đồng (Cu) trong tự nhiên xấp xỉ 24–70 mg/kg, phụ thuộc vào thành phần khoáng vật và quá trình hình thành đất [1]

Đối với cây trồng: Theo kết quả nghiên cứu nhiều công trình cho thấy đồng (Cu)

có vai trò rất quan trọng đối với sự phát triển của cây trồng Đồng (Cu) tồn tại trong cây ở dạng Cu2+ Đồng đóng vai trò quan trọng trong cây trồng nông nghiệp như: (i): Tham gia vận chuyển điện tử trong quá trình quang hợp, kích thích sự vận chuyển sản phẩm quang hợp tới mô dự trữ và tổng hợp tinh bột (ii): Tham gia các thành phần protein chứa đồng và các enzyme xúc tác các thành phần phản ứng oxi hóa khử (iii): Tham gia thành phần của phức hệ nitratreductase trong quá trình khử nitrat ở tế bào (iv): Kích thích quá trình tổng hợp tinh bột và vitamin (v): Làm tăng tính chống chịu các mầm bệnh, tăng tính chịu rét, chịu nóng cho cây trồng Ngoài ra, đồng (Cu) có tác dụng thúc đẩy quá trình hấp thụ nước, vận chuyển và thoát hơi nước của cây, tăng tính chống chịu hạn cho cây trồng Thiếu đồng (Cu) cây trồng thường phát triển chậm, mất nước dẫn đến tình trạng cây bị héo Đồng (Cu) hình thành một số lớn chất hữu cơ tổng hợp với protein, acid amin và một số chất khác mà chúng ta thường gặp trong nước trái cây Việc thiếu đồng (Cu) hay việc thừa đồng (Cu) cũng xảy ra những biểu hiện ngộ độc mà chúng có thể dẫn tới tình trạng cây chết [8]

1.3 Gen bar

Gen bar là tên go ̣i của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT), có tác du ̣ng làm mất đô ̣c tính của phosphinothricin (PPT), là

hoa ̣t chất chính của thuốc trừ cỏ như Bialaphos và Basta Gen bar được ta ̣o dòng đầu tiên từ mô ̣t dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus Phương pháp đơn giản nhất để kiểm tra sự có mă ̣t của gen bar là phương pháp trực tiếp Mô, tế bào hoặc cây chuyển

gen được đă ̣t trên môi trường có các nồng đô ̣ phosphinothricin khác nhau (hoă ̣c các thuốc trừ cỏ tương ứng) và so sánh sinh trưởng của mô, tế bào hoặc cây đối chứng đă ̣t trên cùng môi trường [14]

1.4 Chọn tạo giống đậu tương bằng phương pháp chuyển gen

Năm 1988, cây đậu tương chuyển gen đầu tiên được công bố [34] Kể từ đó, đậu tương biến đổi gen đã được nghiên cứu và chọn tạo rộng rãi bởi các nhà sản xuất của

Mỹ, Brazil, Argentina, Canada… Từ những năm 1990, cây đậu tương kháng thuốc diệt cỏ “Roundup – ready” là sản phẩm độc quyền của công ty Monsanto Hiện nay,

họ đã và đang cung cấp giống cho hơn một nửa diện tích trồng đậu tương tại Mỹ Brazil và Mỹ, là hai nước có diện tích trồng cây biến đổi gen (bao gồm cả đậu tương) đứng thứ nhất trên thế giới Trong 20 năm trở lại đây việc trồng cây trồng BĐG không còn là xa lạ ở các nước phát triển Diện tích trồng cây BĐG trên thế giới đạt 2 tỷ ha trong đó 1 tỷ ha trồng cây đậu tương BĐG (ISAA, 2016)

Trong những năm gần đây, công nghệ gen phát triển mạnh các nhà nghiên cứu đã tiến hành giải trình tự genome của đậu tương và đã phát hiện trong genome của đậu tương có khoảng 66.000 gen được phân tích trong đó 38.172 gen là các nhân tố phiên

mã sẽ quyết định kiểu hình của cây chống lại với điều kiện bất thuận của môi trường bao gồm kháng hạn, kháng ngập úng, nồng độ protein và dầu cao…[24] Các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất chính bao gồm các yếu tố sinh học như cỏ dại, sâu, bệnh và các yếu tố phi sinh học như hạn, mặn, lạnh, nóng, nhiễm độc kim loại Năng suất giảm 37% bởi cỏ dại, 11% do các loại mầm bệnh, 1% do virus và 11% do sâu hại có nguồn gốc động vật Mức giảm do cỏ dại thay đổi không lớn giữa các khu vực (35 – 40%), tuy nhiên mức thiệt hại do mầm bệnh và sâu hại khá cao, tương ứng dao động ở 7 – 16% đối với mầm bệnh và 4 – 20% đối với sâu hại bởi vì sự khác biệt về sâu hại chính giữa các vùng miền [39] Các yếu tố bất lợi về thời tiết cũng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng của đậu tương Trong đó, ảnh hưởng của hạn hán là

