Tiến hành: chuột sau khi được nuôi ổn định 2 ngày trước khi tiến hành nghiên cứu, được cho sử dụng thuốc thử nghiệm ở liều và phương pháp khảo sát, theo dõi tỉ lệ tử vong của chuột trong
Trang 1XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH CẤP.
Các mẫu thử độc tính cấp được kí hiệu như sau:
1 M4: Sapo-4
2 M5: Japo-5
3 M6: Poly-6
a/Phương pháp thử : Xác định độc tính cấp của thuốc diệt côn trùng
Thú vật thử nghiệm: chuột nhắt trắng Swiss albino, thể trọng 18-25g, không phân biệt phái tính, do viện Pasteur Nha Trang cung cấp
Đường khảo sát: cho uống và phun xịt
b/Phương pháp tiến hành: thuốc diệt côn trùng đem cho chuột sử dụng với
điều kiện thể tích x ml cho 10 gam chuột đối với đường uống hoặc phun ướt chuột đối với đường phun xịt
Tiến hành: chuột sau khi được nuôi ổn định 2 ngày trước khi tiến hành nghiên cứu, được cho sử dụng thuốc thử nghiệm ở liều và phương pháp khảo sát, theo dõi tỉ lệ
tử vong của chuột trong 72 giờ và theo dõi chuột trong vòng 14 ngày Giải phẫu đại thể được thực hiện ở các chuột chết, chuột hấp hối và chuột còn sống khi kết thúc thử nghiệm
c/Đánh giá kết quả: Kết quả liều gây độc, liều tối đa có thể sử dụng mà
không gây cho chuột bị tử vong trong vòng 72 giờ, kết quả theo dõi tình trạng chuột và giải phẫu đại thể khi chuột chết, hấp hối và khi kết thúc thử nghiệm trong vòng 14 ngày trên 10 chuột nhắt trắng
d/Kết quả thử nghiệm:
M4: (Sapo-4)
Đường cho uống: liều tối đa sử dụng 25 mg/Kg gây chết 02/20 chuột nhắt
Đường phun xịt :1,5 ml/1 chuột không cạo lông và có cạo lông không gây tử vong
M5: (Japo-5)
sau 30 giờ và 1 chết sau 8 ngày)
Đường phun xịt: 1,5 ml/1 chuột không cạo lông và có cạo lông không gây tử vong
cho chuột nhắt
M6: (Poly-6)
Đường phun xịt: 1,5 ml/1 chuột không cạo lông và có cạo lông không gây tử vong
cho chuột nhắt
XÁC ĐỊNH LD50
Nếu xác định được liều gây chết tất cả thú vật thử nghiệm thì sẽ tiến hành xác định liều gây chết 50% thú vật thử nghiệm
Phương pháp thử nghiệm: Xác định liều LD50 của thuốc thử nghiệm
Trang 2Thú vật thử nghiệm: chuột nhắt trắng giống Swiss albino, thể trọng 18 – 22 g Đường khảo sát: cho uống hoặc phun xịt với lượng mẫu là 300 mL
Thuốc thử nghiệm: chế phẩm thuốc diệt côn trùng được tạo thành hỗn dịch
nghiên cứu sẵn bởi Viện Khoa học vật liệu ứng dụng được đem pha loãng theo yêu cầu thử nghiệm cho chuột sử dụng với điều kiện thể tích 0,1 ml cho 10 gam chuột
Tiến hành: chuột sau khi được nuôi ổn định 2 ngày trước khi tiến hành nghiên
cứu, được cho sử dụng thuốc thử nghiệm để xác định liều LD100 (liều tối thiểu gây chết 100% chuột) Khi xác định được liều LD0 và LD100, chia các chuột
nghiệm với các liều nghiên cứu, theo dõi tỉ lệ tử vong của chuột trong 24 giờ
Kết quả đạt được: tính liều LD50 của thuốc khảo sát trên chuột nhắt trắng bằng
