luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ (tóm tắt )

TÓM TẮT LUẬN ÁN1. Tóm tắt mở đầu:Tên tác giả: Trần Cao SơnTên luận án:“Nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trongdược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ ”Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất. Mã số: 62 72 04 10Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Dược Hà Nội2. Nội dung bản tóm tắt2.1. Mục tiêu của luận án:Luận án có 3 mục tiêu:1. Xác định các HCBVTV thường được dùng tại một số vùng trồng dược liệu ở phía Bắc;2. Xây dựng và thẩm định một phương pháp phân tích đa d ư lượng HCBVTV trong dượcliệu và một số sản phẩm từ dược liệu;3. Sơ bộ đánh giá dư lượng HCBVTV trong một số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu.2.2. Phương pháp nghiên cứu2.2.1. Phương pháp khảo sát thực địa và lấy mẫuThực hiện khảo sát các HCBVTV đang được sử dụng phổ biến, nhằm xác định đối tượngnghiên cứu chứa nhiều nguy cơ nhiễm HCBVTV nhất. Công cụ: phiếu hỏi thiết kế sẵn gồm có phiếu khảo sát cơ sở cung ứng HCBVTV vàphiếu khảo sát việc sử dụng HCBVTV trong trồng cây thuốc, chè Địa phương thực hi ện khảo sát: Các địa phương được khảo sát bao gồm: Hà Nội, HưngYên, Nam Định, Thái Nguyên, Phú Thọ, Hà Giang. Việc khảo sát kết hợp với lấy mẫu tại các địa phương.2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Toàn bộ mẫu được xay nhỏ (đối với mẫu r ắn), lắc trộn đều (đốivới mẫu lỏng). Xử lý mẫu: Sử dụng phương pháp QuEChERS dựa trên việc chiết HCBVTV bằngacetonitril đã được ổn định pH bằng đệm acetat và tách khỏi nước có trong mẫu bằng phânbố lỏng lỏng nhờ muối magnesi sulfat (MgSO4). Dịch chiết được làm sạch bằng chiết phântán pha rắn (dSPE) để loại các acid hữu cơ, nước còn dư và các thành phần khác nhờ chấthấp phụ PSA, GCB và MgSO4. Dịch chiết được tách bằng sắc ký và phân tích bằng kỹ thuậtkhối phổ hai lần.2.2.3. Phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ2.2.3.1. LCMSMS Sử dụng sắc ký lỏng pha đảo với cột sắc ký XBridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5μm) của Waters, nhiệt độ cột: 30oC. Pha động gồm hai kênh A (acid acetic 0,1% trongnước) và B (methanol) với chế độ gradient, tốc độ dòng: 0,7 mLphút. Thể tích tiêm mẫu:10 μL.2 Khối phổ ba tứ cực với nguồn ESI(+). Mỗi HCBVTV lựa chọn 1 ion phân tử,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Trần Cao Sơn

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 62 72 04 10

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2015

Công trình được hoàn thành tại :

Trường Đại học Dược Hà Nội

Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

Người hướng dẫn khoa học

PGS TS Thái nguyễn Hùng Thu

TS Lê Thị Hồng Hảo

Phản biện 1 : ……… … Phản biện 2 : ……… ……… Phản biện 3 : ……… ………

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án

cấp Trường tổ chức tại Trường Đại học Dược Hà Nội

Vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia VN

Thư viện trường ĐH Dược HN

A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Tính cấp thiết của luận án

Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) đóng vai trò quan trọng để phòng trừ các loại dịch bệnh cho các sản phẩm nông nghiệp nói chung và dược liệu nói riêng Khi được sử dụng, HCBVTV có thể tồn lại trong sản phẩm Nếu lạm dụng hoặc sử dụng không đúng cách các loại HCBVTV làm cho tồn dư HCBVTV trong sản phẩm tăng cao, gây ra các tác dụng không mong muốn cho người sử dụng Việc xác định mức tồn dư HCBVTV trong dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu có ý nghĩa quan trọng để sàng lọc, loại bỏ các sản phẩm không đáp ứng được sự an toàn cho người sử dụng

Hiện nay, có hàng nghìn HCBVTV đang được sử dụng Các phương pháp phân tích do đó hướng đến xác định đồng thời nhiều HCBVTV cùng lúc Các phương pháp này được gọi là phân tích đa dư lượng Các phương pháp xác định HCBVTV trong dược liệu được quy định theo các dược điển hiện nay chỉ xác định được từng nhóm HCBVTV cụ thể, và chưa có các phương pháp để xác định các nhóm HCBVTV mới hiện nay

Phương pháp chiết QuEChERS (viết tắt của Quick, Easy, Cheap, Efficient, Rugged, Safe) phối hợp với kỹ thuật sắc ký khí và sắc ký lỏng khối phổ là một phương pháp đa dư lượng đã được nhiều nước chấp nhận làm phương pháp chuẩn để áp dụng phân tích HCBVTV trong rau quả Nhằm nghiên cứu xác định dư lượng HCBVTV trên dược liệu và các sản phẩm dược

liệu ở Việt Nam, luận án “Nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong một

số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ” đã được thực hiện

2 Mục tiêu của luận án

1 Xác định các HCBVTV thường được dùng tại một số vùng trồng dược liệu ở phía Bắc;

2 Xây dựng và thẩm định một phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV trong dược liệu và một số sản phẩm từ dược liệu;

