nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano kim loại (coban, bạc, sắt và đồng) đến quá trình chuyển gen vào giống đậu tương việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - Nguyễn Trung Anh “Nghiên cứu ảnh hưởng hạt nano kim loại (coban, bạc, sắt đồng) đến trình chuyển gen vào giống đậu tương Việt Nam” LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Văn Đồng PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên Hà Nội – Năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Trung Anh LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Đồng, Giám đốc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp – người thầy kiên nhẫn hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực luận văn Tơi xin gửi tới PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên, Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm lời cảm ơn chân thành, người hỗ trợ giúp đỡ để hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc giúp đỡ nhiệt tình, ý kiến đóng góp q báu dẫn tận tình TS Hà Văn Chiến suốt q trình tơi thực hồn thành luận văn tập thể cán Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nơng Nghiệp nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện tốt để thực đề tài cách suôn sẻ thuận lợi Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Viện Di truyền Nông nghiệp Viện Công nghệ Môi trường hỗ trợ giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin gửi tới bố mẹ, anh chị, người thân bạn bè lời cảm ơn thân thương - người ln sát cánh, quan tâm dành cho tơi tình cảm chân thành suốt thời gian học tập hồn thành luận văn ln bên cạnh ủng hộ sống Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên cao học Nguyễn Trung Anh MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 11 1.1 Giới thiệu chung đậu tương 11 1.1.1 Nguồn gốc tình hình sản xuất đậu tương 11 1.1.2 Giá trị đậu tương người 14 1.1.3 Một số giống đậu tương Việt Nam 15 1.2 Hạt nano kim loại vai trò hạt kim loại lên trồng 17 1.2.1 Định nghĩa vật liệu hạt nano 17 1.2.2 Ảnh hưởng hạt kim loại nano tới trồng 17 1.3 Gen bar 20 1.4 Chọn tạo giống đậu tương phương pháp chuyển gen 21 1.5 Thực trạng nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương 23 1.6 Các nghiên cứu ứng dụng hạt nano nông nghiệp Việt Nam 25 CHƯƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 27 2.2 Vật liệu nghiên cứu 27 2.2.1 Vật liệu 27 2.2.2 Hóa chất mơi trường 28 2.2.3 Thiết bị dụng cụ 29 2.2.4 Trình tự mồi enzyme cắt giới hạn sử dụng nghiên cứu 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 30 2.3.2 Chọn lọc đất Basta 32 2.3.3 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu 32 2.4.4 Phương pháp nhân trình tự ADN kỹ thuật PCR 33 2.5 Các tiêu đánh giá 34 2.5 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng hạt nano đến trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT22 36 3.1.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng hạt nano đơn lẻ đến giai đoạn trình chuyển gen vào đậu tương ĐT22 A tumefaciens 36 3.1.