TIỂU LUẬN TỔNG QUAN về sắc ký lớp MỎNG và sắc ký GIẤY

- Sắc kí là một họ các kĩ thuật hoá học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp.. Một cách lí tưởng, mỗi thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA CÔNG NGHỆ HÓA THỰC PHẨM

Tiểu luận TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG VÀ

SẮC KÝ GIẤY

GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG SVTH : PHAN HOÀNG TRUNG HIẾU PHẠM TRUNG HIẾU

TRƯƠNG THỊ NGỌC DUYÊN NGUYỄN TUẤN PHONG PHẠM NGỌC XUÂN

LỚP : 07CH111

Biên hòa, tháng 4 năm 2011

I.TỔNG QUAN SẮC KÍ.

I.1 Phương pháp sắc kí.

- Sắc kí là một họ các kĩ thuật hoá học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp

- Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong "pha động", thường là dòng chảy của dung môi, di chuyển qua "pha tĩnh." Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu Khi các thành phần này

di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian, giống như các vận động viên chạy maratông Một cách lí tưởng, mỗi thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là "thời gian lưu."

- Trong kĩ thuật sắc kí, hỗn hợp được chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác nhau của các chất tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn hay lỏng Nhiều kĩ thuật khác nhau đã được dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong môi trường động khí hoặc lỏng và đối với môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua, như giấy, gelatin hay gel magnesium silicate

- Sắc kí phân tích được dùng để xác định danh tính và nồng độ các phân

tử trong hỗn hợp Sắc kí tinh chế được dùng để tinh chế các chất có trong hỗn hợp

I.2 Lịch sử

- Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát minh ra kĩ thuật sắc kí vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll Chữ sắc trong sắc kí có nghĩa là màu; nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga, và vừa là màu của các sắc tố thực vật ông phân tích vào lúc bấy giờ Tên này vẫn tiếp tục được dùng dù các phương pháp hiện đại không còn liên quan đến màu sắc

- Năm 1952 Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge được trao giải Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc kí phân

bố

- Kĩ thuật sắc kí phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20 Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc kí Tsvet có thể được

áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc kí khác nhau Đồng thời, kĩ thuật thực hiện sắc kí cũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau

I.3 Lí thuyết sắc kí

- Sắc kí là kĩ thuật phân tích chất khai thác sự khác biệt trong phân bố giữa pha động và pha tĩnh để tách các thành phần trong hỗn hợp Các thành phần của hỗn hợp có thể tương tác với pha tĩnh dựa trên điện tích,

độ tan tương đối và tính hấp phụ

I.4 Mức lưu giữ

- Mức lưu giữ đo tốc độ một chất di chuyển trong hệ thống sắc kí Ở các

hệ thống liên tục như HPLC hay GC mà các hợp chất được chiết xuất bởi chất chiết xuất, mức lưu giữ được đo bằng thời gian lưu Rt hay tR, khoảng thời gian giữa tiêm và phát hiện Ở các hệ thống ngắt quãng như TLC, mức lưu giữ được đo bằng hệ số lưu Rf, quãng đường di chuyển của hợp chất chia cho quãng đường di chuyển của chất chiết xuất (chạy nhanh hơn hợp chất cần phân tích)

- Mức lưu giữ của một chất thường khác nhau đáng kể giữa các thí nghiệm và phòng thí nghiệm do dao động của chất chiết xuất, pha tĩnh, nhiệt độ và thiết kế của thí nghiệm Vì vậy điều quan trọng là phải so sánh mức lưu giữ của hợp chất muốn khảo sát với một hoặc nhiều hợp chất chuẩn trong cùng điều kiện

I.5 Các kĩ thuật sắc kí

- Sắc kí giấy

- Sắc kí lớp mỏng

- Sắc kí khí-lỏng

- Sắc kí trao đổi ion

- Sắc kí ái tính ion kim loại bất động

- Sắc kí lỏng hiệu năng cao

- Sắc kí thẩm thấu gel

II SẮC KÝ GIẤY

II.1 Định nghĩa

- Sắc ký giấy là một kỹ thuật phân tích hóa học để tách và xác định các hỗn hợp chất hoặc có thể nhuộm màu, đặc biệt là các chất sắc tố