3 Sơ bộ đánh giá dư lượng HCBVTV trong một số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu

Để đạt được mục tiêu đề ra, luận án được tiến hành với các nội dung sau:

Khảo sát thông qua phiếu hỏi, thực hiện tại một số địa phương có vùng trồng dược liệu ở miền Bắc:

- Loại HCBVTV được kinh doanh phổ biến

- Loại HCBVTV được sử dụng phổ biến trong trồng dược liệu

- Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng phương pháp QuEChERS

- Khảo sát các điều kiện phân tích HCBVTV bằng LC-MS/MS

- Khảo sát các điều kiện phân tích HCBVTV bằng GC-MS/MS

- Thẩm định phương pháp về tính chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại, độ thu hồi

Ứng dụng phương pháp để xác định HCBVTV trong các loại dược liệu tươi, dược liệu khô, các sản phẩm từ dược liệu gồm thực phẩm chức năng (TPCN) dạng viên, dạng trà hay dạng nước ép và chè xanh (khô)

3 Những đóng góp mới của luận án

3.1 Về tình hình sử dụng HCBVTV trong trồng cây thuốc

Luận án đã xác định được 75 loại HCBVTV với 39 hoạt chất được tiêu thụ tại các vùng trồng dược liệu ở các tỉnh phía Bắc Nhiều nhất là nhóm lân hữu cơ có 9 hoạt chất Có 23 hoạt chất được sử dụng trong trồng cây thuốc Một số địa phương người dân còn sử dụng các HCBVTV không rõ nguồn gốc

3.2 Về phương pháp xác định dư lượng HCBVTV

Về xử lý mẫu phân tích:

- Đã nghiên cứu và đưa ra quy trình chiết QuEChERS đồng thời với các HCBVTV nghiên cứu đối với các nền mẫu khác nhau bao gồm dược liệu tươi, dược liệu khô, TPCN có thành phần thảo dược và chè xanh (khô) Quy trình chiết theo QuEChERS có nhiều ưu điểm hơn các quy trình truyền thống trước đây và các quy trình theo dược điển Việt Nam: đó là sử dụng lượng dung môi ít hơn nên giảm các chi phí và giảm ảnh hưởng đến môi trường và sức khoẻ kiểm nghiệm viên, quá trình chiết nhanh hơn mà vẫn đảm bảo được độ chính xác theo yêu cầu

- Kết quả nghiên cứu cho thấy đối với các nền mẫu dược liệu khô, cần bổ sung thêm nước

và thực hiện xử lý mẫu ngay trong khoảng 15 phút vì kéo dài thời gian này hàm lượng các HCBVTV có xu hướng giảm trên các nền mẫu được nghiên cứu

- Sử dụng chất hấp phụ PSA và GCB trong xử lý mẫu là cần thiết GCB được thêm vào có vai trò loại các tạp chất chlorophill với lượng phù hợp là 7,5 mg, nhiều hơn sẽ làm giảm độ thu hồi của một số HCBVTV Lượng PSA sử dụng phù hợp là 40mg, không cần thiết phải dùng lượng lớn hơn

- Việc chiết sử dụng các hệ dung môi không dùng đệm, có dùng đệm acetat và có dùng đệm citrat cho thấy hệ dung môi dùng đệm acetat cho độ thu hồi tốt hơn đối với nhiều HCBVTV Đệm acetat cũng phù hợp hơn với thiết bị LC-MS/MS

- Lần đầu tiên chì acetat được sử dụng trong quá trình chiết QuEChERS nhằm loại tannin trong mẫu chè Lượng muối chì acetat cho hiệu quả nhất là 1,5g

- Sử dụng việc xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu cũng như dùng nội chuẩn đã giúp giảm ảnh hưởng của các nền mẫu dưới 20%

Điều kiện phân tích:

- Đã xác định được các điều kiện để phân tích đồng thời 25 HCBVTV bằng LC-MS/MS Tổng thời gian phân tích trên thiết bị là 15 phút Mỗi HCBVTV đã xác định được 1 ion phân

tử và 2 ion sản phẩm đặc trưng nên phương pháp có tính đặc hiệu cao đối với mỗi HCBVTV Trong số 25 HCBVTV phân tích bằng LC-MS/MS, có nhiều HCBVTV chưa từng được báo cáo trước đây tại Việt Nam

- Đã xác định được các điều kiện để phân tích đồng thời 7 HCBVTV bằng GC-MS/MS Phương pháp sử dụng chế độ MS/MS nên rất đặc hiệu đối với các HCBVTV nghiên cứu

Về kết quả thẩm định phương pháp:

- Phương pháp đã được thẩm định trên các nền mẫu dược liệu tươi, dược liệu khô, TPCN

có thành phần thảo dược và chè về các tiêu chí độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại và độ thu hồi Phương pháp có độ nhạy tốt với giới hạn định lượng của tất cả các HCBVTV nghiên cứu trên các nền mẫu nghiên cứu đều thấp hơn mức tồn dư tối đa (MRL=0,01 mg/kg)