đặc biệt nghiêm trọng, có thể làm giảm từ 40 - 60% năng suất đậu tương Hiện nay, các tính trạng đã và đang được các nhà chọn tạo giống đậu tương bằng công nghệ gen đang được các nhà nghiên cứu quan tâm bao gồm [36]

Kháng thuốc diệt cỏ: Ngày nay, hơn 85% đậu nành ở Mỹ và 56% đậu tương trên thế giới là đậu tương kháng thuốc diệt cỏ và đây là tính trạng phổ biến nhất của cây chuyển gen Các gen mã hóa cho tính trạng kháng các thành phần trong thuốc diệt

cỏ đã được ứng dụng gồm: ALS (acetolactate synthase), aroA (phân lập từ

Agrobacterium dòng CP4), GAT (phân lập từ Bacillus lichenformis), PAT (phân lập từ Streptomyces viridochromogenes), BAR (phân lập từ Streptomyces hygroscopicus)

Kháng nấm: Nấm là một trong những nguyên nhân gây bệnh ở đậu tương Các nhà khoa học đã phát hiện có hơn 40 loài nấm gây bệnh đã được xác định là có hại lên

sự phát triển của thực vật, trong đó có các loài xâm nhiễm trên cây đậu tương mà nghiêm trọng nhất là Phytophthora (gây thối rễ) Các gen kháng với Phytophthora tự nhiên (Rps) cũng đã được nhận diện, phân lập và chuyển vào cây đậu tương [32]

Ngoài ra, Sclerotina sclerotiorum (một loại mốc trắng) cũng là một tác nhân gây quan

trọng trên đậu tương Gen OXO đã được nghiên cứu biến nạp vào đậu tương để giúp cây kháng với mốc trắng [22]

Kháng tuyến trùng: Hơn 100 loài tuyến trùng có thể xâm nhiễm vào cây đậu nành, gây hư hại rễ, làm cây héo và do đó làm năng suất giảm Khi xâm nhiễm vào rễ, tuyến trùng tiết một số các hợp chất làm cho một số tế bào của rễ hình thành nên một cấu trúc đặc biệt gọi là hỗn bào SCN [36] Gen kháng SCN tự nhiên đã được định vị

và dòng hóa để chuyển vào cây đậu tương Ngoài ra, người ta còn tạo ra các cây kháng tuyến trùng bằng cách chuyển vào cây gen mã hóa cho các peptide ức chế tuyến trùng,ví dụ như Oc-I∆D86 hay CpT1

Kháng virus: Có khoảng hơn 100 loại virus gây hại trên thực vật, trong đó virus khảm BPMV và SbDV là hai loại virus quan trọng nhất tác động lên đậu tương [59] Phương pháp biến nạp làm im lặng gen sau phiên mã thông qua RNA đã được sử dụng

để tạo ra các cây chuyển gen kháng virus, bằng cách chuyển một cassette gồm mạch sense và mạch antisense của gen mã hóa cho protein vỏ virus (CP – coat protein) vào cây

Kháng côn trùng: Có rất nhiều loài côn trùng tấn công vào cây đậu tương Bt

(phân lập từ Bacillus thuringiensis) được xem là chiến lược hiệu quả nhất cho việc tạo

cây đậu tương chuyển gen kháng côn trùng Hơn 50 gen độc Bt đã được dòng hóa cho mục đích này [61] Bên cạnh gen Bt, protein TcdA (được phân lập từ Photorhabdus luminescens) cũng được chứng minh là có tiềm năng ứng dụng trong thực vật chuyển gen kháng côn trùng [37] Ở đậu tương, sâu hại là nhóm đối tượng thường xuyên gây

ra những thiệt hại đáng kể đối với sản xuất đậu tương Sâu hại tất cả các bộ phận của cây, nhóm sâu hại lá, thân, quả, sâu hại trong đất Có tới 360 loài sâu hại đậu tương ở các vùng trồng đậu tương trên thế giới Tuy nhiên, các loài sâu hại và mức độ gây hại