phương pháp Karber – Behrens
Kết quả thử nghiệm:
- M u M04:ẫu M04:
a = 0.02
b=(0.5+4+8+8.5+6.5+5.5)
n = 68/7 = 9.71
LD50=Df-Eab=0,2- (0,66/9,71)=0.132mg/kg
-M u M05ẫu M04:
a = 0.02
b=(3.5+6.5+6.5+75)
n = 48/5 = 9.6
LD50=Df-Eab=0,19-(0,48/9,6)=0.14mg/kg
-M u M06.ẫu M04:
a = 0.02
b = (2+5.5+7.5+7 +6))
n = 56/6 = 9.3
LD50=Df-Eab=0,19-(0,48/9,6)=0.14mg/kg
THỬ NGHIỆM XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN
(BÁN MÃN TÍNH)
Trang 3Phương pháp thử nghiệm: Xác định độc tính bán trường diễn của chế phẩm
thuốc diệt côn trùng đường uống hoặc đường phun xịt trên chuột nhắt trắng
Thú vật thử nghiệm: Chuột nhắt trắng giống ddY, thể trọng 18 – 22 g
Đường khảo sát: Cho uống hoặc phun xịt với lượng mẫu là 4000 mL
Thuốc thử nghiệm: Chế phẩm thuốc diệt côn trùng được tạo thành hỗn dịch
nghiên cứu sẵn bởi Viện Khoa học vật liệu ứng dụng được đem pha loàng theo yêu cầu thử nghiệm cho chuột sử dụng với điều kiện thể tích 0,1 ml cho 10 gam chuột
Tiến hành: Chuột sau khi được nuôi ổn định 2 ngày trước khi tiến hành nghiên
cứu, được cho sử dụng thuốc thử nghiệm ở liều khảo sát 2 tháng Công thức máu, giải phẫu vi thể, và chức năng sinh hóa của gan thận được kiểm tra ở thời điểm sau
60 ngày sử dụng thuốc
Kết quả đạt được: Kết quả độc tính bán trường diễn của thuốc diệt côn trùng ở
liều khảo sát theo đường uống trên chuột nhắt trắng sau 60 ngày khảo sát
Kết quả thử nghiệm:
MÔ TẢ NỘI DUNG
Thăm dò độc tính bán trường diễn bằng cách theo dõi các chỉ số huyết học, sinh hóa, sự thay đổi vi-đại thể của một số phủ tạng của các chuột lô chứng và lô thử sau khi cho dùng một liều nhất định thuốc trong một thời gian dài 2 tháng
1 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu thực nghiệm xác định độc tính bán trường diễn
1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu
Chuột nhắt trắng giống ddY ở cả hai giới, trọng lượng từ 18 – 26 gam được cung cấp bởi viện Pasteur TP.HCM Chuột được nuôi ổn định 2 ngày trước khi tiến hành thử nghiệm Trong suốt quá trình thử nghiệm, chuột được cung cấp đầy đủ thức ăn, nước uống Các thử nghiệm được bắt đầu từ 8 giờ sáng mỗi ngày
Mẫu thử: Các mẫu thử thuốc diệt côn trùng bọ đậu đen M04, M05 và M06 do Viện khoa học vật liệu ứng dụng cung cấp Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ phòng, pha loãng trong nước cất đến nồng độ liều thử nghiệm
1.2 Phương pháp nghiên cứu
1.2.1 Tiến hành thử nghiệm
Các chuột nhắt đủ điều kiện thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành các lô: lô chứng và các lô thử nghiệm M04, M05 và M06, mỗi lô 60 con cho 1 mẫu thuốc thử nghiệm
Liều chất thử là liều trong khoảng 1/20 – 1/10 liều LD50 dùng đường uống của mỗi chất trên chuột nhắt trawmnh Swiss albino với thể tích cho uống là 10 ml/kg thể trọng chuột Liều thử nghiệm M04, M05 và M06 lần lượt là 0,013 mg/kg; 0,014 mg/kg và 0,014 mg/kg