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng hạt nano kết hợp đơi lên q trình chuyển gen vào đậu tương ĐT22 Agrobecterium tumefaciens 44 3.2 Phân tích hiệu tiếp nhận gen đậu tương ĐT22 tác động hạt nano đơn lẻ nano kết hợp đôi phương pháp PCR 52 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 4.1 Kết luận 56 4.2 Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 64 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tình hình sản xuất đậu tương quốc gia đứng đầu giới năm gần 12 Bảng 1.2: Sản lượng đậu tương Việt Nam năm gần 13 Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi sử dụng thí nghiệm .29 Bảng 2.2:Thành phần phản ứng PCR .33 Bảng 3.1: Ảnh hưởng hạt nano đơn lẻ đến khả phát sinh đa chồi đậu tương 36 Bảng 3.2: Ảnh hưởng loại hạt nano đơn lẻ giai đoạn sống sót sau chọn lọc đậu tương q trình chuyển gen 39 Bảng 3.3: Tỉ lệ sống sót sau phun basta 42 Bảng 3.4 Ảnh hưởng hạt nano kết hợp đôi tới việc tạo đa chổi chuyển gen vào đậu tương ĐT22 45 Bảng 3.5: Ảnh hưởng hạt nano kết hợp đơi đến khả sống sót sau chọn lọc đậu tương trình chuyển gen .47 Bảng 3.6: Tỉ lệ sống sót sau phun basta 50 Bảng 3.7: Kết phân tích PCR dòng đậu tương chuyển gen .53 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Ion bạc vơ hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy vi khuẩn 19 Hình 2.1: Sơ đồ cấu trúc vector pZY101 28 Hình 3.1: Khả phát sinh đa chồi đậu tương cơng thức thí nghiệm 37 Hình 3.2: Khả đa chồi sống sót mơi trường chọn lọc đậu tương công thức thí nghiệm 40 Hình 3.3: Các chồi đậu tương kéo dài môi trường SEM 41 Hình 3.4: Cây đậu tuơng chuyển gen môi trường rễ RM 42 Hình 3.5: Cây đậu tuơng chuyển gen đối chứng trước phun sau ngày phun Basta nồng độ 100 mg/l 43 Hình 3.6: Ảnh hưởng hạt nano kim loại đơn lẻ (Ag, Co, Fe, Cu) trình chuyển gen 44 Hình 3.7: Khả phát sinh đa chồi đậu tương cơng thức thí nghiệm sau 14 ngày mơi trường kích thích chồi 46 Hình 3.8: Khả đa chồi sống sót mơi trường chọn lọc đậu tương cơng thức thí nghiệm 48 Hình 3.9: Các chồi đậu tương môi trường kéo dài môi trường rễ 49 Hình 3.10: Cây đậu tuơng chuyển gen đối chứng trước phun sau ngày phun Basta nồng độ 100 mg/l 50 Hình 3.11: Ảnh hưởng hạt nano kim loại đơn lẻ (Ag, Co, Fe, Cu) trình chuyển gen 51 Hình 3.12: Kết tách chiết DNA tổng số dòng đậu tương chuyển gen To 52 Hình 3.13: Kết PCR kiểm tra có mặt gen bar đậu tương chuyển gen T0 53 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ADN Axit deoxyribonucleic AS Acetosyringone BAP – benzylaminopurine Bar Gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase BGĐ Biến đổi gen Bp Base pair CCM Cocultivation medium – môi trường đồng nuôi cấy Cs Cộng dNTP Deoxynucleoside triphosphate ĐT22 Giống đậu tương ĐT22 ĐT26 Giống đậu tương ĐT26 DT84 Giống đậu tương DT84 ĐVN9 Giống đậu tương ĐVN9 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic GA3 Gibberelic acid GM Germination medium – môi trường nảy mầm hạt IBA Indole-3-butyric acid Kb Kilo base OD Optical density PCR Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi polymerase RM Rooting medium – môi trường rễ SDS Sodium dodecysulfat SEM Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi SIM Shoot induction medium – môi trường tạo đa chồi T0 Cây chuyển gen TAE Tris – acetate – EDTA v/p vòng/phút YEP Yeast extract peptone GSO Tổng cục Thống kê Việt Nam MỞ ĐẦU Đậu tương (Glycine max L Merr) hay gọi đỗ tương, trồng có giá trị dinh dưỡng cao nhà