ở các vùng có sự biến thiên

Kháng các stress phi sinh học: Tạo ra cây chuyển gen kháng với các stress phi sinh học là một thách thức lớn với công nghệ sinh học thực vật Các stress này bao gồm: hạn hán, lạnh, tính mặn, nhiệt và kim loại nặng Một số gen tiềm năng cho kháng stress phi sinh học trên cây đậu tương là: CAX1 (mã hóa cho protein của kênh vận chuyển cation/proton trên màng tế bào, ứng dụng trong việc tạo cây chuyển gen kháng mặn), P5CR (mã hóa cho một enzyme chìa khóa trong con đường tổng hợp proline, tích lũy proline có thể dẫn đến sự hình thành tính kháng hạn và kháng nhiệt

độ cao) Quach và cs, đã chứng minh được các gen GmNAC003 và GmNAC004 có

tiềm năng ứng dụng trong chọn tạo giống đậu tương kháng hạn bằng công nghệ gen

Các cây Arabidopsis sau khi được biến nạp các gen này đã thể hiện tính chống chịu

hạn tốt, bộ rễ phát triển khỏe hơn so với đối chứng [44] Các điều kiện bất lợi của môi trường diễn ra do hệ quả của sự thay đổi biến đổi khí hậu toàn cầu, trong đó, đặc biệt

là tình trạng hạn hán và thiếu nước sử dụng đã và đang trở thành vấn nạn chung của nhiều quốc gia [23] Đối với đậu tương, ảnh hưởng bởi sự thiếu hụt nước gây ra các hệ quả to lớn Do đó, tìm ra được giống đậu tương có khả năng chống lại với các điều kiện khắc nghiệt của khí hậu hiện nay rất cần thiết Tuy nhiên, việc tạo ra cây đậu tương chống chịu hạn vẫn còn khó khăn

1.5 Thực trạng nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương

Công nghệ biến nạp gen ở đậu tương đã được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và cải tiến Trong đó, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens vào mô in-vitro nhằm tạo cây trồng biến đổi gen đem lại

tỷ lệ thành công cao và ít tốn kém Ngày nay, hai hệ thống chuyển gen ở đậu tương là chuyển gen thông qua nốt lá mầm (cotyledon node) và thông qua phôi vô tính (embryogenesis) được cho là có hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi Hinchee và cs (1988) đã tái sinh thành công cây đậu tương biến đổi gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens bằng cách sử dụng nốt lá mầm làm mô đích [35] Các

nghiên cứu ban đầu cho thấy chỉ có một giống đậu tương thích hợp để lây nhiễm với

Agrobacterium và có sẵn hệ thống tái sinh [28], [35], [42] Tuy nhiên, các nghiên cứu

gần đây đã khắc phục được các hạn chế đó [29], [56]

Các nhà nghiên cứu đã xây dựng thành công phương pháp chuyển gen đậu tương

và có thể lặp lại được bằng cách sử dụng các mảnh nốt lá mầm từ các cây con và các

hạt trưởng thành cho chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium [33] Vùng nốt lá

mầm có chứa vùng mô phân sinh nách lá nằm giữa lá mầm và trụ dưới lá mầm Mô phân sinh nách lá sẽ biệt hóa và tái sinh thông qua hình thành nhiều chồi bất định khi nuôi cấy trên môi trường chứa cytokinin và benzylaminopurine Mức độ hình thành chồi phụ thuộc vào kiểu gen của mẫu nuôi cấy, hầu hết đều có thể hình thành chồi bất định ở vùng nốt lá mầm Kỹ thuật gây tổn thương nốt lá mầm bằng dao phẫu thuật đòi hỏi phải người làm phải có kĩ năng để chuẩn bị mẫu cho lây nhiễm với vi khuẩn [60] Ngược lại, kỹ thuật tạo vết cắt trên nốt lá mầm đậu tương bằng cách sử dụng dao cấy thép không gỉ để rạch là phương pháp dễ sử dụng, tạo vết cắt đồng đều, không đòi hỏi

kĩ năng của người làm thí nghiệm [54] Thêm vào đó, các tác nhân khử như L-cysteine trong môi trường đồng nuôi cấy lỏng làm tăng đáng kể hiệu quả chuyển gen vào các tế bào nốt lá mầm [40], [41] và tạo ra các cây chuyển gen hữu thụ [42] Kết hợp sử dụng tác nhân khử và vector nhị thể, acetosyringone sẽ làm tăng hiệu quả chuyển gen [27], [50] Cây đậu tương chuyển gen đầu tiên được tạo ra sử dụng gen nptII kháng lại kanamycine là gen chỉ thị chọn lọc [35] Hiện nay, các mẫu chuyển gen đậu tương

thường được chọn lọc bằng gen bar và thuốc trừ cỏ phosphinothricin (glufosinate)