Đường sử dụng: đường uống (po), dùng kim đầu thẳng tròn đưa vào dạ dày chuột 1.2.2 Các chỉ tiêu theo dõi:
Chuột ở các lô thử nghiệm được đánh giá và so sánh với lô chứng dựa vào các thông số:
Trang 4- Sự thay đổi thể trọng theo thời gian
- Các chỉ số huyết học
- Các chỉ số sinh hĩa về chức năng gan, thận
- Các xét nghiệm đại thể và vi thể gan, thận
Sự thay đổi thể trọng theo thời gian: Chuột ở các lơ được cân mỗi ngày trước khi cho sử dụng thuốc trong suốt quá trình thử nghiệm
Các chỉ số về huyết học, sinh hĩa về chức năng gan, thận, và giải phẫu đại thể, vi thể:
lồng ngực để lấy máu trực tiếp từ tim cho vào các ống đựng cho xét nghiệm huyết học và sinh hĩa Xét nghiệm huyết học và sinh hĩa chức năng gan thận của chuột được gửi thực hiện tại Khoa Huyết học và Khoa Sinh hĩa Bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh
Chuột cũng được phẫu thuật mở bụng để lấy mẫu gan và thận Các mẫu gan, thận được bảo quản trong dung dịch formol 10% pha trong đệm phosphat và gửi Bộ Mơn Giải Phẫu Bệnh – Khoa Y – Đại học Y Dược TP.HCM xét nghiệm và đọc kết quả vi thể
1.2.3 Phân tích thống kê:
Các số liệu được trình bày dưới dạng Số trung bình ± Sai số chuẩn của số trung bình Sự khác biệt giữa các lơ được xác định bằng test Kruskal – Wallis, test Mann-Whitney U, Chi-squared test & Fisher's Exact Test với phần mềm thống kê Minitab 14.0
2 Kết quả thử nghiệm
2.1 Khảo sát các chỉ số huyết học
2.1.1 Các chỉ số của hồng cầu
B ng 1 Các ch s h ng c u c a lơ ch ng và các lơ th (S trung bình ± Sai s chu nầu của lơ chứng và các lơ thử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ủa lơ chứng và các lơ thử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ứng và các lơ thử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ẩn
c a s trung bình)ủa lơ chứng và các lơ thử (Số trung bình ± Sai số chuẩn
Chỉ số
Lơ
RBC (x10 6 /
mm 3 )
Hemoglobin (g/dl)
Hematocrit (%)
MCV (µm 3 )
MCH (pg)
MCHC (g/dl)
RDW (%) Chứng
n =13
9,301±
0,174
139,42±
2,00
43,173±
0,672
46,067±
0,70
14,854±
0,227
321,17±
2,41
17,962± 0,464 Thử M04
n=10
8,928±
0,167
133,70±
2,53
42,540±
0,918
47,650±
0,533
14,990±
0,140
312,44±
2,04
17,770± 0,543 M05
n=10
9,168±
0,353
136,20±
4,61
41,38±
1,18
44,444±
0,767
14,825±
0,0840
329,00±
4,07
18,110± 0,378 M06
n=6 9,142±0,276 138,17 ±2,90 43,500±0,987 47,68 ±1,06 15,133±0,265 317,83±3,03 17,150±0,820
(*), p<0,05, khác cĩ ý nghĩa thống
kê so với lơ chứng
0
2
4
6
8
10
Chứng M04 M05 M06
chứng M04 M05 M06
(n=13) (n=10) (n=10) (n=6)
Trang 5Hình 1.Các chỉ số hồng cầu và hemoglobin của lơ chứng và các lơ thử M04, M05
và M06 sau 60 ngày sử dụng thuốc ở các liều thử nghiệm
