TIỂU LUẬN TỔNG QUAN về sắc ký lớp MỎNG và sắc ký GIẤY

GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA CÔNG NGHỆ HÓA THỰC PHẨM Tiểu luận TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG VÀ SẮC KÝ GIẤY GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG SVTH : PHAN HOÀNG TRUNG HIẾU PHẠM TRUNG HIẾU TRƯƠNG THỊ NGỌC DUYÊN NGUYỄN TUẤN PHONG PHẠM NGỌC XUÂN LỚP : 07CH111 Biên hòa, tháng 4 năm 2011 SVTH : NHÓM 07CH111 1 GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG I.TỔNG QUAN SẮC KÍ. I.1. Phương pháp sắc kí. - Sắc kí là một họ các kĩ thuật hoá học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp. - Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong "pha động", thường là dòng chảy của dung môi, di chuyển qua "pha tĩnh." Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian, giống như các vận động viên chạy maratông. Một cách lí tưởng, mỗi thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là "thời gian lưu." - Trong kĩ thuật sắc kí, hỗn hợp được chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác nhau của các chất tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn hay lỏng. Nhiều kĩ thuật khác nhau đã được dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong môi trường động khí hoặc lỏng và đối với môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua, như giấy, gelatin hay gel magnesium silicate. - Sắc kí phân tích được dùng để xác định danh tính và nồng độ các phân tử trong hỗn hợp. Sắc kí tinh chế được dùng để tinh chế các chất có trong hỗn hợp. I.2. Lịch sử - Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát minh ra kĩ thuật sắc kí vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll. Chữ sắc trong sắc kí có nghĩa là màu; nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga, và vừa là màu của các sắc tố thực vật ông phân tích vào lúc bấy giờ. Tên này vẫn tiếp tục được dùng dù các phương pháp hiện đại không còn liên quan đến màu sắc. SVTH : NHÓM 07CH111 2 GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG - Năm 1952 Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge được trao giải Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc kí phân bố. - Kĩ thuật sắc kí phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc kí Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc kí khác nhau. Đồng thời, kĩ thuật thực hiện sắc kí cũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau. I.3. Lí thuyết sắc kí - Sắc kí là kĩ thuật phân tích chất khai thác sự khác biệt trong phân bố giữa pha động và pha tĩnh để tách các thành phần trong hỗn hợp. Các thành phần của hỗn hợp có thể tương tác với pha tĩnh dựa trên điện tích, độ tan tương đối và tính hấp phụ. I.4. Mức lưu giữ - Mức lưu giữ đo tốc độ một chất di chuyển trong hệ thống sắc kí. Ở các hệ thống liên tục như HPLC hay GC mà các hợp chất được chiết xuất bởi chất chiết xuất, mức lưu giữ được đo bằng thời gian lưu R t hay t R , khoảng thời gian giữa tiêm và phát hiện. Ở các hệ thống ngắt quãng như TLC, mức lưu giữ được đo bằng hệ số lưu R f , quãng đường di chuyển của hợp chất chia cho quãng đường di chuyển của chất chiết xuất (chạy nhanh hơn hợp chất cần phân tích). - Mức lưu giữ của một chất thường khác nhau đáng kể giữa các thí nghiệm và phòng thí nghiệm do dao động của chất chiết xuất, pha tĩnh, nhiệt độ và thiết kế của thí nghiệm. Vì vậy điều quan trọng là phải so sánh mức lưu giữ của hợp chất muốn khảo sát với một hoặc nhiều hợp chất chuẩn trong cùng điều kiện. SVTH : NHÓM 07CH111 3 GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG I.5. Các kĩ thuật sắc kí - Sắc kí giấy - Sắc kí lớp mỏng - Sắc kí khí-lỏng - Sắc kí trao đổi ion - Sắc kí ái tính ion kim loại bất động - Sắc kí lỏng hiệu năng cao - Sắc kí thẩm thấu gel II. SẮC KÝ GIẤY II.1 Định nghĩa - Sắc ký giấy là một kỹ thuật phân