- Sắc ký giấy là phương pháp được sử dụng từ rất sớm nhưng ngày nay

nó đã được thay thế bằng sắc ký lớp lỏng Nhưng sắc ký lớp mỏng không phân tách được một số loại hợp chất mà sắc ký giấy có thể phân tách được,đó là các ion kim loại, các amin, và mọt vài chất khác Sắc ký giấy lan ra bởi phân bố còn sắc ký lớp mỏng lan ra bởi mao dẫn, tuy vậy quá trình tiến hành là giống nhau Vì vậy ta sẽ xét nhiều tới phương pháp thông dụng hơn để có thể hiểu rõ cho cả hai phương pháp này

III TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG

III.1 Sắc kí lớp mỏng

- Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc

kí được dùng để tách các chất trong hỗn hợp[1] Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch

- Sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: xét nghiệm

độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa

- Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật

- Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn

- Giám sát các phản ứng hữu cơ

- Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa một vài bước, làm tăng độ dung giải của sắc kí lớp mỏng và cho số liệu chính xác hơn Phương pháp này được gọi là sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (high performance TLC - HPTLC)

III.2 Chuẩn bị bản sắc kí

- Bản sắc kí được làm bằng cách trộn chất hấp phụ, như silicagel, với một lượng nhỏ chất trơ để kết dính, như calcium sulfate (thạch cao), và nước Hỗn hợp này được trải ra như một lớp vữa đặc trên một bề mặt chất trơ, như thủy tinh, nhôm, hoặc nhựa Bản sắc kí này sẽ được để khô và kích hoạt bằng cách nung nóng trong lò trong 30 phút ở nhiệt độ 110 °C Độ dày của lớp hấp phụ thường là 0.1-0.25 mm cho hóa học phân tích, và khoảng 1-2mm cho sắc kí lớp mỏng dự bị Trong mọi kĩ thuật sắc kí đều bao gồm 1 pha động và 1 pha tĩnh

III.3 Kĩ thuật

- Sắc phổ của 10 tinh dầu được nhuộm màu bởi thuốc thử vanillin

Phương pháp tiến hành giống với sắc kí giấy với lợi thế là nhanh hơn, tách hỗn hợp hiệu quả hơn, và có sự lựa chọn giữa các "pha tĩnh" khác nhau Bởi tính đơn giản và nhanh, sắc kí lớp mỏng thường được dùng để giám sát các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng

- Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc kí, khoảng

1 cm từ dưới lên Bản sắc kí sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp, như ethanol hoặc nước, và được đặt vào trong một vật chứa có nắp Dung môi di chuyển lên bản sắc kí bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc kí Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh, và độ tan khác nhau trong dung môi

- Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có được chỗ liên kết với pha tĩnh Thí dụ, nếu silicagel được dùng như pha tĩnh, nó được xem là phân cực Cho trước 2 hợp chất có tính phân cực khác nhau, chất nào có tính phân cực lớn hơn sẽ có sự liên kết với silicagel lớn hơn và vì thế sẽ có khả năng đẩy pha động ra khỏi các chỗ liên kết Do đó, hợp chất có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di chuyển

lên cao hơn trên bản sắc kí (kết quả là hệ số lưu Rf sẽ lớn hơn) Nếu pha động được thay bằng một dung môi phân cực hơn hoặc là một hỗn hợp các dung môi, nó sẽ có khả năng để đẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết với silica gel, và tất cả các hợp chất trên bản sắc kí sẽ dịch chuyển lên cao hơn Trên thực tế, nếu chúng ta dùng một hỗn hợp ethyl acetate và heptane như là pha động, tăng thêm ethyl acetate sẽ cho hệ số lưu Rf cao hơn cho tất cả các hợp chất trên bản sắc kí Thay đổi độ phân cực của pha động sẽ không làm các hợp chất có thứ tự di chuyển ngược lại trên bản sắc kí Nếu muốn có một thứ tự ngược lại trên bản sắc kí, một pha tĩnh không phân cực sẽ được sử dụng, như là C18-chức năng hóa silica