3.3 Về dư lượng HCBVTV trong dược liệu và sản phẩm dược liệu

- Đã xác định dư lượng của 32 HCBVTV trên nhiều loại dược liệu và sản phẩm từ dược liệu khác nhau Trong đó, đây là lần đầu tiên dư lượng các nhóm HCBVTV neonicotinoid và macrocyclic lacton được triển khai xác định ở Việt Nam

- Các nền mẫu chè xanh (khô) và chè túi lọc (thảo dược) có tỷ lệ nhiễm HCBVTV rất cao; lần lượt chiếm 50% và 40% số lượng mẫu phân tích

4 Ý nghĩa của luận án

- Phương pháp xác định đa dư lượng HCBVTV trong dược liệu và sản phẩm dược liệu được áp dụng nhằm góp phần giám sát, kiểm tra mức độ tồn dư các HCBVTV trong các sản phẩm này Các kết quả kiểm nghiệm này sẽ góp phần quan trọng để loại bỏ những sản phẩm không đảm bảo an toàn cho sức khỏe người sử dụng

- Phương pháp đã được xây dựng và thẩm định chặt chẽ trong điều kiện trang thiết bị Việt Nam có thể sử dụng là tài liệu tham khảo quan trọng của các PTN trong nước và quốc tế Phương pháp có thể được áp dụng tại các phòng thí nghiệm được trang bị hệ thống sắc ký khí khối phổ hoặc sắc ký lỏng khối phổ Năm 2012, phương pháp đã được đào tạo chuyển giao cho 20 học viên từ các trung tâm kiểm nghiệm an toàn thực phẩm nhằm kiểm nghiệm dư lượng HCBVTV trong các sản phẩm nông nghiệp và các sản phẩm thực phẩm chức năng

- Dư lượng HCBVTV trong một số đối tượng dược liệu và sản phẩm từ dược liệu đã được xác định Các kết quả cho thấy vẫn còn tỷ lệ lớn dược liệu và sản phẩm dược liệu có chứa dư lượng HCBVTV Đây là cơ sở để tăng cường quản lý sát sao hơn nữa, tăng cường các biện pháp giám sát, hậu kiểm để nâng cao chất lượng các sản phẩm Việc tồn tại hàm lượng khá lớn các HCBVTV trong các sản phẩm cho thấy cần có nhiều hơn nữa các quy định về giới hạn tồn dư tối đa của HCBVTV trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu

5 Bố cục của luận án

Luận án gồm 4 chương, 43 bảng, 40 hình, 140 tài liệu tham khảo với 27 tài liệu tiếng Việt

và 113 tài liệu tiếng Anh, 7 phụ lục Luận án có 142 trang gồm các phần chính: Đặt vấn đề (2 trang); Chương 1: Tổng quan (46 trang); Chương 2: Đối tượng, phương tiện và phương pháp nghiên cứu (14 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (58 trang); Chương 4: Bàn luận (22 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang)

B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Đã tập hợp và trình bày có hệ thống các kết quả nghiên cứu từ trước đến nay ở Việt Nam

và trên thế giới về xác định đa dư lượng HCBVTV trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu, trong đó đi sâu giới thiệu về phương pháp chiết QuEChERS và các kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần và sắc ký khí khối phổ hai lần

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu gồm 32 HCBVTV thuộc các nhóm khác nhau

Đối tượng phân tích là các dược liệu và sản phẩm dược liệu sau:

- Dược liệu tươi: mã đề (Plantago major) và bồ công anh Việt Nam (Pterocypsela indica)

được sử dụng để xây dựng và thẩm định phương pháp Ứng dụng phương pháp để phân tích HCBTVTV trên 22 dược liệu tươi

- Dược liệu khô: dây thìa canh (Gymnema sylvestre) và lá giang (Aganonerion

polymorphum) được sử dụng để xây dựng và thẩm định phương pháp Ứng dụng

phương pháp để phân tích HCBVTV trên 30 dược liệu khô

- TPCN có thành phần thảo dược: Mẫu trà túi lọc (trà mướp đắng) được sử dụng để khảo

sát và xây dựng phương pháp Áp dụng phương pháp trên 140 mẫu bao gồm 3 nhóm mẫu: dạng viên, dạng trà và dạng nước ép

- Chè xanh (khô): Mẫu chè xanh khô (Camellia sinensis) được sử dụng để khảo sát và

xây dựng phương pháp Áp dụng để phân tích trên 20 mẫu chè

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn

- Hóa chất thuốc thử: Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu thuộc loại tinh khiết phân tích, bao gồm methanol, acetonitril, acid acetic, magnesi sulfat, natri acetat, PSA, GCB

- Chất chuẩn 32 HCBVTV của Sigma-aldrich hoặc của Dr Erhenstorsfer có độ tinh khiết trên 95%

- Chất chuẩn nội TPP (triphenyl phosphat)

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị, máy phân tích tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia được hiệu chuẩn theo qui định của ISO/IEC 17025 gồm: Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) của ABSciex, hệ thống sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS) của Agilent, cân phân tích XT22A (độ chính xác 0,1 mg) của Precisa, máy ly tâm Z383K của Hermle và các trang thiết bị, dụng cụ khác của phòng thí nghiệm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp khảo sát thực địa và lấy mẫu