Chỉ số số lượng hồng cầu và hemoglobin của các lơ thử cĩ giảm so với lơ chứng nhưng vẫn nằm trong giới hạn bình thường sau 60 ngày thử nghiệm Các chỉ số Hematocrit, MCV, MCH, MCHC và RDW thay đổi khơng cĩ ý nghĩa so với lơ chứng Vậy sự giảm hemoglobin là do giảm số lượng hồng cầu Các đặc tính về hình dạng, màu sắc của hồng cầu đều bình thường
2.1.2 Các chỉ số của bạch cầu
B ng 2 Các ch s b ch c u c a lơ ch ng và các lơ th (S trung bình ± Sai s chu nầu của lơ chứng và các lơ thử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ủa lơ chứng và các lơ thử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ứng và các lơ thử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ẩn
c a s trung bình)ủa lơ chứng và các lơ thử (Số trung bình ± Sai số chuẩn
Chỉ số
Lơ
WBC
3)
%Neut ro-phile
%Lymph
o-Cyte
%Mono
-cyte
%Eosino-phile
%Baso-phile
1,08
25,61±
3,35
72,03 ± 3,09
2,642±
0,275
0,0385±
0,0140
1,562± 0,151
Thử
M04
24,13
± 1,28
69,33 ± 1,86
4,050*
± 0,414
M05
20,53
± 1,22
73,22 ±
M06
19,88
± 2,25
75,48 ±
(*), p<0,05, khác cĩ ý nghĩa thống kê so với lơ chứng
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Chứng M04 M05 M06
chứng M04 M05 M06
(n=13) (n=10) (n=10) (n=6)
Hình 2 Số lượng bạch cầu của lơ chứng và các lơ thử M04, M05 và M06 sau 60 ngày thử nghiệm
Sau 60 ngày thử nghiệm, tổng số lượng bạch cầu của lơ thử và lơ chứng khác nhau khơng cĩ ý nghĩa Về cơng thức bạch cầu, tỉ lệ phần trăm các loại bạch cầu trung
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Chứng M04 M05 M06
chứng M04 M05 M06
(n=12) (n=10) (n=10) (n=6)
Trang 6tính (neutrophile), ưa acid (eosinophile), ưa base (basophile) và lympho (lymphocyte) thay đổi cĩ ý nghĩa thống kê so với lơ chứng và vẫn nằm trong giới hạn bình thường Bạch cầu đơn nhân trung tính (monocyte) tăng cao bất thường (gấp 20 lần và hơn 4 lần so với tỉ lệ này ở lơ chứng) ở 3/10 chuột sử dụng thuốc thử M05 và hầu hết chuột lơ sử dụng thuốc thử M04 cĩ sự gia tăng gấp 1,5 – 2 lần
tỉ lệ bạch cầu đơn nhân trung tính so với chuột ở lơ chứng Số lượng bạch cầu đơn nhân tăng trong các trường hợp cĩ viêm xảy ra hoặc cĩ khả năng tăng tạo các tế bào tạo máu Tuy nhiên, tất cả sự gia tăng này đều nằm trong khoảng giá trị bình thường được báo cáo được ghi nhận ở chuột nhắt ngoại trừ 01 chuột dung thuốc M05
2.1.3 Các chỉ số của tiểu cầu
B ng 3 Các ch s ti u c u c a lơ ch ng và lơ th ểu cầu của lơ chứng và lơ thử ầu của lơ chứng và các lơ thử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ủa lơ chứng và các lơ thử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ứng và các lơ thử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ử (Số trung bình ± Sai số chuẩn
Chỉ số
Thử
M04
0,0978
0,0520
0,268 M05
M06
5,1667 ± 0,0919
0,0416
0,301 (*) p<0,05, khác cĩ ý nghĩa thống kê so với lơ chứng
0
200
400
600
800
1000
Chứng M04 M05 M06