[58], [60] Nồng độ của tác nhân chọn lọc có ảnh hưởng đáng kể tới tần suất chuyển gen [58], vì thế với mỗi giống đậu tương khác nhau có nồng độ chọn lọc phù hợp Tần

số chuyển gen thu được từ 0,2% đến 10% [42], [46], [57], cho thấy hiệu quả chuyển gen còn phụ thuộc vào kĩ năng của người thực hiện thí nghiệm và phụ thuộc giống đậu tương Tiếp đến, nhiều nhóm tác giả ở các phòng thí nghiệm khác nhau trên thế giới

tiến hành ứng dụng, nghiên cứu cải tiến phương pháp nhằm nâng cao hiệu quả biến nạp gen [39], [41] Christianson và cs, 1983 lần đầu tiên công bố kết quả tái sinh thông qua phôi vô tính [25] Sau đó, một số tác giả đã cải tiến và tối ưu môi trường, xây dựng phương pháp tái sinh thông qua phôi vô tính ở giai đoạn quả non [33] , [52] Nhược điểm của cả hai phương pháp trên là tiêu tốn nhiều thời gian, hiệu quả biến nạp gen chỉ đạt từ 0,3 - 2,8% Vì những nhược điểm này, một số nhà khoa học tiến hành thử nghiệm, tìm kiếm phương pháp mang lại hiệu quả cao hơn như chuyển gen qua trụ dưới lá mầm (hypocotyls) [21], [34], phương pháp nửa hạt [46], và các lá mầm hợp tử chưa trưởng thành [55] Tuy nhiên, các phương pháp này cũng không mang lại hiệu quả, mặt khác ít được ứng dụng Paz và cs (2005) đã tiến hành cải tiến phương pháp nốt lá mầm không qua giai đoạn nuôi cấy nảy mầm trước khi lây nhiễm với vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens Phương pháp này có ưu điểm hơn các phương pháp trước

đó là thời gian được rút ngắn, hiệu quả biến nạp nâng cao (3,8%) [45] Cho tới nay, kết quả công bố về hiệu quả của phương pháp này vẫn cao hơn các phương pháp khác

Ở nước ta, việc ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo giống cây trồng đã được triển khai nghiên cứu một cách đầy đủ từ khá lâu Nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương đã được tiến hành thành công ở nhiều trung tâm, Viện nghiên cứu như: Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Viện Công nghệ Sinh học Tuy nhiên, nghiên cứu chuyển gen kháng sâu, kháng hạn đã và đang được triển khai tại Viện Di truyền Nông nghiệp [12] [13] và Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long [16],[17] Ngoài ra, Viện Công nghệ Sinh học cũng đã thực hiện các nghiên cứu cấp

cơ sở: Nghiên cứu và hoàn thiện kỹ thuật biến nạp gen ở đậu tương (2005 - 2006); phát triển hệ thống tái sinh in vitro ở đậu tượng phục vụ cho biến nạp gen của Nguyễn Thị Thúy Hường [11] Tuy nhiên, khả năng ứng dụng triển khai để tạo cây đậu tương biến đổi gen ở Việt Nam vẫn còn hạn chế, do có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen, trong đó kiểu gen có vai trò rất quan trọng

Như vậy, việc cải tiến các nhân tố làm tăng hiệu quả biến nạp của quá trình chuyển gen vào cây trồng là vấn đề quan trọng, đặc biệt trong điều kiện khí hậu biến đổi, bệnh dịch hoành hành thì nhu cầu về các cây trồng biến đổi gen có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi và an toàn với môi trường lại càng cấp thiết hơn

1.6 Các nghiên cứu về ứng dụng hạt nano trong nông nghiệp tại Việt Nam

Một số nghiên cứu về ứng dụng của các hạt nano trong nông nghiêp đã được tiến hành ở nước ta Trước hết phải kể đến các nghiên cứu ứng dụng trong sinh học và

y học như sử dụng làm phương pháp chuẩn đoán: Sử dụng các hạt nano để đánh dấu các phân tử sinh học, vi sinh vật, phát hiện chuỗi gen nhờ vào cơ chế bắt cặp bổ xung của DNA hoặc cơ chế bắt cặp kháng nguyên - kháng thể; vận chuyển thuốc: Cung cấp cho từng tế bào cụ tể bằng cách sử dụng các hạt nano nhằm tiết kiệm thuốc và tránh tác dụng phụ; mô kỹ thuật: Công nghệ nano có thế giúp cơ thể tái sản xuất hoặc sửa chữa các mô bị hư hỏng bằng cách sử dụng “giàn” dựa trên vật liệu nano và các yếu tố tăng trưởng Ứng dụng nano trong đóng gói, bao bì thực phẩm: Sử dụng các hạt nano làm các túi có chứa hạt nano bạc khử được vi khuẩn nhờ đó giữ được thực phẩm lâu hơn 3 - 4 lần so với loại túi ni lông thông thường Trong lĩnh vực nông nghiệp ứng dụng của hạt nano đã được một số tác giả đã xử lý hạt giống bằng nước có hạt nano,