Thực hiện khảo sát các HCBVTV đang được sử dụng phổ biến, nhằm xác định đối tượng nghiên cứu chứa nhiều nguy cơ nhiễm HCBVTV nhất

- Công cụ: phiếu hỏi thiết kế sẵn gồm có phiếu khảo sát cơ sở cung ứng HCBVTV và phiếu khảo sát việc sử dụng HCBVTV trong trồng cây thuốc, chè

- Địa phương thực hiện khảo sát: Các địa phương được khảo sát bao gồm: Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Thái Nguyên, Phú Thọ, Hà Giang

- Việc khảo sát kết hợp với lấy mẫu tại các địa phương

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu

- Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Toàn bộ mẫu được xay nhỏ (đối với mẫu rắn), lắc trộn đều (đối với

mẫu lỏng)

- Xử lý mẫu: Sử dụng phương pháp QuEChERS dựa trên việc chiết HCBVTV bằng

acetonitril đã được ổn định pH bằng đệm acetat và tách khỏi nước có trong mẫu bằng phân bố lỏng lỏng nhờ muối magnesi sulfat (MgSO4) Dịch chiết được làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn (d-SPE) để loại các acid hữu cơ, nước còn dư và các thành phần khác nhờ chất hấp phụ PSA, GCB và MgSO4 Dịch chiết được tách bằng sắc ký và phân tích bằng kỹ thuật khối phổ hai lần

2.3.3 Phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ

2.3.3.1 LC-MS/MS

- Sử dụng sắc ký lỏng pha đảo với cột sắc ký XBridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5 µm) của Waters, nhiệt độ cột: 30oC Pha động gồm hai kênh A (acid acetic 0,1% trong nước)

và B (methanol) với chế độ gradient, tốc độ dòng: 0,7 mL/phút Thể tích tiêm mẫu: 10 µL

- Khối phổ ba tứ cực với nguồn ESI(+) Mỗi HCBVTV lựa chọn 1 ion phân tử, bán phá và lựa chọn 2 ion sản phẩm để định lượng và xác nhận

2.3.3.2 GC-MS/MS

- Sử dụng cột sắc ký DB5-MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 μm) với nhiệt độ buồng bơm mẫu:

250oC, chế độ tiêm mẫu không chia dòng Khí mang heli, tốc độ dòng 0,8 mL/phút Chương trình nhiệt độ: 60oC (giữ trong 2 phút), tăng 20oC /phút lên 180oC (0 phút), sau đó tăng 4oC /phút lên 260oC (giữ trong 2 phút) Nhiệt độ bộ phận kết nối sắc ký khí và khối phổ: 280oC

- Bộ tiêm mẫu tự động CTC-Pal với thể tích tiêm mẫu 1 µL

- Khối phổ ba tứ cực với nguồn ion hoá: EI 70 eV, nhiệt độ nguồn Ion: 230oC, cắt dung môi 5 phút Phân tích ở chế độ MRM với 1 ion phân tử và 2 ion sản phẩm cho mỗi HCBVTV

2.3.4 Phương pháp thẩm định

Thẩm định các thông số cơ bản của phương pháp bao gồm

2.3.4.1 Độ chọn lọc

Đánh giá tính chọn lọc theo hai phương pháp:

- Phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Mẫu trắng không được cho tín hiệu, trong khi mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu tương đồng với mẫu chuẩn

- Đánh giá điểm xác nhận và tỷ lệ ion theo tiêu chuẩn châu Âu EC 657/2002

2.3.4.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

LOD và LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio) dựa vào phần mềm của thiết bị

- LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3)

- LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10)

2.3.4.3 Khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Xác định sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ cho đến khi không còn tuyến tính

Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích

2.3.4.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ thực hiện 6 lần

Độ thu hồi còn được xác định trên nền mẫu thực bằng cách thêm chuẩn trên nền mẫu đã được xác định là có HCBVTV và xác định độ thu hồi

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Khảo sát tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc

3.1.1 Nguồn cung hóa chất bảo vệ thực vật

3.1.1.1 Kiến thức và thực hành kinh doanh HCBVTV

Trong số 19 cơ sở, có 15 cơ sở có giấy đăng ký buôn bán thuốc bảo vệ thực vật 4 cơ sở không có giấy phép kinh doanh 63% số nhân viên kinh doanh của cơ sở buôn bán HCBVTV đều không được đào tạo chuyên ngành về HCBVTV hay có chứng chỉ đào tạo ngắn hạn về HCBVTV Có khoảng 50% các cơ sở và nhân viên kinh doanh chưa tiếp cận các danh mục HCBVTV được phép sử dụng, cấm sử dụng và hạn chế sử dụng do các danh mục này không sẵn có tại nơi bán

3.1.1.2 Các HCBVTV được buôn bán phổ biến

Hầu hết các HCBVTV được bán tại các cơ sở đều nằm trong danh mục cho phép sử dụng ở Việt Nam, chỉ có 2 HCBVTV nằm trong danh mục HCBVTV hạn chế sử dụng ở Việt Nam (hoạt chất là carbofuran và kẽm phosphid) Trong số 75 HCBVTV được kinh doanh, có 9 HCBVTV gồm hai thành phần và 2 HCBVTV gồm 3 thành phần Đa số các HCBVTV được

sử dụng để trừ sâu hại, các HCBVTV khác được sử dụng để trừ cỏ và trừ nấm Ngoài ra, có một số HCBVTV không rõ nguồn gốc vẫn được người dẫn sử dụng