- Quá trình sắc kí lớp mỏng: một hỗn hợp của một hợp chất đỏ và một hợp chất lam được tách biệt trong quá trình sắc kí (dung môi màu xanh nhạt di chuyển lên trên bản sắc kí

- Dung môi thích hợp dùng trong sắc kí lớp mỏng sẽ là một dung môi có tính phân cực khác với pha tĩnh Nếu một dung môi phân cực được dùng

để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại

III.4 Phân tích

- Do một số hóa chất khi được tách ra sẽ trở nên không màu, một vài phương pháp được sử dụng để quan sát những vệt này:

- Thông thường, một lượng nhỏ chất huỳnh quang, thường là maganese-activated zinc silicate, được cho thêm vào chất hấp phụ để có thể quan sát được những vệt này dưới ánh sáng đen (tia cực tím UV254) Lớp hấp phụ

vì thế sẽ tự phát ra ánh sáng lục, nhưng các vệt mẫu sẽ làm tắt ánh sáng này

- Hơi Iodine cũng là một loại thuốc thử cho màu giống nhau

- Một số thuốc thử cho màu riêng biệt được dùng để nhúng bản sắc kí vào, hoặc phun lên bản sắc kí

- Trong trường hợp của chất béo, sắc phổ có thể sẽ được chuyển qua một màng polyvinylidene fluoride (PVDF) và sau đó sẽ được phân tích sâu hơn, chẳng hạn như khối phổ

- Một khi đã trở nên quan sát được, hệ số lưu Rf của mỗi vệt mẫu sẽ được xác định bằng cách chia khoảng cách di chuyển được của hợp chất cho khoảng cách di chuyển được của dung môi Những số liệu này phụ thuộc vào các loại dung môi được sử dụng và các loại bản sắc kí, và không phải

là hằng số

III.4 Ứng dụng

- Trong hóa học hữu cơ, phản ứng được giám sát chất lượng bởi sắc kí lớp mỏng Các mẫu thử được thấm lên bản sắc kí bằng một ống mao dẫn: một vệt nhỏ chất ban đầu, một vệt nhỏ từ hỗn hợp phản ứng, và một vệt nhỏ gồm cả 2 chất Một bản sắc kí nhỏ (3 cm x 7 cm) sẽ mất khoảng khoảng hai, ba phút để vận hành Quá trình này phân tích chất lượng và

sẽ chỉ ra nếu chất ban đầu biến mất, sản phẩm được tạo thành, và bao nhiêu sản phẩm được tạo thành Đáng tiếc rằng sắc kí lớp mỏng đối với các phản ứng xảy ra ở nhiệt độ thấp có thể cho ra kết quả không đúng, bởi

vì các mẫu thử sẽ được làm ấm lên trong mao dẫn Một trong những phản ứng như vậy là phản ứng khử ester bởi DIBALH thành aldehyde

- Một ví dụ là sắc kí được áp dụng cho một phần lá xanh (ở đây là rau chân vịt) qua 7 bước Carotene tách ra nhanh chóng và chỉ quan sát được cho đến bước 2 Chlorophyll A và B hiện rõ ở giữa bản sắc kí trong bước cuối cùng và lutein là hợp chất đầu tiên nhuộm màu vàng lên bản sắc kí

Bước 1

Bước 2

Bước 3

Bước 4

Bước 5

Bước 6

Bước 7

- Trong một nghiên cứu, sắc kí lớp mỏng đã được sử dụng để lọc phản ứng hóa học hữu cơ[2], như tổng hợp BINAP từ 2-naphtol Trong phương pháp này, cồn và dung dịch xúc tác (chẳng hạn như iron(III) chloride được đặt riêng rẽ trên đường gốc, sau đó phản ứng với nhau và được phân tích ngay lập tức

III.5 Nguyên tắc

- Nguyên tắc: Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc

- Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận

Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc

độ khác nhau Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động

- Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

trong đó:

a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi

đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm

Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l

Cách tiến hành

+ Dụng cụ

- Bình triển khai, thường bằng thuỷ tinh trong suốt có kích thước phù hợp với các phiến kính cần dùng và có nắp đậy kín

- Ðèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 365 nm

- Dụng cụ để phun thuốc thử

- Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện

- Tủ hút hơi độc

- Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần những dung dịch pha loãng chất cần phân tích

- Một máy ảnh thích hợp (với ống kính Macro) có thể chụp lưu giữ sắc

ký đồ ở ánh sáng ban ngày với khoảng cách 30-50 cm

- Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.

- Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, các ống mao quản hoặc dụng cụ thích hợp

- Bản mỏng tráng sẵn chất hấp phụ có chất phát quang thích hợp

- Trường hợp phòng thí nghiệm không có điều kiện trang bị các loại bản mỏng tráng sẵn thì tự chuẩn bị lấy bản mỏng với các dụng cụ sau đây:

- Các tấm kính phẳng có kích thước phù hợp đã được xử lý trước bằng hóa chất rồi rửa sạch bằng nước và sấy khô

- Thiết bị trải chất hấp phụ lên tấm kính thành một lớp mỏng đồng đều,

có chiều dày thích hợp

- Giá để xếp các tấm kính đã trải

+ Chuẩn bị bản mỏng

- Sắp xếp các bản mỏng và chuẩn bị thiết bị: Các phiến kính phải được lau chùi cẩn thận và tẩy sạch hoàn toàn các chất béo bằng cách ngâm trong dung dịch sulfocromic Sau đó, cọ kỹ bằng bàn chải dưới tia nước máy rồi tráng nước cất và sấy khô trên giá ở nhiệt độ thường hay trong tủ sấy

- Ðiều chế vữa của chất hấp phụ: Chất hấp phụ được chọn lọc sao cho phù hợp với yêu cầu phân tích như: Silicagel G, kieselguhr, cellulose, nhôm oxyd, trong số đó silicagel G được dùng thông dụng nhất Trộn 25g silicagel G với 50 ml nước cất và nhào trong cối hoặc lắc mạnh trong bình nón có dung tích 200 - 250 ml, nút kín, trong 30 - 45 giây Dịch treo tạo được ở dạng lỏng và đồng nhất, se lại trong vài phút sau đó, vì có bột

bó Rót ngay vào thiết bị trải đã điều chỉnh độ dày cho bản mỏng khoảng 0,25 mm (nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng)

- Ðể nguyên các phiến kính tại chỗ khoảng 10 phút tới khi mặt trên hết bóng, hoặc để khô tự nhiên qua đêm tại nhiệt độ phòng

Hoạt hóa: Cho các bản mỏng đã khô mặt vào tủ sấy và sấy ở 105

-110oC trong 30 phút (nếu không có chỉ dẫn ở chuyên luận riêng) Ðể

nguội rồi bảo quản trong bình hút ẩm Khi dùng, nếu cần thì hoạt hóa lại bằng cách sấy ở 105-1100C trong 1 giờ rồi cạo bỏ một dải mỏng chất hấp phụ dọc hai bên cạnh của tấm kính

- Chuẩn bị bình khai triển: Các bình khai triển thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ, có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của các bản mỏng sử dụng Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa

đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình Ðậy kín nắp bình và để yên 1 giờ ở nhiệt độ 20 - 25oC Muốn thu được những kết quả lặp lại, ta chỉ nên dùng những dung môi thật tinh khiết, loại dùng cho sắc ký Những dung môi dễ bịến đổi về hóa học chỉ nên pha trước khi dùng Nếu sử dụng những hệ pha động phức tạp phải chú ý đến những thành phần dễ bay hơi làm thay đổi thành phần của hệ pha động dẫn đến hiện tượng không lặp lại của trị

số Rf

- Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Lượng chất hoặc hỗn hợp chất đưa lên bản mỏng có ý nghĩa quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, đặc bịệt ảnh hưởng rất lớn đến trị số Rf Lượng chất quá lớn làm cho vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf gần nhau sẽ bị chồng lấp Lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được do độ nhạy của thuốc thử không đủ (thông thường độ nhạy của các thuốc thử trên 0,005 mg) Lượng mẫu thông thường cần đưa lên bản mỏng là 0,1 - 50 mg ở dạng dung dịch trong ether, c1oroform, nước hay dung môi thích hợp khác Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2 ml khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch như trong trường hợp sắc ký điều chế Ðối với sắc ký điều chế thì lượng chất có thể lên tới 10 - 50 mg Ðối với các dung