TỔNG QUAN VỀ I.GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 1. Định nghĩa về sắc ký: là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều giữa pha động và pha tĩnh. 2. Phân loại Dựa trên tính chất pha động : Sắc ký lỏng (Liquid Chromatography ) Sắc kí khí (Gas Chromatography) Dựa trên phương pháp chạy sắc ký : Sắc ký lớp mỏng, Điện di - Dựa trên tính chất cột : Sắc ký pha thuận (Normal Phase Chromatography), Sắc kí pha đảo (Reversed Phase Chromatography) - Dựa trên cơ chế phân tách : Sắc ký hấp phụ (phổ biến), Sắc ký tương tác ion(ion exchange chromatography), Sắc ký rây phân tử (sắc ký gel) 1 III. THÀNH PHẦN PHA TĨNH CỦA SẮC KÝ GEL 1.Định nghĩa sắc ký gel (gel phrase chromatography) là một phương pháp sắc ký dùng để phân loại những mẫu cần phân tích dựa trên sự khác biệt về kich thước, kích cỡ của phân tử. 2. Đặc Điểm Pha tĩnh: là những chất rắn có kích thước nhỏ, hay còn gọi là gel. Pha động: là chất lỏng hay chất khí. • Thành phần pha tĩnh là gel. Mỗi hạt gel đều có những mắt lưới to hay nhỏ phụ thuộc vào loạị gel. Các hạt gel cấu tạo từ polymer. • Một số loại thường được sử dụng trong sắc ký gel như: Dextran (sephadex), Agarose (Sepharose), Polyacrylamide (Sephacryl hoặc BioGel P) hay là Styragel … • Dextran (sephadex) Dextran (Sephadex): là một polysaccharaid polymer có liên kết ngang, khi ở dạng macroscopical có dạng hình cầu. Sephadex có ái lực rất lớn đối với nước nên nó dễ bị trương nở khi gặp nước. 2 2. Agarose (Sepharose) Agarose (Sepharose) là một polymer trung tính có nguồn gốc từ tảo biển. Nó có dạng bột màu trắng, Cấu trúc phân tử của polysaccharide này cho năng lực để hình thành gel mà rất mạnh ngay cả ở nồng độ thấp. 3. Polyacrylamide (Sephacryl hoặc BioGel P) Polyacrylamide (Sephacryl hoặc BioGel P) là một loại gel phù hợp cho quá trình chọn lọc gel, nó dựa trên sự liên kết của các poly-acrylamide gel. 3 tt p://img.alibaba.com/photo/11058820/Polyacrylamide_Polyelectrolyte 4. Styragel III. THÀNH PHẦN PHA ĐỘNG CỦA SẮC KÝ GEL - Thành phần pha động trong sắc ký rây phân tử là chất lỏng và chất khí. Những dung môi nên phù hợp với những loại gel được dùng trong pha tĩnh. - Một số loại thường được dùng như: Tetrahydrofuran (THF) O-dichlorobenzene Trichlorobenzene 4 Tính chất một số loại dung môi sử dụng trong HPLC V. SƠ LƯỢC NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG 5 Các giai đoạn tách các mẫu Mẫu vật được cung cấp cho các đầu cột và sau đó rửa qua bề mặt của các hạt gel bằng nước hoặc dung dịch đệm. Các chất có phân tử lớn hơn lỗ lớn nhất của các hạt gel (vượt quá giới hạn loại trừ) sẽ không thể thâm nhập vào các hạt gel và do đó đi qua bề mặt của hạt gel trong giai đoạn lỏng bên ngoài và bị tách ra ngoài trước tiên. Các phân tử nhỏ hơn thâm nhập vào các hạt với mức độ khác nhau tùy thuộc vào hình dạng và kích thước của chúng. Như vậy, chúng sẽ phân vùng của các phân tử giữa các chất lỏng bên trong và bên ngoài các hạt gel , phần nhỏ là phân tử, phần lớn hơn là tỷ lệ phần trăm của chất lỏng trong các hạt chứa chúng. Như vậy, các phân tử sẽ được tách lần lượt ra khỏi cột theo thứ tự kích thước giảm, những phân tử có kích thước lớn