chứng M04 M05 M06 (n=12) (n=10) (n=10) (n=6) Hình 3 Số lượng tiểu cầu của lơ chứng và các lơ thử M04, M05 và M06 sau 60
ngày thử nghiệm
Trang 7Sau 60 ngày số lượng tiểu cầu của chuột ở lơ thử M04, M06 cĩ gia tăng so với lơ chứng, và giảm ở lơ thử M05 so với lơ chứng Tuy nhiên, sự thay đổi tiểu cầu của chuột ở các lơ thử nghiệm M04, M05 và M06 khác khơng cĩ ý nghĩa thống kê so với lơ chứng và vẫn nằm trong giới hạn bình thường
2.2 Khảo sát các chỉ số sinh hĩa
Xét nghiệm các chỉ số sinh hĩa được thực hiện trên 15 chuột lơ chứng và 10 chuột
lơ thử
2.2.1 Các chỉ số sinh hĩa men gan
B ng 4 Các ch s sinh hĩa v t n th ng t bào gan và gan m t.ề tổn thương tế bào gan và gan mật ổn thương tế bào gan và gan mật ương tế bào gan và gan mật ế bào gan và gan mật ật
Chỉ
số
Lơ
SGOT
Thử
36,5
74,1 ± 12,1
0,2300 ± 0,0153
0,1300 ±
Hình 4 Nồng độ men SGOT và SGPT của lơ chứng và các lơ thử sau 60 ngày thử nghiệm
0
50
100
150
200
250
300
Chứng M04 M05 M06
chứng M04 M05 M06
(n=15) (n=10) (n=10) (n=10)
*
0 20 40 60 80 100
Chứng M04 M05 M06
chứng M04 M05 M06
(n=15) (n=10) (n=10) (n=10)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Chứng M04 M05 M06
chứng M04 M05 M06
(n=15) (n=10) (n=10) (n=10)
Trang 8Hình 5.Nồng độ Bilirubin (tồn phần, trực tiếp, gián tiếp) của lơ chứng và lơ thử Sau 60 ngày thử nghiệm, nồng độ các men gan SGOT, SGPT, và các chỉ số của bilirubin của lơ thử M05 và M06 khơng khác so với lơ chứng cĩ ý nghĩa thống kê (p>0,05) Riêng lơ thử M04, nồng độ SGOT và SGPT đều tăng cao so với lơ chứng và sự gia tăng của SGOT mạnh hơn SGPT và khác cĩ ý nghĩa thống kê so với lơ chứng (p<0,05) Sự gia tăng của SGOT và SGPT lần lượt gấp khoảng 2 và 1,5 lần so với bình thường cho thấy cĩ khả năng xảy ra tình trạng viêm gan mạn
2.2.2 Các chỉ số sinh hĩa thận:
B ng 5 N ng đ Creatinin huy t thanh c a chu t lơ ch ng và các lơ th sau 60 ngày thế bào gan và gan mật ủa lơ chứng và các lơ thử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ứng và các lơ thử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ử (Số trung bình ± Sai số chuẩn nghi m.ệm
Chỉ số
Thử
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
Chứng M04 M05 M06
(n=15) (n=10) (n=10) (n=10)
**
**
Hình 6 Nồng độ creatinin huyết thanh của chuột lơ chứng và các lơ thử sau 60 ngày thử nghiệm
Sau 60 ngày thử nghiệm, nồng độ creatinin huyết thanh của các lơ chuột vẫn nằm trong khoảng giới hạn 0,5 – 0,8 mg/dl Tuy nhiên, nồng độ creatinin huyết thanh giảm ở chuột ở các lơ thử thuốc M04 và M06, cho thấy creatinin gia tăng đào thải
ra thận nhiều hơn so với bình thường (p> 0,01)
2.3 Giải phẫu bệnh gan, thận
2.3.1 Quan sát đại thể
Gan, thận, tim: láng, hồng, bình thường
Dạ dày ruột: bình thường, khơng phát hiện điểm xuất huyết
Trang 9Phổi: Trắng hồng, bình thường.