khoa học xếp vào “thực phẩm chức năng” [2] đóng vai trò thiết yếu để nâng cao tiêu chuẩn thực phẩm cho người nước phát triển tình trạng thiếu hụt protein [26] Lượng dầu đậu tương đứng vị trí thứ tổng số dầu thực vật tiêu thụ giới (http://worldvegetableoil) Đây loại trồng có tác dụng việc luân xen canh, cải tạo đất hiệu Ngày nay, công nghệ nano triển khai nghiên cứu rộng rãi phạm vi toàn cầu, nhiều lĩnh vực khác bước đầu tạo sản phẩm ứng dụng đời sống nguời, đặc biệt lĩnh vực nông nghiệp Một số nghiên cứu ứng dụng hạt nano để xử lý hạt giống nhằm cải thiện tốc độ nảy mầm sinh trưởng, chất lượng suất thu hoạch nông sản [20] Công nghệ nano ứng dụng phân bón bao gồm nguyên tố vi lượng cần thiết giai đoạn phát triển trồng Việc sử dụng công cụ hỗ trợ cảm biến, cơng nghệ nano phát chẩn đoán nhanh chứng bệnh vi sinh vật gây cho trồng Trong nghiên cứu ứng dụng hạt nano nông nghiệp, phương pháp sử dụng nhiều xử lý hạt giống trồng với hạt nano trước trồng Năm 2010, Roghayyeh cộng nghiên cứu thấy hạt nano sắt (Fe) có ảnh hưởng lên đặc điểm sinh học đậu tương [49] Ngoài ra, hạt nano sắt (Fe), coban (Co) đồng (Cu) cho hiệu lớn xử lý hạt giống trồng, có họ đậu Hiện nay, việc tạo trồng biến đổi gen kỹ thuật chuyển gen để ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao suất trồng (trong có đậu tương) đem lại lợi ích cho nơng nghiệp vô quan trọng Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen vào giống đậu tương ĐT22 trồng phổ biến Việt Nam đạt 1% [13] Ở quy trình chuyển gen vào đậu tương phương pháp tạo cụm chổi thông qua nuôi cấy in vitro nốt mầm vài giống đậu tương mơ hình (William Mark, Thom ) triển khai số phòng thí nghiệm, bước đầu cho kết Tuy nhiên giống đậu tương mơ hình (William, Mark, Thom ) khó trồng phổ biến mùa vụ Việt Nam, đặc biêt tỉnh thuộc miền Bắc Việt Đối chứng 750 5 0,67 Hạt nano Ag 750 12 12 1,60 Hạt nano Co 750 6 0,80 Hạt nano Fe 750 0 0,00 Hạt nano Cu 750 8 1,06 Tổng số 3750 31 31 Thí nghiệm hạt nano kết hợp đơi Đối chứng 623 3 0,482 Hạt nano 623 7 1,12 623 6 0,96 623 8 1,28 2492 24 24 Ag.Co Hạt nano Ag.Cu Hạt nano Cu.Co Tổng số Từ bảng 3.9 cho thấy: * Đối với thí nghiệm hạt nano đơn lẻ: Kết phân tích PCR cho thấy, sống sót sau phun thuốc trừ cỏ Basta cho kết PCR dương tính với gen bar với kích thước băng DNA chuyển gen thu với plasmid kích thước 428 bp Trong công thức hạt nano đơn lẻ, hiệu chuyển gen thu cao hạt nano Ag đạt 1,60% thấp công thức đối chứng 0,67% 54 * Đối với thí nghiệm thí nghiệm hạt nano kết hợp đơi: Kết phân tích PCR dòng đậu tương chuyển gen cho thấy, tổng số 24 mẫu DNA chuyển gen sống sót sau phun thuốc trừ cỏ Basta, tồn mẫu cho kết dương tính với gen bar với kích thước băng DNA thu 428 bp, phù hợp với kích thước lý thuyết đoạn DNA nằm gen bar Trong cơng thức thí nghiệm hạt nano kết hợp đơi cơng thức hạt nano kết hợp Cu.Co cho tần số chuyển gen cao so với công thức đối chứng đạt 1,28%, công thức đối chứng tần số chuyển gen đạt 0,482% Kết luận: Hiệu chuyển gen vào đậu tương ĐT22 tác động hạt nano đơn lẻ hạt nano kết hợp đơi cho thấy hạt nano có làm tăng hiệu quy trình chuyển gen Cụ thể là: Thí nghiệm chuyển gen đậu tương ĐT22 cơng thức thí nghiệm hạt nano đơn lẻ thích hợp để tăng hiệu suất quy trình