sử dụng làm phân bón trong nông nghiệp đã nhận được kết quả khả quan Các kết quả nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh sản phẩm nano có khả năng kích thích sinh trưởng và phát triển của cây trong giai đoạn nảy mầm, giúp tăng năng suất cây trồng, giảm thiểu phân bón sử dụng, phòng trừ dịch bệnh từ đất và tăng sức chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường đối với hạt nảy mầm; công nghệ chế tạo và sử dụng vật liệu để bọc hạt giống nhằm tăng thời gian bảo quản, chống nấm trong đất trồng và cung cấp dinh dưỡng cho cây mọc mầm Vật liệu này bao gồm phân bón vi lượng, trung lượng, nano Ag và một số vi sinh vật có lợi cho cây trồng (Viện Công nghệ Môi trường) Đậu tương được xử lý nước có hạt nano có tỷ lệ nảy mầm cao hơn đối chứng PGS.TS Ngô Quốc Bưu, Viện Công nghệ Môi trường đã theo đuổi đề tài xử lý hạt nano kim loại Cu, Co và Fe cho hạt đậu tương trước khi gieo trồng (liều lượng nano

100 mg/70 kg hạt) khẳng định nano đã làm tăng tỷ lệ nảy mầm, tăng số lượng diệp lục

và tăng năng suất đậu tương Nhóm các nhà khoa học gồm Churilov, Ngô Quốc Bưu và Nguyễn Hoài Châu đã cho thấy, ngô gieo từ hạt được xử lý nano, có chiều dài mầm, khối lượng rễ, diện tích lá, hàm lượng chất béo, protein, cellulose và khối lượng chất khô đều cao hơn so với đối chứng Việc sử dụng hạt nano kim loại vào trong môi

trường nuôi cấy in-vitro trên cây cúc được Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2015) thực

hiện cho kết quả đối với hạt nano kim loại sắt khi sử dụng đơn lẻ gây ra hiện tượng vàng lá trên chồi cúc và giúp cho rễ cúc dài nhỏ, tạo nhiều rễ phụ hơn [4] Đối với kim

loại nano đơn lẻ bạc trong môi trường nuôi cấy thủy canh cho thấy gia tăng sự tăng trưởng của cây cúc cũng như có vai trò trong việc giảm hàm lượng một số loại vi sinh vật sau 2 tuần nuôi cấy và khi chuyển ra đất cây ở nồng độ nano bạc tốt hơn so với các

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu

Vật liệu thực vật

- Thí nghiệm sử dụng giống đậu tương ĐT22 được cung cấp bởi trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo từ dòng đột biến của lai (DT95 x ĐT12), được trồng cách ly và chăm sóc tại trung tâm thực nghiệm Văn Giang và phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp

- Chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA101 thuộc phòng Thí nghiệm trọng điểm

Công nghệ Tế bào Thực vật được sử dụng làm vector chuyển nạp plasmis pZY101

chứa gen bar (là gen kháng thuốc diệt cỏ Phosphinothricin (glufosinate) kháng thuốc

diệt cỏ vào tế bào thực vật

Hình 2.1: Sơ đồ cấu trúc vector pZY101

Vật liệu hạt nano

Các hạt nano kim loại bạc, coban, đồng, sắt (Ag, Co, Cu, Fe) do Viện Công nghệ Môi trường cung cấp có kích thước lần lượt là: Dung dịch nano bạc có kích thước trung bình ≤ 20 nm được thiết lập theo tỷ lệ: [AgNO3]: 750 – 1000 ppm, [β-chitozan]: 250 – 300 ppm, [NaBH4]: 200 ppm, tỷ lệ mol [NaBH4]/[AgNO3]: ¼ và với tốc độ nhỏ giọt của NaBH4 là 10 – 12 giọt/ phút [19] Nồng độ của dung dịch nano bạc

là 500 ppm, được sử dụng với nồng độ 0,01 mM trong môi trường nuôi cấy Hạt nano coban (Co) có kích thước: 20 – 40 nm với nồng độ sử trong môi trường nuôi cấy là 0,1M Hạt nano đồng với kích thước 20 – 40 nm được sử dụng với nồng độ 0,1M trong môi trường nuôi cấy Hạt kim loại sắt với kích thước là 40 – 60 nm và được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,5M Các hạt nano được siêu âm phân tán để làm stock thay thế cho các kim loại Ag, Co, Fe, Cu ở dạng muối trong môi trường biến nạp đậu tương