2.3.2 Kết quả khảo sát vi thể
Khảo sát vi thể tế bào gan, thận được tiến hành trên 10 chuột lô chứng và 10 chuột
ở mỗi lô thử M04, M05 và M06
- Lô chứng: tất cả các mẫu mô gan đều có tế bào gan, khoảng cửa ở gan có hình thái bình thường Không có hiện tượng hủy hoại tế bào gan
- Lô thử M05: 1/10 mẫu có mô gan bất thường, mô gan hiên diện nhiều ổ hoại tử quanh các tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy, một số nơi khoảng cửa thấm nhập nhiều
tế bào viêm hoại tử
- Các mẫu còn lại mô gan có cấu trúc bình thường
Tất cả mẫu mô thận của lô chứng và lô thử đều có cầu thận, ống thận và mô kẽ có hình thái bình thường
B ng 6 K t qu sinh thi t gan, th n c a chu t 2 lô.ế bào gan và gan mật ế bào gan và gan mật ật ủa lô chứng và các lô thử (Số trung bình ± Sai số chuẩn ở 2 lô
Bình
10)
M05 (n=
M06 (n=
Sự khác biệt về cấu trúc gan, thận giữa 2 nhóm được so sánh bằng phép Chi Square Test và Fisher’s Exact cho thấy khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p = 0,05)
Hình 7a Mô gan có cấu trúc bình
(1/10 M05) chuột thử
Trang 10Hình 7c Mô thận bình thường.
2.4 Sự thay đổi về thể trọng chuột
Bảng 7 Thể trọng trung bình của chuột ở 2 lô trong 60 ngày thử nghiệm
Bảng Kết quả theo dõi thể trọng trung bình chuột theo ngày
(n=40)
Lô thử
0,655
0,459
0,471 2,868
0,602 3,852
1,30
31,95*** ± 1,05
31,844*** ± 0,816
30,561*** ± 0,945
1,45
31,974** ± 0,884
38,00 ± 1,09 33,780* ±
0,880
Trang 115
10
15
20
25
30
35
40
45
ngày
0
ngày 5
ngày 10
ngày 15
ngày 20
ngày 25
ngày 30
ngày 35
ngày 40
ngày 45
ngày 50
ngày 55
ngày 60
chứng M04 M05 M06
Hình 8 Sự thay đổi thể trọng trung bình chuột ở 2 lô qua các ngày
Trọng lượng trung bình chuột giữa 2 lô được so sánh tại các khoảng thời điểm mỗi
5 ngày Chuột ở các lô chứng tăng trọng nhanh hơn các lô thử từ ngày 15 đối với mẫu thử M06, từ ngày 20 đối với mẫu thử M05 và ngày 25 đối với mẫu thử M04 Trong quá trình theo dõi, không có chuột chết không rõ nguyên nhân ở cả tất cả các lô
3 KẾT LUẬN:
Kết quả kiểm tra độc tính bán trường diễn:
- Ba mẫu thử thuốc diệt côn trùng bọ đậu đen M04, M05 và M06 sau 60 ngày thử nghiệm cho uống với liều lần lượt là 0,13 mg/kg; 0,14 mg/kg và 0,14 mg/
kg thể trọng chuột cho thấy không gây ra sự chết bất thường trong suốt quá trình thử nghiệm
- Quá trình sử dụng các thuốc thử làm chậm sự tăng trọng bình thường của chuột so với lô chứng lần lượt ở các giai đoạn sau 20 ngày, 15 ngày và 10 ngày dung thuốc
- Các thuốc thử không ảnh hưởng đến chức năng thận của chuột thử nghiệm, tuy nhiên các thuốc thử làm giảm nồng độ creatinine huyết thanh chuột so với bình thường, có thể do sự gia tăng thanh thải creatinine ở thận đối với hai thuốc M04 và M06
- Chức năng gan của chuột có bị ảnh hưởng đối với chuột khi cho sử dụng M04, đã làm tăng lượng men gan SGOT và SGPT cao gấp 2 lần và 1,5 lần so với bình thường
- Các thuốc thử không ảnh hưởng đến kết quả công thức máu của chuột về
số lượng hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu Riêng chuột sử dụng thuốc thử M04 có