chuyển gen hạt nano bạc Thí nghiệm hạt nano kết hợp đơi cho thấy cơng thức thí nghiệm với hạt nano kết hợp Cu.Co cho hiệu 55 suất chuyển gen cao CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Trên sở kết nghiên cứu đạt được, đề tài xin đưa số kết luận sau: Nano đơn lẻ: Các hạt nano kim loại đơn lẻ Ag (20 – 30 nm) , Co (20 – 40 nm), Cu (20 – 40 nm) với nồng độ sử dụng 0,1M có ảnh hưởng tốt đến quy trình chuyển gen vào đậu tương ĐT22 Việt Nam Hạt nano Fe (40 – 60 nm) nồng độ 0,5M cho hiệu suất chuyển gen thấp Nano kim loại kết hợp đôi: Các hạt nano kết hợp đôi (Ag (20 - 30nm) , Co (2040nm), Cu (20-40nm) với nồng độ sử dụng 0,1M) ảnh hưởng lớn tới quy trình chuyển gen giai đoạn chọn lọc Trong đó, cơng thức kết hợp đơi Cu.Co cho hiệu suất quy trình chuyển gen cao Lần đầu tiên, chứng minh hạt nano kim loại đơn lẻ ((Ag (20 - 30nm) , Co (20-40nm), Cu (20-40nm) với nồng độ sử dụng 0,1M) ) làm tăng hiệu suất quy trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT22 Hạt nano Fe (40 – 60nm) nồng độ 0,5M cho hiệu suất chuyển gen thấp 4.2 Kiến nghị Trên sở kết thu được, hướng nghiên cứu cần triển khai nhằm góp phần tối ưu hóa hệ thống chuyển gen đưa ứng dụng: Khảo sát di truyền tính đa hình kiểu gen phương pháp lai Southern Blot qua hệ Trồng đánh giá chuyển gen có hạt nano đối chứng ngồi nhà lưới qua hệ Mở rộng phạm vi nghiên cứu đối tượng trồng khác 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng viêt Đặng Diệp Yến Nga, Phạm Thị Kim Trọng (2016), “Đánh giá ảnh hưởng vi sinh vật hệ rễ lên khả hấp thu đồng (Cu) đất cỏ đậu” Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Đỗ Thị Hoa Viên, Phan Quốc Kinh, (2005) “Nghiên cứu nâng cao hàm lượng isoflavone protein đậu tương cô đặc” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ (5), 41-46 Đỗ Thị Như Quỳnh (2015) “Nghiên cứu khả tiếp nhận gen GmGLP1 vào đậu tương (Glycine max) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Việt Cường, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Đỗ Mạnh Cường, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Hồi Châu, Ngơ Quốc Bưu (2015) “Nghiên cứu sinh trưởng phát triển cúc (Chrysanthemum sp.) invitro mơi trường có sử dụng nano sắt” Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 13, số 7: 1162-1172 Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Vũ Quốc Luận, Vũ Thị Hiền, Trương Thị Bích Phượng, Dương Tấn Nhựt (2016) “Tác động nano bạc lên khả tăng trưởng cúc hệ thống vi thủy canh” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(3) Ngô Thế Dân cộng (1999), Cây Đậu tương NXB Nông Nghiệp Hà Nội Ngô Võ Kế Thành, Nguyễn Thị Phương Phong, Đặng Mậu Chiến (2009) “Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn vải cotton ngân dung dịch keo nano bạc” Tạp chí phát triển KH&CN: tập 12, số Nguyễn Ngọc Ánh, Dương Thị Bích Huệ (2007) Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Tạp chí phát triển KH & CN tập 10, số 01 ,trang 42 57 Nguyễn Ngọc Hùng (2011), Trường đại học Công Nghệ Đại học Quốc gia Hà Nội 10 Nguyễn Thị Hiền, Vũ Thy Thư (2004), Hóa Sinh học NXB Đại học Sư phạm Hà Nội 458t 11 Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), “Phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam” Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Thái