2.2.2 Hóa chất và môi trường

Hóa chất

Các loại hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm nuôi cấy mô: Natri hypoclorit (NaClO, Merk); Acetosyringone (AS, Sigma); Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D, sigma); Indoleacetic (IAA, sigma); Indole-3-butyric acid (IBA, sigma); 6–benzylaminopurine (BAP, sigma); Glufosinate (sigma), Cefotamine (India), Streptinomycin (sigma), Spectinomycin (sigma)

Các hạt nano kim loại Ag, Co, Cu, Fe được siêu âm phân tán làm stock cho môi trường chuyển gen

Các loại hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm phân tích cây sau chuyển gen: thuốc diệt cỏ basta (có chứa 24,5 % ammonium glufosinate trong thành phần), Natri

clorua (NaCl, Meck), Ethylene Diamine Tetra Acetic (EDTA, Meck), Tris – HCl, mecaptonethanol, chloroform (Sigma), phenylanine, phenol, isoamyl alcohol, ethanol, bột agarose, bộ kit tinh sạch ADN Quick gel extraction, bộ kit DIG – High Prime ADN labeling

2-Môi trường

Các loại môi trường sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật bao gồm: Môi trường nảy mầm (GM), môi trường đồng nuôi cấy (CCM), môi trường kích thích tạo chồi (SIM), môi trường kéo dài chồi (SEM), môi trường ra rễ (RM)

Môi trường sử dụng nuôi khuẩn trong thí nghiệm: YEP đặc và YEP lỏng

Thành phần và hàm lượng các chất trong môi trường đã sử dụng trong thí nghiệm được trình bày trong phần phụ lục

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: Tủ cấy vô trùng AC2-6S1 (ESCo Biotech), tủ nuôi + máy lắc nuôi

khuẩn JSSI-300GC (JSR), máy đo OD genesys 20 (Thermo scientific), máy ly tâm Centrifuge 5415R (Effendorf), máy đo nanodrop 2000 (Thermo scientific), máy PCR TC-512 (Techine), tủ lạnh các loại: 4oC (Sanaky), -20oC và -80oC (Panasonic), bể ổn nhiệt (Thermo Haake), máy làm khô Concentrator 5301 (Effpendorf), bể điện di (Bio- Rad)

Dụng cụ: Chày, cối sứ; ống eppendorf các loại: 2 ml, 1.5 ml và 0.5 ml,

pipetman, đầu côn, lưỡi dao các loại sử dụng trong nuôi cấy mô

2.2.4 Trình tự mồi và enzyme cắt giới hạn sử dụng trong nghiên cứu

Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu được thiết kế tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp Các thông số về cặp mồi được trình bày như trên bảng 2.1:

Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm

gắn mồi

Kích thước

57oC 428 bp

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano lên quá trình chuyển gen

vào đậu tương ĐT22 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được thiết kế

như sau:

Phương pháp tạo vật liệu vô trùng và phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương được tiến hành theo quy trình của Olhofl , 2003 [42] và Zeng, 2004 [57] có cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

Quy trình

Bước 1: Chuẩn bị mẫu đậu tương cho biến nạp

- Khử trùng hạt: Hạt đậu tương được nhặt sạch và đặt trong đĩa petri 15x100 mm thành một lớp đơn Mở nắp đĩa và đưa vào hộp hút khô có chứa ca thủy tinh đựng hỗn hợp 100ml Clorox + 4ml HCl đặc Hộp hút khô được đóng kín và hạt giữ trong vòng 16 h để khử trùng Sau 16 h, đóng nắp đĩa, lấy ra ngoài

- Nảy mầm hạt: Hạt đậu tương sau khi khử trùng được cấy trên đĩa môi trường GM Gói đĩa chứa hạt thành từng chồng 5 đĩa Các chồng hạt được nuôi trong phòng nuôi cấy trong điều kiện: nhiệt độ 24oC, 18 giờ sáng, 6 giờ tối trong 1 ngày đêm (24 giờ), với cường độ ánh sáng 100-150 W/giờ trong 5 ngày

Bước 2: Chuẩn bị khuẩn biến nạp

Chủng khuẩn A.tumefaciens – EHA101 chứa vector pZY101Asc – mang gen Bar

kháng chất chọn lọc glufosinate – được lưu giữ trong tủ -80oC

Nuôi phục hồi vi khuẩn trước khi sử dụng khuẩn cho biến nạp thực vật, khuẩn được nuôi phục hồi trên môi trường YEP đặc (10g Bacto-peptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 12g agar) có bổ sung 3 loại kháng sinh chọn lọc vi khuẩn: 50mg/ml Spectomycin, 50mg/ml Streptomycin, 25mg/ml Rifamycin ở tủ nuôi cấy 28oC trong 2 ngày Sau 2 ngày, chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ và lớn nhất và nuôi lắc trong 5ml môi trường YEP lỏng được bổ sung 3 loại kháng sinh chọn lọc (50mg/ml Spectomycin, 50mg/ml Streptomycin, 25mg/ml Rifamycin) được nuôi lắc trong 8 giờ Sau 8 giờ dịch khuẩn thu được được chuyển sang bình chứa 150ml YEP lỏng Tiếp tục nuôi lắc khuẩn 16 giờ ở 28oC , vận tốc lắc là 250 v/p

Tiến hành đo nồng độ khuẩn: Sử dụng máy đo OD ở bước sóng 650 nm để kiểm tra mật độ tế bào có mặt trong dịch khuẩn nuôi cấy OD650 khuẩn đạt giá trị nằm trong khoảng 1,0 – 1,2 được sử dụng để lây nhiễm cho thực vật Ly tâm dịch khuẩn để thu cặn khuẩn ở 3500 v/p, 10 phút ở nhiệt độ phòng Hòa tan lại cặn khuẩn sử dụng dung dịch CCM lỏng sao cho OD650 sau khi hòa tan đạt giá trị 0,6 Dung dịch CCM lỏng có giá trị OD650 đạt 0,6 được sử dụng gọi là dung dịch đồng nuôi cấy

Bước 3: Đồng nuôi cấy (CCM)

Nảy mầm hạt sau 5 ngày, loại bỏ phần trụ dưới lá mầm, tách đôi hai lá mầm ( ½ lá mầm sau đây sẽ được gọi là mẫu nuôi cấy) bằng dao nuôi cấy sao cho mỗi lá mầm chứa ½ chồi đỉnh Loại bỏ chồi đỉnh trên mẫu nuôi cấy, gây tổn thương mẫu nuôi cấy tại vị trí nốt lá mầm khoảng 5 – 7 đường, mỗi đường sâu khoảng 0,5mm và dài khoảng 3 – 4 mm Mẫu nuôi cấy đã gây tổn thương được ngâm trong dung dịch đồng

nuôi cấy khoảng 30 phút để lây nhiễm với vi khuẩn A.tumefaciens Chuyển mẫu nuôi

cấy sang môi trường đồng nuôi cấy (môi trường CCM đặc) Nuôi mẫu trên môi trường CCM đặc trong 5 ngày ở điều kiện nhiệt độ 24oC, điều kiện ánh sáng: 18h sáng và 6h tối, cường độ ánh sáng 100 – 150W/h

Bước 4: Kích thích ra chồi (SIM)

Sau 5 ngày đồng nuôi cấy trên môi trường CCM đặc, loại bỏ khuẩn bám trên bề mặt mẫu nuôi cấy bằng môi trường SIM lỏng trước khi chuyển sang môi trường SIM đặc Giữ mẫu nuôi cấy trong môi trường SIM đặc trong 14 ngày nhằm kích thích vị trí gây tổn thương tạo cụm đa chồi Chuyển mẫu nuôi cấy đã phát sinh được cụm đa chồi sang môi trường SIM đặc có chứa chất chọn lọc thực vật glufosinate nồng độ 10 mg/l, nuôi mẫu nuôi cấy trong 14 ngày

Tại bước này mẫu được chia đều cho các môi trường có các hạt nano Ag, Co, Fe,

Cu thay thế có các kim loại này ở dạng muối là hạt nano kim loại đơn lẻ hoặc hạt nano kết hợp đôi và công thức đối chứng Mẫu được chuyển trên môi trường có hạt nano tiếp theo cho tới khi thu được cây chuyển gen ra đất

Bước 5: Kéo dài chồi (SEM)

Những mẫu nuôi cấy sống sót qua chọn lọc được loại bỏ những chồi chết trên cụm chồi đồng thời được cắt loại bỏ phần trụ lá mầm Chuyển tiếp mẫu nuôi cấy sang môi trường SEM chứa chất chọn lọc glufosinate nồng độ 5mg/ml giảm ½ so với môi

trường SIM đặc Cứ sau 14 ngày tiến hành chuyển những mẫu sống sót xanh sang môi trường SEM mới Chú ý loại bỏ những chồi chết trong mỗi lần chuyển mẫu Mẫu được chuyển cho tới khi cụm đa chồi bật lên được chồi

Bước 6: Kích thích ra rễ (RM)

Những chồi dài 3 – 4 cm trong cụm đa chồi, được cắt khỏi cụm đa chồi để kích thích

ra rễ tái sinh cây hoàn chỉnh Chồi sau khi được cắt khỏi cụm đa chồi được ngâm khoảng 2 – 5 phút trong dung dịch IBA 1 mg/ml Chồi được nuôi trên môi trường RM cho tới khi chồi phát sinh rễ Chuyển cây con sau khi tái sinh hoàn chỉnh ( có thân, lá

và rễ đầy đủ) ra đất

2.3.2 Chọn lọc cây con ra đất bằng Basta

Với mục tiêu kiểm tra sự biểu hiện của gen bar ở các cây chuyển gen ngoài nhà

lưới Tùy thuộc vào sự thích ứng của cây con ngoài môi trường mà lựa chọn thời gian phun hợp lý: Phương pháp phun như sau:

- Chọn các cây chuyển gen đã ra đất 1-2 tuần, có khoảng 3-5 lá

- Phun dung dịch basta 100 mg/L ướt đều bề mặt lá non là chính

- Tính kháng (R- Resitance) hay nhạy cảm (không kháng) (S- Sensitivity) được đánh giá dựa trên khả năng chống chịu của lá với basta 100 mg/L sau 6 ngày phun và

2 lần lặp lại Cây có biểu hiện vàng héo rũ là biểu hiện của tình nhạy cảm, ngược lại nếu có tính kháng lá sẽ xanh tốt bình thường Những cây con sống sót sau phun basta, được tiếp tục chăm sóc làm vật liệu cho những phân tích đánh giá tiếp theo

2.3.3 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá

Quy trình tách chiết ADN được tiến hành theo quy trình tách chiết ADN của Doyle et al (1987) [30] được cải tiến cho phù hợp với điều kiện và hóa chất của phòng thí nghiệm

Bước 4: Ly tâm hỗn hợp dịch chiết mẫu lá V = 13000 v/p, t = 10 phút, ở 4oC Bước 5: Thu dịch nổi, chuyển sang ống eppendoft 2ml Bổ sung dung dịch 25 :

24 : 1 ( phenol : chloroform : isoamylalcohol ) vào ống chứa dịch chiết theo tỷ lệ 1 : 1 Lắc đều hỗn hợp và ly tâm ở 4oC, V = 13000 v/p, t = 10 phút

Bước 6: Thu dịch nổi chuyển sang ống eppendoft 2ml Bổ sung dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1) theo tỷ lệ 1 : 1 vào ống chứa dịch chiết Lắc đều hỗn hợp và ly tâm lạnh ở 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút

Bước 7: Thu dịch nổi chuyển sang ống eppendoft 1,5ml Bổ sung dung dịch isopropanol theo tỷ lệ 1 : 1 vào ống chứa dịch chiết Lắc nhẹ nhàng Giữ mẫu trong tủ -20oC trong vòng 2h Ly tâm ở 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút Loại bỏ dịch nổi, giữ lại tủa ADN

Bước 8: ADN được làm khô bằng cách mở nắp và để trong tủ hút trong vòng 2h Hòa tan lại ADN bằng hỗn hợp NaCl 1M + Rnase 1mg/ml, ủ hỗn hợp ở tủ 37oC, t =

30 phút

Bước 9: Bổ sung theo tỷ lệ 1 : 1 dung ethanol 100% vào hỗn hợp dung dịch (ADN + NaCl 1M + Rnase 1mg/ml), giữ hỗn hợp ở tủ -20oC trong vòng 1h

Bước 10: Ly tâm hỗn hợp ( ethanol 100% + ADN + NaCl 1M + Rnase 1mg/ml )

ở 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút nhằm thu lại tủa ADN

Bước 11: Rửa lại tủa ADN thu được ở bước 10 bằng dung dịch Ethanol 70%, ly tâm lạnh 4oC, V = 12000 v/p, t = 10 phút Lặp lại bước này 2 lần

Bước 12: Làm khô tủa ADN sử dụng máy hút chân không Hòa tan ADN bằng nước cất khử ion Bảo quản ADN trong tủ -20oC

Bước 13: Kiểm tra chất lượng ADN tách chiết được bằng máy đo nanodrop và bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%

2.4.4 Phương pháp nhân bản trình tự ADN bằng kỹ thuật PCR

Dung lượng hỗn hợp PCR cho mỗi mẫu là 10µl Phản ứng PCR được tiến hành trên máy chu trình nhiệt model PTC-100

Sau khi PCR kết thúc, 10µl dung dịch của mỗi ống phản ứng được điện di trên gel agarose 1% có bổ sung EtBr 0,05%, cùng với ADN marker (ADN chuẩn) Sau đó, sản phẩm PCR được kiểm tra dưới đèn UV, chụp ảnh và đánh giá

Bảng 2.2:Thành phần phản ứng PCR