tích hóa học để tách và xác định các hỗn hợp chất hoặc có thể nhuộm màu, đặc biệt là các chất sắc tố. - Sắc ký giấy là phương pháp được sử dụng từ rất sớm nhưng ngày nay nó đã được thay thế bằng sắc ký lớp lỏng. Nhưng sắc ký lớp mỏng không phân tách được một số loại hợp chất mà sắc ký giấy có thể phân tách được,đó là các ion kim loại, các amin, và mọt vài chất khác. Sắc ký giấy lan ra bởi phân bố còn sắc ký lớp mỏng lan ra bởi mao dẫn, tuy vậy quá trình tiến hành là giống nhau. Vì vậy ta sẽ xét nhiều tới phương pháp thông dụng hơn để có thể hiểu rõ cho cả hai phương pháp này. SVTH : NHÓM 07CH111 4 GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG III. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG III.1. Sắc kí lớp mỏng - Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc kí được dùng để tách các chất trong hỗn hợp [1] . Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch. - Sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa. - Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật. - Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn. - Giám sát các phản ứng hữu cơ. - Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa một vài bước, làm tăng độ dung giải của sắc kí lớp mỏng và cho số liệu chính xác hơn. Phương pháp này được gọi là sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (high performance TLC - HPTLC). III.2 Chuẩn bị bản sắc kí - Bản sắc kí được làm bằng cách trộn chất hấp phụ, như silicagel, với một lượng nhỏ chất trơ để kết dính, như calcium sulfate (thạch cao), và nước. Hỗn hợp này được trải ra như một lớp vữa đặc trên một bề mặt chất trơ, như thủy tinh, nhôm, hoặc nhựa. Bản sắc kí này sẽ được để khô và kích hoạt bằng cách nung nóng trong lò trong 30 phút ở nhiệt độ 110 °C. Độ dày của lớp hấp phụ thường là 0.1-0.25 mm cho hóa học phân tích, và khoảng 1-2mm cho sắc kí lớp mỏng dự bị. Trong mọi kĩ thuật sắc kí đều bao gồm 1 pha động và 1 pha tĩnh. SVTH : NHÓM 07CH111 5 GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG III.3 Kĩ thuật - Sắc phổ của 10 tinh dầu được nhuộm màu bởi thuốc thử vanillin Phương pháp tiến hành giống với sắc kí giấy với lợi thế là nhanh hơn, tách hỗn hợp hiệu quả hơn, và có sự lựa chọn giữa các "pha tĩnh" khác nhau. Bởi tính đơn giản và nhanh, sắc kí lớp mỏng thường được dùng để giám sát các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng. - Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc kí, khoảng 1 cm từ dưới lên. Bản sắc kí sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp, như ethanol hoặc nước, và được đặt vào trong một vật chứa có nắp. Dung môi di chuyển lên bản sắc kí bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc kí. Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh, và độ tan khác nhau trong dung môi. - Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có được chỗ liên kết với pha tĩnh. Thí dụ, nếu silicagel được dùng như pha tĩnh, nó được xem là phân cực. Cho trước 2 hợp chất có tính phân cực khác nhau, chất nào có tính phân cực lớn hơn sẽ có sự liên kết với silicagel lớn hơn và vì thế sẽ có khả năng đẩy pha động ra khỏi các chỗ liên kết. Do đó, hợp chất có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di chuyển SVTH : NHÓM 07CH111 6 GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG lên cao hơn trên bản sắc kí (kết quả là hệ số lưu R f sẽ lớn hơn). Nếu pha động được thay bằng một dung môi phân cực hơn hoặc là một hỗn hợp các dung môi, nó sẽ có khả năng để đẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết với silica gel, và tất cả các hợp chất trên bản sắc kí sẽ dịch chuyển lên cao hơn. Trên thực tế, nếu chúng ta dùng một hỗn hợp ethyl acetate và heptane như là pha động, tăng thêm ethyl acetate sẽ cho hệ số lưu R f cao hơn cho tất cả các hợp chất trên bản sắc kí. Thay đổi độ phân cực của