Tổng số hoạt chất là 39 hoạt chất trong đó nhóm phosphor hữu cơ là nhóm HCBVTV có nhiều hoạt chất và tên thương mại được sử dụng nhất (9 hoạt chất chiếm 23% và 20 tên thương mại chiếm 51%) Nhóm pyrethroid tuy chỉ có 3 hoạt chất được sử dụng nhưng có thành phần cypermethrin được sử dụng rất phổ biến (9 tên thương mại) Bên cạnh đó, nhóm

neonicotinoid cũng là nhóm HCBVTV được kinh doanh rất phổ biến với 2 hoạt chất chính là imidacloprid và acetamiprid

3.1.2 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc tại Hà Nội và một số vùng lân cận

Tại thời điểm khảo sát, tại xã Tân Quang (Văn Lâm, Hưng Yên) có 17 loại cây thuốc; trong khi tại xã Bình Minh (Khoái Châu, Hưng Yên) có 15 loại cây thuốc được trồng Trong khi đó, tại các cơ sở bán buôn bán lẻ dược liệu ở Ninh Hiệp và Lãn Ông (Hà Nội), hầu như có thể mua được các loại dược liệu khác nhau Ở Hải Hậu (Nam Định) một số địa phương áp dụng

mô hình GACP theo hợp tác với các công ty Dược để trồng cây thuốc như dây thìa canh, đinh lăng Ngoài ra, vùng trồng chè xanh ở Tân Cương (Thái Nguyên) cũng đã được khảo sát Qua khảo sát ở các địa phương nói trên, đa số các loại cây thuốc được trồng thuộc loại thân thảo hoặc dây leo, giống cây ngắn ngày và bộ phận sử dụng là phần trên mặt đất

Có nhiều loại HCBVTV đã được sử dụng trong trồng cây thuốc, tuỳ thuộc vào loại cây thuốc và mục đích Có 21/28 loại thuốc (75%) các loại HCBVTV là thuốc dùng để diệt trừ sâu, trong đó một số hoạt chất thường được sử dụng là cypermethrin, chlorpyrifos, abamectin, emamectin, imidacloprid, acetamiprid…

3.2 Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu

3.2.1 Xây dựng các điều kiện sắc ký khối phổ

3.2.1.1 Điều kiện sắc ký lỏng khối phổ

Trong nghiên cứu này, cột pha đảo XBridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5µm) (Waters, Mỹ) được sử dụng để tách các HCBVTV Tiền cột XBridge C18 (20mm x 3,9 mm; 3,5 µm) (Waters, Mỹ) được sử dụng để bảo vệ cột Khảo sát và tối ưu chế độ gradient phù hợp để tách các HCBVTV với pha động gồm 2 kênh: A (acid acetic 0,1% trong nước) và B (methanol): Ban đầu 25% B đến 1 phút, tăng lên 90% từ 1-8 phút; giữ 90% B trong 4 phút và đưa về điều kiện ban đầu Tổng thời gian 15 phút

Sử dụng khối phổ ba tứ cực với nguồn ESI(+), tiêm dung dịch chuẩn của các HCBVTV để tối ưu hóa các điều kiện Lựa chọn 1 ion phân tử và hai ion sản phẩm cho mỗi HCBVTV Đã lựa chọn được các điều kiện tối ưu để phân tích 25 HCBVTV bao gồm: acetochlor, aldicarb, atrazin, azoxystrobin, abamectin, acetamiprid, carbaryl, carbofuran, carbendazim, carboxin, dichlorvos, dimethoat, edifenphos, emamectin, fenobucarb, imidacloprid, indoxacarb, isoprocarb, methiocarb, methomyl, profenofos, propoxur, tebuconazol, thiamethoxam và trichlorfon

Qua đánh giá độ lặp lại của thiết bị cho thấy hệ số biến thiên của diện tích píc dao động từ 1,9 đến 5,0% đáp ứng yêu cầu để ứng dụng phương pháp khối phổ (≤ 5%), trong khi hệ số biến thiên của thời gian lưu rất thấp (< 1%) cho thấy thiết bị có độ ổn định đáp ứng yêu cầu

3.2.1.2 Điều kiện sắc ký khí khối phổ

Các điều kiện về cột tách, pha động, điều kiện gradient nhiệt độ, thể tích tiêm mẫu đã được lựa chọn để phân tích đồng thời 7 HCBVTV Pha tĩnh với tính phân cực trung bình yếu ((5%-Phenyl)-methylpolysiloxan) đã được sử dụng: Cột DB5-MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 μm) Thời

gian lưu của các HCBVTV được khóa theo chương trình phụ thuộc áp suất Mỗi HCBVTV được lựa chọn ít nhất 1 ion phân tử và 2 ion sản phẩm để định lượng và xác nhận Các HCBVTV được phân tích bằng GC-MS/MS bao gồm Acephat, aldrin, chlorothalonil, chlorpyrifos, cypermethrin, endosulfan sulfat và permethrin