Nguyên 12 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo (2013), “Nghiên cứu biến nạp gen liên quan đến khả kháng hạn thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22” Tạp chí Khoa học cơng nghệ 11:3-9 13 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Mai Hương, Nguyễn Hữu Kiên (2012), “Nghiên cứu quy trình biến nạp gen vào giống đậu tương ĐT22 thơng qua Agrobacterium tumefaciens” Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, (39):119-124 14 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Lê Thị Mai Hương, Nguyễn Trung Anh (2017), “Nghiên cứu chuyển gen GmNac vào giống đậu tương ĐT22 thơng qua Agrobacterium”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 3(76): 13-17 15 Tổng cục Thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, số liệu dự báo của USDA 16 Trần Thị Cúc Hòa (2007) “Nghiên cứu khả đáp ứng chuyển nạp gen giống đậu tương trồng Việt Nam” Tạp chí Nơng nghiệp & phát triển nơng thơn 18: 9-14 17 Trần Thị Cúc Hòa (2008) “Hiệu tạo dòng đậu tương biến đổi gen từ giống MTĐ 176, HL 202, Maverick William 82 phương pháp nốt mầm qua trung gian Agrobacterium tumefaciens” Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nơng thơn 1: 14-19 58 18 Trần Văn Điền (2007), Giáo trình đậu tương Nhà Xuất Bản Nơng Nghiệp Hà Nội Tài liệu tiếng anh 19 Abdi G, S H.-k (2008), “Nano silver: Anovel nanomaterial for removal of bacterial contamination in Valerian (V.officinalis) tissue culture” Acta Physiol Plant 30: 709 20 Anh Son Hoang, Que Chi Tran, Phuc Son Le, The Chan Do, Toan Nguyen Thi, Quoc Trung (2014) “Preparation and study effects of nano crystal copper (Cu 0) on the growth, crop yield of Vietnamese maize species” Proccedings of th International workshop on Advanced Materials Science and Technology, 297-303 21 Aragaxo FJL, S L (2000), “Selection of transgenic meristematic cells utilizing a herbicidal molecule results in the recovery of fertile transgenic soybean Glycine max L Merrill plant at a high frequency” Theor Appl Genet 101: 1-6 22 Calla B., B.-B L (2014), “Genomic evaluation of oxalate-degrading transgenic soybean in response to Sclerotinia sclerotiorum infection” Mol Plant Pathol, 15: 563–575 23 Catarious D., E R (2009), “Impactos de cambio climatico en la seguridad nacional y regional de Colombia, Alexandria, US, CAN” 24 Chien Van Ha, Y W.-S (2015), “Comparative analysis of root transcriptomes from two contrasting drought-responsive Williams 82 and DT2008 soybean cultivars under normal and dehydration conditions” Front Plant Sci, 6: 551 25 Christianson ML., W D (1983) “A morphogenetically compentent soybean supension culture” Science 222, 632-634 26 Chaudhary D B (1985), “Studies on combining ability in soybean”, Crop Inprovemet, 12: 151 -154: 59 27 Dang W., W Z (2007), “An optimized Agrobacterium-mediated transformation for soybean for expression of binary insect resistance genes” Plant Sci, 173: 381–389 28 Delzer BW, S D (1990), “Agrobacterium tumefacienssusceptibility and plant regeneration of 10 soybean genotypes in maturity groups 00 to II” Crop Sci, 30:320–322 29 Dinkins RD, C G (2008), “Agrobacterium-mediated genetic transformation of soybean