hơn sẽ rời cột đầu tiếp đến là các phân tử có kích thước nhỏ hơn tùy thuộc vào (hình dạng và kích thước) và sự phân vùng của chúng trong lòng hạt gel. Ưu điểm - Xác định chính xác được thời gian tách. Khi dùng phương pháp này chúng ta có thể dự đoán chính xác được khoảng thời gian tách mẫu. - Đạt được hiệu quả cao do gel có hình dạng các lỗ rây nên dựa vào tính chất này ta có thể khống chế, tách loại hoặc giữ lại những hạt có khối lượng không như mong muốn hoặc. mặt khác, dựa vào tính chất hấp phụ của một số gel thì mẫu của chúng ta sẽ trở nên tinh khiết hơn điều này rất quan trọng vì nó trực tiếp ảnh hưởng đến kết quả mà detector cung cấp. - Khi tách các chất ra thì không có xảy ra bất cứ tương tác hóa học hay vật lý nào. Điều này cũng rất dễ hiểu vì cột sắc ký thông thường được làm từ thủy tinh hoặc nhựa còn các loại gel thì từ các polymer hữu cơ nên việc xảy ra phản ứng là điều hoàn toàn khó. 6 - Cung cấp nhiều phương pháp tiện lợi cho quá trình xác định trọng lượng phân tử - Không bị ảnh hưởng của các yếu tố như: nhiệt độ, pH… Nhược điểm - Số lượng peak có hạn - Giữa kích thước của các chất phân tích phải có sự chênh lệch. Sự chênh lệch kích thước tối thiểu là 10%. Ứng dụng - Phân tích các hợp chất có sự khác nhau về khối lượng phân tử - Thanh lọc các enzym và protein khác - Phân tích định tính - Phân tích định lượng - Phân tích dựa vào chiều cao peak - Phân tích dựa vào diện tích peak Ở sắc ký đồ trên ta có thể xác định được trong mẫu có chứa PPG 2000. Nó xuất hiện trong khoảng 10 phút và nằm ở peak 9.96 7 Sắc ký đồ trên là kết quả của việc phân tích mẫu protein. Ở những điểm thời gian khác nhau thì sẽ tách được các chất khác nhau, như ở trong khoảng từ 4- 4.5 phút ta tách được thyroglobuin hay từ 5-5.5 phút là holo-transfemin và cuối cùng trong khoảng từ 6-8 phút là lysozyme. Việc sử dụng dung môi (pha động) cũng ảnh hưởng rất lớn đến kết quả trên săc ký đồ hình ảnh ở trên là hình ảnh minh họa cho ý này. Ngoài ra, một số yếu tố khác là cột sắc ký và chế độ (vận tốc) chảy của dung môi cũng ảnh hưởng. KẾT LUẬN Tóm lại bằng phương pháp lọc rây phân tử người ta thể tách các chất có trọng lượng phân tử khác nhau có trong hỗn hợp (như polimer, polisaccharid, acid nucleic, protein). Người ta có thể dùng kỹ thuật này để loại muối thay cho quá trình thẩm tích. Và hơn thế nữa, trong quá trình tinh chế protein enzyme, chúng còn được sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme. 8 TÀI LIỆU THAM KHẢO Gel chromatography Gel filtration chromatography Theory chromatography Theory chromatography Chuyên đề sắc ký – thư viện 247.net 9 . chromatography), Sắc ký rây phân tử (sắc ký gel) 1 III. THÀNH PHẦN PHA TĨNH CỦA SẮC KÝ GEL 1.Định nghĩa sắc ký gel (gel phrase chromatography) là một phương pháp sắc ký dùng để phân loại những mẫu cần. : Sắc ký lỏng (Liquid Chromatography ) Sắc kí khí (Gas Chromatography) Dựa trên phương pháp chạy sắc ký : Sắc ký lớp mỏng, Điện di - Dựa trên tính chất cột : Sắc ký pha. Sắc kí pha đảo (Reversed Phase Chromatography) - Dựa trên cơ chế phân tách : Sắc ký hấp phụ (phổ biến), Sắc ký tương tác ion(ion exchange chromatography), Sắc ký rây phân tử (sắc