Qua đánh giá độ lặp lại của thiết bị cho thấy hệ số biến thiên của diện tích píc dao động từ 1,6 đến 4,5% đáp ứng yêu cầu để ứng dụng phương pháp khối phổ (≤ 5%), trong khi hệ số biến thiên của thời gian lưu rất thấp (< 1%) cho thấy thiết bị có độ ổn định đáp ứng yêu cầu

3.2.2 Xây dựng quy trình chiết hóa chất bảo vệ thực vật từ một số dược liệu và sản phẩm dược liệu

3.2.2.1 Nền mẫu dược liệu tươi

- Lựa chọn dung môi chiết: So sánh 3 quy trình phân tích sử dụng các dung môi acetonitril (quy trình 1), acetonitril với đệm citrat (quy trình 2) và acetonitril với đệm citrat (quy trình 3) Các kết quả cho thấy hầu hết các HCBVTV cho hiệu suất cao hơn khi xử lý bằng quy trình 2, chỉ có azoxystrobin và edifenphos cho hiệu suất cao với quy trình 1 và có 3 chất cho hiệu suất cao với quy trình 3 (imidachloprid, aldicarb, abamectin) Đa số các chất cho hiệu suất cao trên 60% khi phân tích bằng quy trình 2 Do đó, quy trình 2 đã được lựa chọn để thực hiện các khảo sát tiếp theo

- Ảnh hưởng của GCB: GCB được thêm vào d-SPE để tăng khả năng loại tạp do GCB có khả năng hấp phụ các hợp chất hữu cơ có cấu trúc phẳng, các chất diệp lục Mẫu mã đề và bồ công anh được cho thêm chuẩn ở nồng độ 0,1 mg/kg (n = 2) và phân tích bằng hai quy trình Một quy trình không sử dụng GCB và một quy trình có thêm 7,5 mg GCB trong d-SPE Kết quả cho thấy khi sử dụng GCB dịch chiết đã được loại các chất diệp lục, trong khi độ thu hồi của các chất tương đương với khi không sử dụng GCB, một số chất có độ thu hồi cao hơn hẳn như imidachloprid, aldicarb, carboxin Do đó, việc sử dụng GCB trong bước chiết d-SPE với lượng 7,5 mg là cần thiết và phù hợp

3.2.2.2 Nền mẫu dược liệu khô

- Độ ẩm của mẫu khoảng 80% có thể cho hiệu suất chiết cao nhất khi xử lý bằng phương pháp QuEChERS Do đó, mẫu khô được bổ sung thêm nước với tỷ lệ mẫu:nước (1:5) và khảo sát thời gian ngâm mẫu trong nước Qua khảo sát cho thấy trong khoảng từ 0 đến 15 phút, thu được nồng độ các HCBVTV khảo sát là cao nhất Do đó nhằm tiết kiệm thời gian, không cần thiết phải thực hiện ngâm mẫu trong nước trước khi chiết

- Lựa chọn loại đệm chiết: Thực hiện so sánh 3 quy trình tương tự như mẫu dược liệu tươi Kết quả cho thấy trên nền mẫu dây thìa canh, pH của dịch chiết khá ổn định đối với cả 3 phương pháp; phương pháp không sử dụng đệm cho độ thu hồi tốt nhất Tuy nhiên, trên nền mẫu lá giang (pH acid), phương pháp không dùng đệm cho hiệu quả rất thấp, 20/25 HCBVTV phân tích có độ thu hồi dưới 70% Phương pháp dùng đệm citrat có độ thu hồi tốt hơn nhưng chưa đáp ứng được yêu cầu (14/25 HCBVTV có độ thu hồi dưới 70%) Phương pháp dùng đệm acetat cho pH ổn định nhất và độ thu hồi của các HCBVTV đều đáp ứng được yêu cầu Mặt khác do nền mẫu dược liệu đa dạng về tính acid base, do đó việc sử dụng đệm acetat là cần thiết

- Khảo sát muối chiết: Khảo sát bổ sung thêm NaCl nhằm tăng khả năng phân lớp giữa acetonitril với nước Các mức NaCl từ 0 g; 0,5 g; 1,0 g; 1,5 g và 2,0 g đã được khảo sát Việc

sử dụng NaCl trong muối chiết có ảnh hưởng đến độ thu hồi của phương pháp, lượng NaCl tốt nhất là từ mức 1,5 g Ngoài ra, khi tăng lượng NaCl thì pH của dịch chiết acetonitril giảm dần

từ 5,88 (0 g) đến 5,63 (1,5 g) và 5,50 (2 g); màu sắc dịch chiết cũng nhạt dần cho thấy NaCl

có vai trò quan trọng trong việc tách giữa hai pha nước và acetonitril Do đó, việc thêm NaCl vào muối chiết với khối lượng 1,5 g/15 mL dịch chiết acetonitril là cần thiết

3.2.2.3 Nền mẫu thực phẩm chức năng có thành phần dược liệu

- Lựa chọn loại đệm chiết: Thực hiện thí nghiệm tương tự như đối với nền mẫu dược liệu khô, so sánh 3 quy trình chiết QuEChERS không sử dụng đệm, dùng đệm acetat và dùng đệm citrat Theo kết quả thu được, hầu hết các chất đều cho hiệu suất cao hơn khi xử lý bằng quy trình 2 Kết quả này cũng phù hợp với hai nền dược liệu tươi và dược liệu khô Do đó quy trình 2 được chọn để thực hiện các khảo sát tiếp theo

- Khảo sát thành phần d-SPE: Khảo sát lượng PSA từ 20, 30, 40, 50, 60 mg và khảo sát lượng GCB từ 0; 5; 7,5 và 10 mg cho 1 mililit dịch chiết Các kết quả cho thấy, lượng PSA và GCB sử dụng có ảnh hưởng đến độ thu hồi của HCBVTV Lượng PSA và GCB tối ưu lần lượt là 40 mg và 7,5 mg

3.2.2.4 Nền mẫu chè

Nền mẫu chè có sự khác biệt so với các loại dược liệu khác do thành phần chè có nhiều hợp chất như cafein, polyphenol và đặc biệt là tannin có thể gây ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết Để loại các tạp chất, muối chì acetat ((CH3COO)2Pb) được thêm vào hỗn hợp muối chiết để kết tủa tannin, cafein Khảo sát các lượng muối chì acetat từ 0 đến 2,0 g Khi sử dụng chì acetat, hiệu suất chiết các HCBVTV đều tăng rõ rệt Càng tăng lượng muối sử dụng, hiệu suất chiết càng tăng Tuy nhiên, nếu lượng muối tăng quá 1,5 g cho thấy hiệu suất chiết giảm với đa số các HCBVTV nghiên cứu Do đó, lượng muối chì acetat được sử dụng trong quy trình xử lý mẫu này là 1,5 g

3.2.2.5 Đánh giá ảnh hưởng nền và vai trò của nội chuẩn

Để đánh giá ảnh hưởng nền, thực hiện so sánh hệ số góc của hai đường chuẩn xây dựng trên nền dung môi và trên nền mẫu trắng (mẫu trắng được chiết theo quy trình để thu lấy dịch chiết, sau đo pha chuẩn trên dịch chiết thu được) Đường chuẩn sử dụng gồm 5 điểm chuẩn có nồng độ là 5, 10, 50, 100 và 200 µg/mL Kết quả cho thấy ảnh hưởng của nền mẫu khá khác nhau tuỳ từng HCBVTV thực vật và tuỳ thuộc vào nền mẫu Do đó, đối với phương pháp phân tích đa dư lượng áp dụng trên nhiều đối tượng khác nhau thì cần phải có biện pháp để loại bỏ các ảnh hưởng nền này

Các kết quả cho thấy, nếu không sử dụng nội chuẩn ảnh hưởng nền khá lớn, có đến 14/25 hợp chất có ảnh hưởng nền lớn hơn ±20% Khi định lượng theo nội chuẩn ảnh hưởng nền giảm rõ rệt, 23/25 hợp chất có ảnh hưởng nền nằm trong khoảng 20%, trong đó có khoảng 50% số chất có ảnh hưởng nền thấp dưới 5% Trên nền mẫu chè, ảnh hưởng nền cũng thấp khi

sử dụng nội chuẩn Do đó, việc sử dụng nội chuẩn rất cần thiết nhằm loại trừ các sai số do nền mẫu

3.2.3 Thẩm định các phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong một số dược liệu và sản phẩm dược liệu

3.2.3.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc

Thực hiện phân tích các mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Thời gian lưu của các HCBVTV trên nền mẫu thêm chuẩn hoàn toàn giống với trên mẫu chuẩn, không xuất hiện pic

ở mẫu trắng ở khoảng thời gian của các píc nói trên

Hơn nữa, với mỗi chất phân tích đều có hai ion sản phẩm dùng để định tính và định lượng

do đó sự có mặt của HCBVTV được chắc chắn thêm nhờ vào tỷ lệ các ion Theo yêu cầu của các tổ chức phân tích trên thế giới như AOAC, Châu Âu, tỷ lệ của ion xác nhận chia cho ion định lượng thu được trên mẫu không được sai khác quá một mức cho phép nhất định Nghiên cứu này đã xác định được tỷ lệ ion của các HCBVTV nghiên cứu Như vậy, tính chọn lọc của phương pháp được đảm bảo ở mức cao

3.2.3.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Đường chuẩn được chuẩn bị trên nền mẫu để loại trừ ảnh hưởng nền Mẫu trắng được chiết theo quy trình để thu lấy dịch chiết, pha dung dịch chuẩn trên dịch chiết ở các nồng độ 0; 2; 10; 20; 50; 100 và 200 ng/mL Nồng độ nội chuẩn giữ cố định là 100 ng/mL Các mẫu trắng được sử dụng gồm có dược liệu tươi (mã đề), dược liệu khô (dây thìa canh), TPCN (dạng viên

và dạng trà thảo dược) và mẫu chè búp Thái Nguyên

Các đường chuẩn xây dựng đều có hệ số tương quan trên 0,99 và độ chệch của các điểm nhỏ hơn 15% (nhỏ hơn 20% tại nồng độ thấp nhất) do đó trong khoảng nồng độ từ 2 đến 200

ng/mL có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ tương ứng Khoảng nồng độ

này đã bao trùm được giá trị MRL của các HCBVTV do đó đáp ứng được yêu cầu ứng dụng trong thực tế Trong nghiên cứu này, các nồng độ cao hơn không được khảo sát; đối với các mẫu có nồng độ cao hơn 200ng/mL, tiến hành pha loãng mẫu trước khi phân tích

3.2.3.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ thấp (5 và 10 µg/kg tính trên mẫu; tương đương 1-2 µg/L trên dịch chiết) và xác định giá trị S/N Dựa vào S/N để ước lượng các giá trị LOD, LOQ Các kết quả cho thấy, đối với LC-MS/MS tất cả các chất có thể định lượng trên tất cả các nền mẫu nghiên cứu tại nồng độ thấp hơn hoặc bằng giá trị MRL (10 µg/kg hay 0,01 mg/kg) LOD của các hợp chất trên thiết bị LC-MS/MS tốt hơn so với thiết bị GC-MS/MS

3.2.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở ba mức nồng độ 2; 20 và 200 ng/mL đại diện cho ddierm đầu, giữa và cuối khoảng tuyến tính, phân tích lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ (n = 6) Nồng độ tính tương đương trên mẫu cụ thể như sau:

- Đối với mẫu dược liệu tươi: 0,002; 0,02 và 0,2 mg/kg

- Đối với mẫu dược liệu và sản phẩm dược liệu khô: 0,01; 0,1 và 1 mg/kg

Các kết quả cho thấy CV% và R% dao động tuỳ từng HCBVTV và tùy từng loại nền mẫu;

đa số các trường hợp đều có CV% dưới 15% và R% trong khoảng 80-110% Điều này khẳng định phương pháp có độ lặp lại và độ thu hồi tốt, đáp ứng yêu cầu hiện nay của AOAC

Ngoài ra, để đánh giá độ thu hồi, thực hiện thêm chuẩn trên nền mẫu thực (mẫu đã phát hiện có HCBVTV) gồm trinh nữ hoàng cung, cỏ ngọt, mã đề Thêm các chuẩn của các HCBVTV đã được phát hiện vào mẫu, phân tích lặp lại 3 lần đối với cả mẫu trắng và mẫu thêm Độ thu hồi đạt được trên nền mẫu thực khá tốt, tất cả các kết quả đều trên 70% với các khoảng nồng độ thêm chuẩn khác nhau từ 0,05 đến 0,5 mg/kg

3.3 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trên một số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu

3.3.1 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu tươi

Dược liệu tươi được lấy tại vườn của một số vùng trồng dược liệu ở Hà Nội và Hưng Yên Thời điểm lấy mẫu là ngay giai đoạn thu hoạch hoặc sau khi vừa thu hoạch xong Số lượng mẫu đã lấy gồm 22 loại dược liệu, trong đó chủ yếu là các loại dược liệu lấy lá Các kết quả cho thấy có 8/22 mẫu (khoảng 36%) đã được phát hiện có HCBVTV vượt MRL (0,01 mg/kg) Carbendazim và azoxystrobin là các HCBVTV được phát hiện nhiều nhất trong 3 mẫu và carbendazim cũng là hợp chất có hàm lượng cao nhất (0,39 mg/kg)

3.3.2 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu khô

Các mẫu được liệu khô được lấy tại 3 địa điểm, với tổng số mẫu là 30 mẫu Đa số các mẫu dược liệu đều không có nguồn gốc, được bày bán tại chợ thuốc Ninh Hiệp (Hà Nội) và các quầy thuốc đông y tại Lãn Ông (Hà Nội) Một số mẫu được lấy ở Hải Hậu (Nam Định) trong

đó gồm các mẫu được công ty dược đặt hàng sản xuất (dây thìa canh, đinh lăng) Trong số 30 mẫu dược liệu được phân tích có 7 mẫu (khoảng 23%) có chứa HCBVTV, trong đó tần suất xuất hiện lớn nhất là các HCBVTV nhóm neonicotinoid với 4/7 mẫu Các mẫu dược liệu được sản xuất theo tiêu chuẩn GACP đều không phát hiện thấy HCBVTV

3.3.3 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong thực phẩm chức năng có thành phần thảo dược

- Tổng số mẫu được phân tích: 140 mẫu trong đó số mẫu phát hiện HCBVTV (nồng độ trên 0,01 mg/kg): 41 mẫu chiếm 29,3%

- Các HCBVTV phát hiện và số lượng như sau: chlorpyrifos: 12 mẫu, imidacloprid: 8 mẫu, cypermethrin: 7 mẫu, permethrin: 6 mẫu, acetamiprid: 6 mẫu, carbofuran: 5 mẫu, fenobucarb:

4 mẫu, azoxystrobin: 3 mẫu, dimethoat: 2 mẫu, abamectin: 2 mẫu, endosulfan sulfat: 2 mẫu

và trichlorfon: 1 mẫu Trong đó, riêng hợp chất endosulfan sulfat là HCBVTV nhóm clor hữu

cơ đã bị cấm sử dụng nhiều năm nay nhưng vẫn có mặt trong 2 mẫu với hàm lượng là 0,033