In: Kirti PD,Handbook of New Technologies for Genetic Improvement of Legumes, CRC Press” Florida, 89–102 30 Doyle J.L (1987), “A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissues”, Phytochemical Bulletin,19, pp 11-15 31 Eskandari H (2011), “The importance of iron (Fe) in plant products and mechanism of its uptake by plants” J Appl Environ Biol Sci., 1(10): 448 - 452 32 Finer JJ., N A (1988), “Development of an embryogenic suspention culture of soybean” Plant cell tissue Organ cult 15: 126-136 33 Gao H., N N (2005), “Two classes of highly similar coiled coil-nucleotide binding-leucine rich repeat genes isolated from the Rps1-k locus encode Phytophthora resistance in soybean” Mol Plant Microbe Interact 18: 1035-1045 34 Geliang W., Y X (2008), “Hypocotyl-based Agrobacterium-mediated transformation of soybean (Glycine max) and application for RNA interference” Plant Cell Rep 27: 1177-1184 35 Hinchee MA., C W (1988), “Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated gene transfer” Bio/Technology 6: 915-922 36 Lin J, M M (2013), “Overexpression of a soybean salicylic acid methytransferase gene confers resistance to soybean cyst nematode” Plant Biotechnol J 11(9): 11 60 37 Liu D., B S (2003) “Insect resistance conferred by 283-kDa photorhabdus luminescens protein” Nature Biotechnology 21(10): 1222-8 38 Lu G., H F (2008), “Compedium of Transgenic Crop Plants: Transgernic Oilseed Crops – Soybean” Blackwell Publishing Ltd – 65 39 Margie M Paz, H S.(2004) “Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant” Euphytica, 136: 167-169 40 Olhoft P M., L K (2001), “The role of thiol compounds in increasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary-node cells”.Plant Cell Reports, 20, 731-737 41 Olhoft P M., S D (2001),“L-Cysteine increases Agrobacterium-mediated TDNA delivery into soybean cotyledonary-nodes cells” Plant Cell Reports, 20(8), 706-711 42 Olhoft PM., F L (2003), “Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method” Plant 216: 723-735 43 Owens LD., C D (1985), “Genotypic variability of soybean response to Agrobacterium strains harboring the Ti or Ri plasmids” Plant Physiol, 77: 87–94 44 Quach TN., T L (2014), “Functional analysis of water stress-responsive soybean GmNAC003 and GmNAC004 transcription factors in lateral root development in Arabidopsis” PLoS One, Jan 23; 9(1): 84-886 45 Paz MM, M J (2005), “Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for effcient Agrobacterium-mediated soybean transformation” Plant Cell 8: 873886 46 Paz MM., H S ( 2004), “Assessment of condition affecting Agrobacteriummediated soybean transformation using the cotyledonary node explant” Retrieved from Euphytica, 136: 167-169 61 47 Racuciu M and Creanga D (2006) TMA-OH coated magnetic nanoparticles internalize in vegetal tissue Romanian J Phys., 52: 395 - 402 48 Rai, M K., Deshmukh, S., Gade, A K., & Abd-Elsalam, K A (2012), “Strategic Nanoparticle-Mediated Gene Transfer in Plants and Animals” Novel Approach Current Nanoscience 8, 170-179 49 Roghayyeh S., M S (2010), “Effects of Nano-Iron Oxide Particles on Agronomic Traits of Soybean” Not Sci Biol (2) 2010, 112-113 50 Sato H, Y T (2007), “Production of transgenic plants and their early seed set in Japanese soybean variety, Kariyutak” Plant Biotechnol, 24: 533– 536 51 Slater A., S N (2008), “Plant biotechnology: the genetic manipulation of plants Chaper 2: Plant tissue culture” Oxford University Press, p 41 52 Susumu H., H M (2007), “Evaluation of somatic embryogenesis from immature cotyledons Japanese soybean cultivars” Plant Biotechnology 24: 435-440 53 Trujillo-Reyesa J., Majumdara S., Botezc C.E., PeraltaVideaa J.R and GardeaTorresdeya J.L (2014) “Exposure studies of core-shell Fe/Fe3O4 and Cu/CuO NPs to lettuce (Lactuca sativa) plants: Are they a potential physiological and nutritional hazard” J Hazard Mater., 267: 255 263 54 Yamada T, W S (2010 ), “Cotyledonary node pre-wounding with a microbrush increased frequency of Agrobacteriummediated transformation in soybean” Plant Biotechnol; 27:217–220 55 Yan D., G Y ( 2009), “Effects of electromagnetic fields exposure on rapid micropropagation of beach plum” Ecological Engineering 35, 597601 62 56 Young JK., T I (2004), “Factors affecting soma embryogenesis from immature cotyledon of soybean” Journal of plant biotechnology 6, 45-50 57 Zeng (2004), “An improved Agrobacterium-mediated soybean transformation procedure” Improved from, Plant Cell Reports 22:478-482 58 Zeng P., Vadnais DA, Zhang Z, Polacco JC (2004), “Refined glufosinate selection in Agrobacterium-mediated transformation of soybean [Glycine max (L.) Merrill]” Plant Cell Rep, 22: 478–482 59 Zhang C., W S (2013), “Virus-induced gene silencing in soybean and common bean” Methods Mol Biol 975: 149-56 60 Zhang Z., X A (1999), “The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean” Plant Cell Tissue Organ Cult,; 56: 37–46 61 Zhu S., W D (2008), “Effects of defoliating insect resistance QTLs and a cry1Ac transgene in soybean near-isogenic lines” Theor Appl Genet 116(4): 455-63 Tài liệu trang web 62 http://www.vietrade.gov.vn 63 FAOTA (2016), ISAAA Briefs brief 52 Global Status of Commercialized Biotech/GMCrop,http://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/52/downl oad/isaaa-brief-52-2016.pdf 64 Báo cáo 2016 kết thực công tác triển khai kế hoạch năm 2017 lĩnh vực trồng trọt, Bộ Nông Nghiệp PTNT, www.omard.gov.vn 63 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần B5 major salt Nồng độ Hàm lượng 1000ml STT Thành phần KNO3 25 gam (NH4)2SO4 1,34 gam CaCl2.H2O MgSO4.7H2O 2,5 gam NaH2PO4.H2O 1,5 gam 10X 1,5 gam Chuẩn thể tích V=1000ml nước cất, giữ tủ -4⸰C Phụ lục 2: Thành phần B5 minor salt Nồng độ Hàm lượng 1000ml STT Thành phần H3BO3 0,3 gam MnSO4.H2O gam ZnSO4.7H2O 0,2 gam KI Na2MoO4.H2O 0,025 gam CuSO4.5H2O 0,0025 gam CoCl2.6H2O 0,0025 gam 100X 0,075 gam Chuẩn thể tích V=1000ml nước cất, giữ tủ -4⸰C Phụ lục 3: Thành phần MS major salt Nồng độ Hàm lượng 1000ml STT Thành phần NH4NO3 16,5 gam KNO3 19 gam CaCl2.H2O MgSO4.7H2O 3,7 gam KH2PO4.H2O 1,7 gam 10X 4,4 gam Chuẩn thể tích V=1000ml nước cất, giữ tủ -4⸰C 64 Phụ lục 4: Thành phần MS minor salt Nồng độ Hàm lượng 1000ml STT Thành phần H3BO3 0,62 gam MnSO4.7H2O 1,69 gam ZnSO4.7H2O 0,86 gam KI Na2MoO4.H2O 0,025 gam CuSO4.5H2O 0,0025 gam CoCl2.6H2O 0,0025 gam 100X 0,083 gam Chuẩn thể tích V=1000ml nước cất, giữ tủ -4⸰C Phụ lục 5: Thành phần B5 vitamins STT Thành phần Myo-inositol Nicotinic acid Pyridoxine Thiamine Nồng độ Hàm lượng 1000ml 10 gam 0,1 gam 100X 0,1 gam gam Mix đều, khử trùng màng lọc, giữ tủ -4⸰C Phụ lục 6: Thành phần Ion-EDTA Nồng độ Hàm lượng 1000ml STT Thành phần FeSO4.7H2O NaEDTA Mix đều, đun trở thành màu vàng đậm không 2,8 gam 100X 1,88 gam vượt 20p, giữ tủ -4⸰C Phụ lục 7: Thành phần môi trường GM STT Nồng độ Thành phần B5 major salt 10x 65 Hàm lượng lít 100 ml B5 minor salt 100x 10 ml Ferrous-NaEDTA 100x 10 ml Glucozo 2% 20 gam Bổ sung PhytagelTM B5 vitamin gam 500x 2ml Chuẩn pH = 5.8 với KOH 1M, khử trùng 20 phút Phụ lục 8: Thành phần môi trường YEP STT Hàm lượng cho lít Thành phần Bacto – pepton 10 gam Yeast – extract gam NaCl gam Agar (đối với môi trường đặc) 12 gam Chuẩn pH = với NaCl 1M, khử trùng 20 phút Phụ lục 9: Thành phần môi trường đồng nuôi cấy CCM STT Thành phần Nồng độ Hàm lượng lít B5 major salt 10X 10 ml B5 minor salt 100X ml Ferrous-NaEDTA 100X ml Glucozo 3% 30 gam MES 20mM 3,9 gam Acetosyringone 40 mg/ml ml B5 vitamin 500X ml GA3 mg/ml 0,25 ml BAP 16,7 mg/ml 0,1 ml 10 L-cysteine 25 mg/ml 16 ml 11 DTT 154 mg/ml ml 12 Na-thiosulfate 158 mg/ml ml 66 13 14 Agar washed 0,5% gam Chuẩn pH = 5,4 với KOH 5M, khử trùng 20 phút Phụ lục 10: Thành phần môi trường SIM STT Thành phần Nồng độ Hàm lượng lít B5 major salt 10X 100 ml B5 minor salt 100X 10 ml Ferrous-NaEDTA 100X 10 ml Glucozo 3% 30 gam MES mM 0,6 gam B5 vitamin 500X ml BAP 16,7 mg/ml 0,1 ml Cefotaxime 200 mg/ml ml Vancomycin mg/ml 10 ml 10 Glufosinate 10 mg/l ml 11 12 PhytagelTM gam Chuẩn pH = 5,7 dùng KOH 5M, khử trùng 20 phút Phụ lục 11: Thành phần môi trường SEM STT Thành phần Nồng độ Hàm lượng lít MS major salt 10X 100 ml MS minor salt 100X 10 ml Ferrous-NaEDTA 100X 10 ml Glucozo 3% 30 gam MES mM 0,6 gam B5 vitamin 500 X ml Asp/Glu 25 mg/ml ml IAA mg/ml 0,1 ml GA3 mg/ml 0,5 ml 10 Cefotaxime 20 mg/ml ml 67 11 Glufosinate 12 PhytagelTM 13 mg/l 0,3 ml gam Chuẩn pH = 5,7 dùng KOH 5M, khử trùng 20 phút Phụ lục 12: Thành phần môi trường RM STT Thành phần Nồng độ Hàm lượng lít MS major salt 10X 100 ml MS minor salt 100X 10 ml Ferrous-NaEDTA 100X 10 ml Glucozo 2% 20 gam MES mM 0,6 gam B5 vitamin 500X ml Asp/Glu 25 mg/ml ml Cefotaxime 200 mg/ml 0,5 ml Vancomycin mg/ml 10 ml 10 PhytagelTM 11 gam Chuẩn pH = 5,6 dùng KOH 1M, khử trùng 20 phút Phụ lục 13: Thành phần CTAB Nồng độ Hàm lượng 100ml STT Thành phần CTAB Tris-HCl 8,0 1M 10 ml NaCl 5M 14 ml EDTA 8,0 0,5 M ml BME (mecraptoethanol) 14 M 1,5 ml gam Chuẩn thể tích V=100ml nước cất, khử trùng 20 phút 68 ... tiễn nghiên cứu tiến hành, thực đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng hạt nano kim loại (coban, bạc, sắt đồng) đến trình chuyển gen vào giống đậu tương Việt Nam Với mong muốn phát triển tăng hiệu quy trình. .. chuyển gen vào giống đậu tương thương mại Việt Nam Mục tiêu đề tài Chuyển thành công gen thị kháng thuốc diệt cỏ (bar) vào giống đậu tương ĐT22 Việt Nam xác định ảnh hưởng hạt nano kim loại đến. .. cứu ảnh hưởng hạt nano đến trình chuyển gen vào giống đậu tương ĐT22 36 3.1.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng hạt nano đơn lẻ đến giai đoạn trình chuyển gen vào đậu tương ĐT22 A tumefaciens