pha động sẽ không làm các hợp chất có thứ tự di chuyển ngược lại trên bản sắc kí. Nếu muốn có một thứ tự ngược lại trên bản sắc kí, một pha tĩnh không phân cực sẽ được sử dụng, như là C18-chức năng hóa silica. - Quá trình sắc kí lớp mỏng: một hỗn hợp của một hợp chất đỏ và một hợp chất lam được tách biệt trong quá trình sắc kí (dung môi màu xanh nhạt di chuyển lên trên bản sắc kí. - Dung môi thích hợp dùng trong sắc kí lớp mỏng sẽ là một dung môi có tính phân cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại. III.4 Phân tích SVTH : NHÓM 07CH111 7 GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG - Do một số hóa chất khi được tách ra sẽ trở nên không màu, một vài phương pháp được sử dụng để quan sát những vệt này: - Thông thường, một lượng nhỏ chất huỳnh quang, thường là maganese- activated zinc silicate, được cho thêm vào chất hấp phụ để có thể quan sát được những vệt này dưới ánh sáng đen (tia cực tím UV 254 ). Lớp hấp phụ vì thế sẽ tự phát ra ánh sáng lục, nhưng các vệt mẫu sẽ làm tắt ánh sáng này. - Hơi Iodine cũng là một loại thuốc thử cho màu giống nhau. - Một số thuốc thử cho màu riêng biệt được dùng để nhúng bản sắc kí vào, hoặc phun lên bản sắc kí. - Trong trường hợp của chất béo, sắc phổ có thể sẽ được chuyển qua một màng polyvinylidene fluoride (PVDF) và sau đó sẽ được phân tích sâu hơn, chẳng hạn như khối phổ. - Một khi đã trở nên quan sát được, hệ số lưu R f của mỗi vệt mẫu sẽ được xác định bằng cách chia khoảng cách di chuyển được của hợp chất cho khoảng cách di chuyển được của dung môi. Những số liệu này phụ thuộc vào các loại dung môi được sử dụng và các loại bản sắc kí, và không phải là hằng số. III.4 Ứng dụng - Trong hóa học hữu cơ, phản ứng được giám sát chất lượng bởi sắc kí lớp mỏng. Các mẫu thử được thấm lên bản sắc kí bằng một ống mao dẫn: một vệt nhỏ chất ban đầu, một vệt nhỏ từ hỗn hợp phản ứng, và một vệt nhỏ gồm cả 2 chất. Một bản sắc kí nhỏ (3 cm x 7 cm) sẽ mất khoảng khoảng hai, ba phút để vận hành. Quá trình này phân tích chất lượng và sẽ chỉ ra nếu chất ban đầu biến mất, sản phẩm được tạo thành, và bao nhiêu sản phẩm được tạo thành. Đáng tiếc rằng sắc kí lớp mỏng đối với các phản ứng xảy ra ở nhiệt độ thấp có thể cho ra kết quả không đúng, bởi vì các mẫu thử sẽ được làm ấm lên trong mao dẫn. Một trong những phản ứng như vậy là phản ứng khử ester bởi DIBALH thành aldehyde. SVTH : NHÓM 07CH111 8 GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG - Một ví dụ là sắc kí được áp dụng cho một phần lá xanh (ở đây là rau chân vịt) qua 7 bước. Carotene tách ra nhanh chóng và chỉ quan sát được cho đến bước 2. Chlorophyll A và B hiện rõ ở giữa bản sắc kí trong bước cuối cùng và lutein là hợp chất đầu tiên nhuộm màu vàng lên bản sắc kí. Bước 1 Bước 2 Bước 3 Bước 4 SVTH : NHÓM 07CH111 9 GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG Bước 5 Bước 6 Bước 7 - Trong một nghiên cứu, sắc kí lớp mỏng đã được sử dụng để lọc phản ứng hóa học hữu cơ [2] , như tổng hợp BINAP từ 2-naphtol. Trong phương pháp này, cồn và dung dịch xúc tác (chẳng hạn như iron(III) chloride được đặt riêng rẽ trên đường gốc, sau đó phản ứng với nhau và được phân tích ngay lập tức. III.5 Nguyên tắc - Nguyên tắc: Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc. - Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. SVTH : NHÓM 07CH111 10 [...]... Quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf hoặc Rr và tiến hành định tính, phát hiện tạp chất hoặc định lượng như quy định trong chuyên luận riêng - Việc sắc ký lớp mỏng được tiến hành trong điều kiện chuẩn hoá cho kết quả có độ tin cậy cao hơn Hiện nay người ta thường tiến hành sắc ký với sự giúp đỡ của hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (Planar chromatography - HPTLC) III 7 Phương pháp sắc ký. .. HPTLC) III 7 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao - Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc SVTH : NHÓM 07CH111 14 GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG - Về nguyên tắc cơ bản không khác nhiều với sắc ký lớp mỏng thông thường Điểm khác chủ yếu là quá trình chấm sắc ký được điều khiển và thực hiện bằng máy, số... bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 365 nm - Dụng cụ để phun thuốc thử - Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện - Tủ hút hơi độc - Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần những dung dịch pha loãng chất cần phân tích - Một máy ảnh thích hợp (với ống kính Macro) có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban... của bản mỏng 1,5cm - 2 cm và cách bề mặt dung môi từ 0,8 - 1 cm Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 - 6 mm và cách nhau 15 mm Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ Khi làm sắc ký lớp mỏng bán định lượng, độ chính xác của kết quả phân tích phụ thuộc rất nhiều vào độ chính xác của lượng chất thử đưa lên bản mỏng, tức là thể tích dung dịch chấm lên bản mỏng Do... khai sắc ký: Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn theo quy định trong chuyên luận, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi hiện vết theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng... lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2 ml khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch như trong trường hợp sắc ký điều chế Ðối với sắc ký điều chế thì lượng chất có thể lên tới 10 - 50 mg Ðối với các dung dịch có nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần chấm - Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng1 ,5cm... mỏng1 ,5cm - 2 cm và cách bề mặt dung môi từ 0,8 - 1 cm Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 - 6 mm và cách nhau 15 mm Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ Khi làm sắc ký lớp mỏng bán định lượng, độ chính xác của kết quả phân tích phụ thuộc rất nhiều vào độ chính xác của lượng chất thử đưa lên bản mỏng, tức là thể tích dung dịch chấm lên bản mỏng Do đó, với... khai sắc ký: Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn theo quy định trong chuyên luận, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi hiện vết theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng... bản mỏng rồi hiện vết theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng Quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf hoặc Rr và tiến hành định tính, phát hiện tạp chất hoặc định lượng như quy định trong chuyên luận riêng (Sắc ký đồ một số dịch chiết dược liệu) IV KẾT LUẬN - Như vậy: sắc kí lớp mỏng giúp phân tích được trong một hợp chất có bao nhiêu chất và dự đoán được chúng bao gồm những chất gì Nhờ thế chúng ta... hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2 ml khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch như trong trường hợp sắc ký điều chế Ðối với sắc ký điều chế thì lượng chất có thể lên tới 10 - 50 mg Ðối với các dung SVTH : NHÓM 07CH111 13 GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG dịch có nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần . thuật sắc kí - Sắc kí giấy - Sắc kí lớp mỏng - Sắc kí khí-lỏng - Sắc kí trao đổi ion - Sắc kí ái tính ion kim loại bất động - Sắc kí lỏng hiệu năng cao - Sắc kí thẩm thấu gel II. SẮC KÝ GIẤY II.1. TRỌNG III. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG III.1. Sắc kí lớp mỏng - Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc kí được dùng để tách các chất trong hỗn hợp [1] . Phương pháp sắc. tiến hành sắc ký với sự giúp đỡ của hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (Planar chromatography - HPTLC). III. 7 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao - Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu