TÀI LIỆU CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHƯƠNG I : CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG TRỒNG TRỌTI. ĐẶC ĐIỂM CỦA THỰC VẬT LIÊN QUAN ĐẾN CNSH 1. TBTV có tính toàn năng.Cơ sở của sự phân hóa và phản phân hóa tế bào là tính toàn năng của tế bào. Mỗi một tế bào đã chuyên hóa chứa một lượng thông tin di truyền (bộ AND) tương đương với một cơ thể trưởng thành để trong điều kiện nhất định tế bào đó có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào.Như vậy bất cứ một tế bào nào cũng có thể thành một cây hoàn chỉnh và đó cũng là cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy in vitro, kỹ thuật nhân bản ở thực vật. Về mặt di truyền phân tử có thể nói rằng toàn bộ quá trình phát triển cá thể của cây từ hợp tử cho đến khi cây chết ở tuổi tối đa đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử AND đặc trưng cho loài. Đời sống của cây là quá trình thực hiện dần dần chương trình di truyền đó mà thôi. Dưới sự thay đổi và tác động của điều kiện nội tại và ngoại cảnh mà các chương trình di truyền đó dần được biểu hiện bằng sự phát sinh hình thái. 2.TBTV có màng celluloseMàng cellulose chỉ có ở tế bào thực vật, là màng bảo vệ, còn gọi là vách tế bào. Trước đây người ta cho vách tế bào là một cấu trúc không sống.Nay, thành phần hóa học của màng bảo vệ đã được phân tích, khá phức tạp, nước chiếm 60% được chứa trong các khoảng tự do của màng, 30% cellulose, các sợi cellulose liên kết với nhau tạo thành các mixen (khoảng 100 sợi cellulose bện lại với nhau tạo nên một mixen với kích thước 5nm, cứ 20 mixen kết với nhau lại tạo nên một sợi bé (microfibrin) với kích thước khoảng 10 20 nm, và cứ 250 sợi bé lại tạo nên sợi lớn (macrofibrin). Các sợi đan chéo với nhau theo nhiều hướng làm cho màng cellulose rất bền vững, nhưng lại có khả năng đàn hồi. Ở giữa các sợi là khối không gian chứa các chất vô định hình gồm hemicellulose, pectin và nước. Nhờ cấu trúc trên, màng cellulose vừa bền vừa mềm dẻo thích ứng với chức năng bảo vệ của nó. Màng này đã giúp cho tế bào có hình dạng ổn định. Các tia sinh chất của màng và các enzyme trên màng tạo ra những phản ứng tương hỗ phức tạp tham gia vào việc phân giải các chất khó tan thành chất dễ tan, hoặc chúng là chất xúc tác của phản ứng giữa môi trường và tế bào.

CHƯƠNG I : CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG TRỒNG TRỌT I. ĐẶC ĐIỂM CỦA THỰC VẬT LIÊN QUAN ĐẾN CNSH 1. TBTV có tính toàn năng. Cơ sở của sự phân hóa và phản phân hóa tế bào là tính toàn năng của tế bào. Mỗi một tế bào đã chuyên hóa chứa một lượng thông tin di truyền (bộ AND) tương đương với một cơ thể trưởng thành để trong điều kiện nhất định tế bào đó có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào.Như vậy bất cứ một tế bào nào cũng có thể thành một cây hoàn chỉnh và đó cũng là cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy in vitro, kỹ thuật nhân bản ở thực vật. Về mặt di truyền phân tử có thể nói rằng toàn bộ quá trình phát triển cá thể của cây từ hợp tử cho đến khi cây chết ở tuổi tối đa đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử AND đặc trưng cho loài. Đời sống của cây là quá trình thực hiện dần dần chương trình di truyền đó mà thôi. Dưới sự thay đổi và tác động của điều kiện nội tại và ngoại cảnh mà các chương trình di truyền đó dần được biểu hiện bằng sự phát sinh hình thái. 2.TBTV có màng cellulose Màng cellulose chỉ có ở tế bào thực vật, là màng bảo vệ, còn gọi là vách tế bào. Trước đây người ta cho vách tế bào là một cấu trúc không sống.Nay, thành phần hóa học của màng bảo vệ đã được phân tích, khá phức tạp, nước chiếm 60% được chứa trong các khoảng tự do của màng, 30% cellulose, các sợi cellulose liên kết với nhau tạo thành các mixen (khoảng 100 sợi cellulose bện lại với nhau tạo nên một mixen với kích thước 5nm, cứ 20 mixen kết với nhau lại tạo nên một sợi bé (microfibrin) với kích thước khoảng 10- 20 nm, và cứ 250 sợi bé lại tạo nên sợi lớn (macrofibrin). Các sợi đan chéo với nhau theo nhiều hướng làm cho màng cellulose rất bền vững, nhưng lại có khả năng đàn hồi. Ở giữa các sợi là khối không gian chứa các chất vô định hình gồm hemicellulose, pectin và nước. Nhờ cấu trúc trên, màng cellulose vừa bền vừa mềm dẻo thích ứng với chức năng bảo vệ của nó. Màng này đã giúp cho tế bào có hình dạng ổn định. Các tia sinh chất của màng và các enzyme trên màng tạo ra những phản ứng tương hỗ phức tạp tham gia vào việc phân giải các chất khó tan thành chất dễ tan, hoặc chúng là chất xúc tác của phản ứng giữa môi trường và tế bào. 3. Sinh trưởng của tế bào mô thực vật Sự sinh trưởng và sự phân hóa của tế bào :Sự sinh trưởng và phá triển của cơ thể thực vật cũng như của các mô, cơ quan gắn liền với sự sinh trưởng và phát triển của mỗi tế bào. Tế bào thực vật được hình thành bằng con đường phân chia trong các mô chuyên hóa gọi là mô phân sinh. Sau đó các tế bào tăng kích thước và thể tích nhanh chóng trong các vùng giãn và cuối cùng được phân hóa thành các mô chức năng đảm nhiệm các chức năng sinh lý riêng biệt gắn liền với sự thay đổi về cấu trúc đặc trưng cho các mô. Sự sinh trưởng của tế bào trải qua 3 pha: pha phân chia, pha lớn lên và pha phân hóa. 1. Pha phân chia tế bào : Sự sinh trưởng của tế bào bắt đầu bằng sự phân chia tế bào trong các mô chuyên hóa gọi là mô phânsinh. Sự phân chia tế bào xảy ra qua hai bước kế tiếp: Sự phân chia nhân (mitoz) trong đó có sự phân chia nhân thành hai nhân và sự phân bào (xytokinez) là sự phân chia tế bào hai nhân thành hai tế bào một nhân. Trước khi xảy ra phân chia nhân thì đòi hỏi nhân đôi lượng ADN của tế bào mẹ, tức là nhân đôi tất cả lượng thông tin di truyền mà tế bào mẹ vốn có. Chính vì vậy mà sự tổng hợp ADN xảy ra rất mạnh mẽ trong tế bào phôi sinh. Sau đó nhân được phân chia thành hai nhân.Giai đoạn tiếp theolà sự phân bào:Một màng mỏng polisaccarit xuất hiện ở giữa tế bào. Nguồn gốc của lớp màng tế bào nà là từ bộ máy Golgyl và Lưới nội chất. Lớp màng này nhanh chóng tăng trưởng để đạt đến thành tế bào chia đôi tế bào mẹ hai nhân thành hai tế bào con một nhân. Ðặc trưng chung của tế bào trong pha phân chia là tế bào bé, đồng nhất, có kích thước như nhau, thành tế bào mỏng, toàn bộ thể tích tế bào chứa chất nguyên sinh và nhân to, chưa xuất hiện không bào Điều kiện cần thiết . Ðể cho quá trình phân chia tế bào thuận lợi thì trước hết phải có phytohormone hoạt hóa sự phân chia tế bào, đó là cytokinine, ngoài các chất như auxin, giberellin cũng có vai trò kích thích nhất định sự phân chia tế bào. Sự có mặt xytokinin là điều kiện tiên quyết vì nó là hocmon hoạt hóa sự phân chia tế bào. Thuộc về điều kiện ngoại cảnh, trước hết là nước và nhiệt độ. Mô phân sinh bão hòa nước là điều kiện tối ưu cho sự phân chia tế bào. Nhiệt độ tối ưu khoảng 20-25 o C. Nếu gặp hạn và rét thì sự phân chia tế bào bị ức chế. 2. Pha lớn lên của tế bào: Ðây là giai đoạn tế bào tăng nhanh về kích thướcvà khốilượng. Ðặc trưng của pha này là bắt đầu xuất hiện không bào. Ban đầu không bào có kích thước nhỏ và số lượng nhiều. Sau đó các không bào nhỏ liên kết lạivớinhauthành không bào to hơn và các không bào tohơn tập hợp thành mộtkhônbào trung tâm duy nhất.Không bào trung tâm lớn nhanh và đẩy chất nguyên sinh và nhân ra sát thành tế bào. Kích thước của tế bào tăng lên rất nhanh chóng.: Sự giãn thành tế bào và sự tăng thể tích không bào và chất nguyên sinh gắn liền với quá trình sinh tổng hợp các vật liệu cần thiết cho xây dựng thành tế bào và chất nguyên sinh làm tb lớn lên. Ðiều kiện quan trọng nhất cho tế bào giãn được là sự có mặt của các phytohormone kích thích sự giãn của tế bào. Điều kiện cần cho sự dãn tế bào Trước hết phải có các chất hocmon kích thích sự dãn tế bào là auxin và Gb. Auxin kích thích tế bào dãn theo chiều ngang, còn Gb kích thích theo chiều dọc. Nếu thiếu cả hai hocmon này, tế bào không thể dãn được; còn thiếu một trong hai chất thì sự dãn của tế bào mất cân đối. Điều kiện ngoại cảnh quan trọng nhất là nước. Sự hấp thu nước thẩm thấu vào tế bào làm tăng sức trương (P) gây một sức đẩy lên thành tế bào giống như bơm không khí vào bóng cao su có ý nghĩa quyết định cho sự dãn của tế bào. Để ức chế pha dãn của tế bào, có thể sử dụng các chất trong nhóm retardant như CCC là chất kháng GA trong cây. CCC sẽ kìm hãm sự dãn của tế bào làm cây lùn, cứng cây và có thể chống đổ. Các yếu tố dinh dưỡng khoáng, đặc biệt là nitơ có ý nghĩa quan trọng trong việc tăng nhanh kích thước của tế bào… 3. Pha phân hóa của tế bào: Các tế bào sau khi hoàn thành pha giãn bằng các con đường khác nhau mà chúng phân hóa thành các tế bào của các loại mô thực hiện các chức năng sinh lý riêng biệt, cho nên về hình thái và cấu trúc của tế bào thay đổi nhiều. Sự phân hoá này nhờ một số gen ở bên trong tế bào quy định. Chẳng hạn một số tế mất hết chất nguyên sinh và hóa gỗ như tế bào của mô dẫn; Một số tế bào theo hướng giảm nhân và ty thể (tếbào rây); Một số tế bào theo hướng hình thành lục lạp (mô dậu) hoặc cutin hóa, suberin hóa (mô bì) Trong cây có khoảng 15 loại tế bào chuyên hóa của các mô chức năng, nhưng suy cho cùng thì chúng đều được phân hóa từ một tế bào khởi nguyên là hợp tử. Sở dĩ có sự phân hóa theo các đường hướng khác nhau để hình thành nên nhiều loại tế bào hoàn toàn khác nhau là do sự hoạt hóa phân hóa các gen vốn có trong mỗi tế bào, tức là quá trình mà một gen trước đây không hoạt động nay được hoạt hóa và đồng thời một sốgen đang hoạt động thì bị ức chế và ngừng hoạt động. Do đó sự phân hóa tế bào chỉ là sự hoạt hóa phân hóa gen mà không làm cho tế bào có thêm hoặc mất đi vốn gen của chúng. dậu) hoặc cutin hóa, suberin hóa (mô bì) Nhu cầu sinh thais của các pha khác nhau thì khác nhau, do đó cần thỏa mãn nhu cầu sinh thái cho tbao. * TBcó khả năng phân hóa và phản phân hóa. Sự phân hóa tế bào :Sự phân chia và dãn của tế bào là hai giai đoạn của sự sinh trưởng tế bào. Trong hai giai đoạn này, tế bào chưa có những đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng. Các tế bào gần như giống như nhau. Sau đó, các tế bào bắt đầu phân hóa thành các mô chuyên hóa đảm nhiệm các chức năng khác nhau. Các tế bào trong giai đoạn này đã có các đặc trưng khác nhau về cấu trúc và chức năng. Ví dụ: tế bào mô bì có ngấm cutin hay bần, sáp…làm nhiệm vụ che chở, mô dậu có chứa lục lạp và diệp lục làm nhiệm vụ che chở, mô dậu có chứa lục lạp và diệp lục làm nhiệm vụ quang hợp; một số tế bào mất chất nguyên sinh và hóa gỗ để làm nhiệm vụ dẫn truyền nước và chống đỡ…Trong cây có khoảng 15 loại mô chuyên hóa khác nhau nhưng chúng đều có nguồn gốc từ một tế bào hợp tử đầu tiên phân hóa thành. Có thể nói rằng sự phân hóa tế bào là sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hóa. Sự phản phân hóa tế bào :Sự phản phân hóa tế bào là quá trình diễn ra ngược với sự phân hóa tế bào. Các tế bào đã phân hóa trong các mô chức năng không mấ đi khả năng phân chia của mình mà trong các điều kiện nhất định chúng có thể quay trở lại đóng vai trò như mô phân sinh và có khả năng phân chia để cho ra các tế bào mới. Chẳng hạn như ta có thể lấy một mẫu mô nào đó của cây (đã phân hóa) cho vào nuôi cấy trong môi trường thích hợp, chúng lại phân chia để cho ra các tế bào mới hình thành mô sẹo rồi từ đấy phân hóa thành các cơ quan như rễ và chồi. Lúc giâm cành, chiết cành, từ các mô đã chuyên hóa khi được kích thích bằng cắt rời khỏi cơ thể mẹ, bằng khoanh vỏ, bằng xử lý hóa chất hay bó bầu…thì các tế bào đó quay trở lại phân chia mạnh mẽ để cho ea các tế bào mới là cơ sở của rễ mới. * vai trò của nuôi cấy mô tbao (sach) 4. Sinh sản của thực vật. sinh sản vô tính - bằng bào tử Là hình thức sinh sản có ở thực vật bào tử (ví dụ: dương xỉ). Vào thời kì trưởng thành, ở giai đoạn sinh sản vô tính, túi bào tử vỡ tung, giải phóng các bào tử ra ngoài. Khi gặp đất ẩm, các bào tử nàu nguyên phân nhiều lần liên tiếp cho cơ chế đơn bội. Đó là khởi đầu của quá trình hình thành thể bào tử mới. Về sau, thể bào tử này phát triển thành một cây độc lập . - sinh sản sinh dưỡng Trong tự nhiên, thực vật bậc cao có khả năng tạo ra những cơ thể mới từ một bộ phận của thân bò (dâu tây, rau má), thân rễ (cỏ gấu), thân củ (khoai tây), lá (cây thuốc bỏng), rễ củ (khoai lang). Đó là quá trình sinh sản sinh dưỡng Sự sinh sản hữu tính ở thực vật :Phương thức sinh sản hữu tính, cùng với việc phức tạp hoá cấu trúc nhiễm sắc thể và quá trình phân bào đã tạo ra sự đa dạng của các giao tử, làm cho sinh vật tiến hoá với tốc độ nhanh, phân hoá thành các nhóm khác nhau. . Người ta phân biệt ba dạng khác nhau của quá trình sinh sản hữu tính là đẳng giao, dị giao và noãn giao. Sự đẳng giao (Isogamia) Ỏ nhiều thực vật đơn bào và đa bào, đến thời kỳ sinh sản hữu tính thì hình thànhcác túi giao tử đơn bào khác nhau về giới tính. Trong túi giao tử đực, hình thành hoocmon giới tính gọi là hydrobenzaldehit điều khiển sự phân bào nguyên nhiễm, tạo ra giao tử đực. Trong túi giao tử cái có loại gynotecmon gọi là isoramnetol xác định giới tính cái. Hai loại giao tử đực và cái giống nhau về kích thước, hình thái, tốc độ vận động chỉ khác nhau về giới tính, gọi là đẳng giao tử. Giao tử đực tiết ra chất androgamôn để hấp dẫn giao tử cái, nhưng có tác dụng đẩy giao tử đực xa nhau. Giao tử cái tiết ra chất gynogamonđể hấp dẫn giao tử đực và đẩy giao tử cái xa nhau. Do vậy, xác suất gặp gỡ giao tử đực và giao tử cái xảy ra trong môi trường nước là rất lớn, chúng kết hợp với nhau, trước hết là bào phối, tiếp theo là nhân phối. Quá trình kết hợp của hai đẳng giao tử đực và cái gọi là sự đẳng giao. Hợp tử tạo ra trong đẳng giao nhỏ, có sự đóng góp như nhau về tế bào chất cũng như nhân của hai giao tử. Hợp tử này ít chất dự trữ, tồn tại không lâu, khả năng chống chịu kém. Vì vậy, hình thức sinh sản hữu tính đẳng giao chỉ xảy ra ở thực vật còn thấp. Ngoài ra, cũng có những loài sinh sản hữu tính tiếp hợp đẳng giao như nấm men, nấm mốc bánh mì. Sự dị giao (Heterogamia) Ở thực vật đơn bào tiến hoá hơn, hoặc thực vật đa bào đã xảy ra sự sinh sản hữu tính dị giao. Trong túi giao tử đực, xảy ra sự phân bào nguyên nhiễm, tạo thành giao tử đực nhỏ (microgameta), bơi lội với vận tốc nhanh hơn. Trong túi giao tử cái, các giao tử cái lớn (macrogameta) được tạo thành, bơi lội với vận tốc chậm hơn. Với hướng hoá thuận do hai giao tử tiết ra và kết hợp với nhau, tạo thành hợp tử gọi là sinh sản dị giao. Trong hợp tử này, nhân đực và nhân cái kết hợp với nhau, có sự đóng góp tương đương về vật chất di truyền, nhưng về di truyền tế bào chất thì dòng cái ưu thế hơn dòng đực. Hợp tử lớn hơn, chất dự trữ nhiều hơn, tồn tại lâu dài hơn và có khả năng chống chịu tốt hơn. Tuy nhiên, cũng có trường hợp xảy ra dị giao sinh lý như ở Tảo nâu Ectocarpus silicolosus, về phương diện hình thái thì chúng thuộc loại đẳng giao tử, nhưng về phương diện sinh lý chúng có sự khác nhau. Đẳng giao tử đực bơi lội nhanh, lâu hơn để tìm giao tử cái. Đẳng giao tử cái bơi lội với vận tốc chậm hơn, thời gian ngắn hơn, rồi ngừng bơi lội, chìm xuống đáy biển và bám vào giá thể bằng roi dài. Sự dị giao sinh lý là dạng chuyển tiếp trung gian từ đảng giao sang dị giao. Sự noãn giao (Oogamia) Sinh sản noãn giao, đó là hình thức sinh sản hữu tính cao. Cơ quan sinh sản đực gọi là túi tinh, trong chúng tạo ra tinh trùng bằng phân bào nguyên nhiễm. Tinh trùng phân hoá thành đầu, chứa khối nhân đơn bội hình thành trước, còn tế bào chất chỉ hình thành roi với thể nền chứa ty thể, bộ máy golgi v.v hình thành sau. Một số Hạt trần, thực vật Bao noãn (Chlamydospermae) và hầu hết Hạt kín giao tử đực được gọi là tinh tử. Nó là dạng neoteni của tinh trùng, chỉ có đầu, là khối nhân đơn bội, còn roi không hình thành, do đó tinh tử không có khả năng vận động. Cơ quan sinh sản cái là túi noãn, phân hoá thành bụng và cổ. Trong túi noãn, xảy ra sự phân bào nguyên nhiễm, hình thành noãn cầu, là tế bào sinh dục cái đơn bội, kích thước lớn, chứa nhiều tế bào chất, không vận động, nằm trong bụng túi noãn. Khi thụ tinh, tinh trùng vận động vào túi noãn, hoặc có cơ quan (ống phấn) mang tinh tử vào với noãn cầu gọi là thụ tinh qua ống phấn và chỉ xảy ra quá trình nhân phối, không có bào phối. Vì vậy, hợp tử tạo ra trong noãn giao tử rất lớn, chứa nhiều chất dự trữ cần thiết cho sự phát triển phôi, di truyền tế bào chất hoàn toàn thuộc ưu thế dòng mẹ. Ý nghĩacủa sinh sản hữu tính. Sinh sản hữu tính không đặc trưng bởi tạo ra năng suất cho thế hệ con, mà hình thành thế hệ con với chất lượng cao hơn, có sức sống cao, tạo ra đa dạng sinh học, do có sự đổi mới trong quá trình sinh sản hữu tính, vì vậy dễ thích nghi và biến đổi hơn so với các hình thức sinh sản khác. Nhờ vậy, sự phân bố của loài cũng được mở rộng, dễ dàng hình thành nòi mới, loài mới. Thực vật là sinh vật sản xuất, có lối sống định cư, cần phải duy trì hình thức sinh sản vô sinh bằng bào tử, nhằm tăng nhanh số lượng cá thể lên, đồng thời phải duy trì hình thức sinh sản hữu tính để đổi mới thế hệ, tăng cường biến dị cá thể, cung cấp nguyên liệu cho chọn lọc tự nhiên. 5. Đặc điểm về bộ gen của TV (vở) II. CÔNG NGHỆ GEN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG 1. Cơ sở khoa học của công nghệ gen tạo giống cây trồng. (vở) 2.Các công cụ chủ yếu trong công nghệ gen a. Enzim cắt hạn chế. Khái niệm ; Enzyme giới hạn (restriction enzyme, RE) là một enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu. Những enzyme này phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases. Các liên kết hóa học mà bị enzyme này cắt có thể được nối trở lại bằng loại enzyme khác là các ligases, vì thế các phân đoạn giới hạn (sản phẩm của phản ứng cắt RE) màbị cắt từ các nhiễm sắc thể hoặc gene khác nhau có thể được ghép cùng nhau nếu có trình tự đầu dính bổ sung với nhau Phân loại Các enzyme cắt giới hạn nói chung thành 3 loại :Loại I, Loại II và Loại III. Đối với hai loại I và III, cả hoạt tính phân giải acid nucleic hay phân giải nhóm methyl đều thực hiện chung bởi một phức hợp enzyme lớn. Mặc dù những enzyme thuộc 2 loại này cũng nhận biết những trình tự DNA đặc hiệu, vị trí cắt thường cách xa vị trí nhận biết, có khi đến cả trăm base. Chúng cũng cần ATP để hoạt động. Những enzyme này bắt đầu bằng việc kiểm tra tình trạng methyl hóa của 2 adenine trong vùng nhận biết. Nếu cả hai adenine đều không được methyl hóa (dấu hiện cho thấy đây là DNA ngoại lai), phức hợp enzyme thay đổi cấu hình và thực hiện hoạt tính phân giải. Tuy nhiên, nếu một trong hai adenine được methyl hóa, chứng tỏ là DNA của tế bào, enzyme khi đó sẽ thực hiện chức năng của một enzyme methyl hóa cho gốc adenine còn lại để duy trì sự ổn định cho DNA bộ gene. Với enzyme giới hạn loại III, chức năng phân giải của nó không liên quan đến chức năng methyl hóa hay phân giải nhóm methyl, và vị trí cắt cũng nằm ngay bên trong hay kế cạnh vị trí nhận biết. Ngày nay người ta biết rất nhiều enzyme khác nhau loại này và chúng là một trong những công cụ sinh học phân tử thiết yếu, đặc biệt thường gặp trong các ứng dụng dòng hóa gene hay phân tích DNA. Vị trí điểm cắt Enzyme giới hạn chỉ cắt các trình tự lặp đối xứng khi đọc theo chiều 5´-3´ trên mạch DNA (palindrome) gọi là trình tự nhận biết. Vị trí điểm cắt của enzyme giới hạn có thể nằm trong hoặc ngoài trình tự nhận biết này.Một số enzyme tạo ra các vết cắt trên mạch đối diện tức thời, tạo ra các đoạn DNA "đầu bằng (blunt)". Hầu hết các en đều tạo ra các vết cắt hơi chéo nhau (hình chữ chi), tạo ra các "đầu dính". Các enzyme giới hạn có ba chức năng quan trọng, mỗi chức năng cắt DNA bằng các cơ chế khác nhau. Đoạn bổ sung và đoạn nối Vì các enzyme giới hạn khác nhau ở các trình tự nhận biết và điểm cắt, nênchiều dài và trình tự chính xác của đầu dính "nhô ra", cũng như không biết nó có phải là mạch đầu 5' hay đầu 3' mà những phần nhô ra phụ thuộc vào enzyme tạo ra sản xuất ra nó. Tính bổ sung giữa những phần nhô ra và các trình tự bổ sung cho phép hai phân đoạn có thể nhập lại với nhau hay "splice" bởi DNA ligase. Phân đoạn có đầu dính có thể được gắn không chỉ với phân đoan lúc mới bị cắt đầu tiên, mà còn với bất kỳ phân đoạn nào mà có đầu dính thích hợp. Kiến thức về điểm cắt cho phép các nhà sinh học phân tử dự đoán được cách mà các phân đoạn có thể gắn kết và từ đó, có thể chọn ra enzyme thích hợp. Các trình tự nhận biết điển hình dài từ 4- 12 nucleotide. Do chỉ có một số cách để sắp xếp 4 nucleotide A,C,G và T thành 4 hoặc 8 hoặc 12 trình tự nucleotide, nên các trình tự nhận biết có khuynh hướng "crop up" bằng cách thay đổi bất kỳ trình tự dài nào. Hơn nữa, RE đặc hiệu với hàng trăm trình tự đã được nhận dạng và tổng hợp để cung cấp cho các phòng thí nghiệm. Kết quả, "các điểm giới hạn" tiềm ẩn xuất hiện trong hầu hết các gene hoặc nhiễm sắc thể. Trong khi đó, trên các "plasmid" nhân tạo thường bao gồm đoạn nối "linker" chứa hàng tá trình tự nhận biết RE bên trong đoạn DNA rất ngắn. Vì thế, dù một gene có được khảo sát dưới dạng nào,gần như người ta luôn luôn có thể tìm ra một hay một vài trình tự nhận biết để xử lý nó bằng enzyme giới hạn nhằm phục vụ cho mục đích dòng hóa. Nhiều trình tự nhận biết là palindromic Các trình tự nhận biết rất đa dạng, một số trong chúng là palindromic; đó có nghĩa là trình tự trên một chuỗi đọc theo chiều ngược lại với chuỗi bổ sung. Nghĩa của "palindromic" trong bài này khác với những gì được mong đợi trong cách sử dụng của nó: GTAATG không phải là trình tự DNA palindromic, mà là GTATAC. Tên gọi Enzym giới hạn được gọi tên dựa vào vi khuẩn mà chúng được phân lập theo cách dưới đây :E Escherichia (giống). co coli (loài). R RY13 (chủng). I First identified Order ID'd in bacterium b. Công cụ chuyển gen trực tiếp - Súng bắn gen : cấu tạo bao gồm 2 buồng bằng thép nối với 2 bơm chân không. DNA ngoại lai được bắn vào các hạt túngten đường kính rất nhỏ. các hạt này được đặt trên một cái đĩa bên trong súng. sự bùng nổ khí helium làm cho đĩa bay về phía trước vơiis tốc đọ 1300food/s tương đương với tốc đọ khi viên đạn rời khỏi nòng súng. một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt tungsten hay vàng bay về phía tế bào đích. chúng xuyên qua vách TB và phóng thích phân tử DNA. mục tiêu của súng bắn gen thường là các callus của tế bào thực vật sinh trưởng trong môi trường gel trên đĩa peptri, sau khi hạt tungsten chạm vào đĩa thì callus bị phá vỡ nhiều. tuy nhiên một số không bị phá vỡ và các hạt mang DNA ngoại lai sẽ xâm nhập vào hợp nhất với NST thực vật. các tb được chọn lọc từ callus se được chọn lọc và nuôi cấy.(ưu điểm : thao tác dễ làm , có thể chuyên gen vào nhiều loại tb và mô, các tb dc biến nạp có tỉ lệ sôgns sót cao). - Bơm tiêm gen. Ðể biến nạp gen vào tế bào bằng phương pháp vi tiêm trước hết phải chế tạo kim tiêm và kim giữ Kim được tạo ra từ những ống thuỷ tinh dẻo capillar đường kính 0,1-1,5 mm có sợi bằng wolfram mảnh ở trong nhờ hệ thống thiết bị làm kim Hệ thống này gồm có máy kéo kim tự động (pipette puller), máymài kim và máy gia cố kim Ðể tạo kim tiêm trước hết phải tạo ra đầu kim nhọn nhờ máy kéo kim Sau đó sử dụng máy gia cố để cắt đầu nhọn của ống capillar sau khi kéo tạo ra mũi kim tiêm có đường kính thích hợp Ðường kính bên trong mũi kim tiêm tuỳ thuộc vào loại tế bào chuyển gen Ðối với trứng tiền nhân động vật có vú có đường kính khoảng 70 µm thì đường kính của kim tiêm khoảng 0,75 µm là thích hợp, đối với phôi cá một tế bào đường kính của kim tiêm là khoảng 3-4 µm Cuối cùng đưa kim lên máy mài để làm sắc nhọn và trơn láng đầu kim. Kim giữ được chế tạo từ những ống capillar có đầu nhẵn bình thường để cố định trứng trong quá trình vi tiêm Ðể tạo kim giữ, dùng máy kéo kim tự động để tạo ra đầu kim nhỏ sau đó dùng bút kim cương hoặc sợi platin đốt nóng cắt bớt đầu nhọn để tạo ra đầu kim với đường kính thích hợp Làm nhẵn đầu kim giữ bằng cách để đứng kim này ngay trên mặt đoạn cong platin của máy gia cố Ðốt nóng sợi platin và điều chỉnh đầu kim giữ cho nó chảy từ từ Quan sát dưới kính hiển vi và dừng lại khi đầu kim đã đạt yêu cầu. Vi tiêm được tiến hành trên hệ thống thiết bị vi tiêm .Hệ thống này gồm có hai bộ phận chính là kính hiển vi và máy vi thao tác ngược (vật kính xoay ngược lên) Ðộ phóng đại thích hợp cho việc tiến hành vi tiêm vào phôi cá một tế bào là khoảng từ 40-60 lần Máy vi thao tác gồm 2 phần giống hệt nhau được bố trí hai bên kính hiển vi, một dùng để điều chỉnh kim tiêm, một dùng cho kim giữ Tính năng của máy này là cho phép điều chỉnh các kim theo không gian 3 chiều Kim tiêm và kim giữ được lắp vào máy vi thao tác và được nối với syringe qua ống bằng chất dẻo được nạp đầy dầu parafin nuôi cấy có thuốc kháng sinh do plasmid mang các gen kháng thuốc đặc hiệu Các vi khuẩn sống sót được sinh trưởng trong môi trường dinh dưỡng thích hợp và plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển sẽ được sao chép mỗi khi tế bào vi khuẩn phân chia Sau đó, hàng triệu bản sao của plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển được tách chiết từ các tế bào vi khuẩn này và các đoạn gen chuyển được tách ra từ plasmid tái tổ hợp nhờ sử dụng enzym hạn chế. Ðể tinh sạch, genchuyển được điện di trên gel agarose Hoà tan gen chuyển trong dung dịch đệm đặc trưng (như dung dịch Tris-EDTA; dung dịch TE ) và tính nồng độ dung dịch gen chuyển nhờ quang phổ kế Nồng độdung dịch DNA sử dụng cho vi tiêm thường là 1-5 µg/ml Trước khi chuyển vào phôi, gen chuyển được kiểm tra sự biểu hiện trong các tế bào nuôi cấy bằng sự chuyển nhiễm (transfection) Vi tiêm được tiến hành qua các bước: nạp gen vào kim tiêm bằng phương pháp capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10-12 giờ) hoặc bơm trực tiếp dung dịch gen vào, lắp kim tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác, chuyển trứng tiền nhân vào đĩa petri có chứa môi trường được đặt dưới kính hiển vi, giữ trứng tiền nhân vào đầu kim giữ bằng lực hút của syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phôi và điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí của trứng tiền nhân, đẩy gen vào trứng tiền nhân bằng cách vặn nhẹ syringe Khi thấy trứng tiền nhân hơi phồng to và trở nên sáng hơn thì dừng lại và kéo nhanh kim tiêm ra Trứng tiền nhân sau khi tiêm được di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước khi tiêm trứng tiền nhân tiếp theo Mỗi một nhóm trứng tiền nhân đã hoàn thành được chuyển sang một đĩa môi trường khác để ấp và đánh giá bằng mắt trong một vài tiếng Sau đó tất cả các trứng tiền nhân được nhìn thấy rõ ràng và được chuyển vào ống dẫn trứng của con cái nhận -Chuyển gen bằng kỹ thuật xung điện Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào Trong phương pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bêtrong tế bào Nhiều kỹ thuật nghiên cứu trong sinh học phân tử yêu cầu đưa gen hoặc protein ngoại lai vào trong tế bào chủ Vì lớp phospholipid kép của màng sinh chất có một đầu ưa nước phía ngoài và một đầu ưa nước phía trong nên bất kỳ phân tử phân cực nào, bao gồm cả DNA và protein, đều không có khả năng đi qua màng một cách tự do (Farabee, 2001) Các đầu ưa nước phân cực hướng về phía ngoài trong khi các đuôi kỵ nước hướng về phía trong và tương tác với đuôi kỵ nước khác để cùng bám giữ màng Các phân tử phân cực không thể đi qua màng này nếu như không có sự hỗ trợ bên ngoài Nhiều phương pháp đã được phát triển để vượt qua rào cản này, cho phép đưa DNA và các phân tử khác vào trong tế bào đã được nghiên cứu Một trong những phương pháp này là kỹ thuật xung điện. Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối yếu của các tương tác kỵ nước của phospholipid kép và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó sau khi bị rối loạn (Purves, 2001) Vì vậy, một xung điện chớp nhoáng có thể gây ra rối loạn ở các vị trí của màng một cách nhất thời, làm cho các phân tử phân cực có thể đi qua, nhưng sau đó màng có thế đóng kín lại nhanh chóng và tế bào không bị ảnh hưởng gì cả. Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành dịch huyền phù và cho vào trong một cuvette nhựa có điện cực. Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn người ta sử dụng một thiết bị gọi là máy xung gen (gene pulser) Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng 10.000-100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây Xung điện này làm rối loạn phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗ tạm thời Khả năng điện qua màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0 v vì vậy các phân tử đã được nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương tự như điện di ối DNA đi vào tế bào không thể quan sát thấy dưới kính hiển vi, nhưng hình vẽ này cho thấy khái niệm cơ bản của sự tạo thành các lỗ trên màng mà DNA có thể đi qua Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện và các lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng và phospolipid kép phục hồi lại cấu trúc cũ (Weaver, 1995) Lúc này các phân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo Phương pháp này có thể sử dụng đối với gần như tất cả các loại tế bào của các loài Lúc đầu phương pháp này được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào động vật có vú, về sau cho cả tế bào thực vật ở dạng protoplast Với một số cây một lá mầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì) mà không thể thể thực hiện được bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium thì người ta đã thành công với phương pháp này Hiệu quả biến nạp cao Trong một nghiên cứu ở E.coli, 80% số tế bào nhận được DNA ngoại lai (Miller và Nickoloff, 1995) Lượng DNA ngoại lai cần thiết là ít hơn so với các phương pháp khác (Withers, 1995) Phương pháp này có thể thực hiện với các mô in vivo còn nguyên vẹn (Weaver, 1995) Ðoạn DNA ngoại lai được biến nạp có kích thước lớn Tuy nhiên nếu các xung điện có cường độ và chiều dài không đúng thì một số lỗ của tế bào sẽ trở nên quá lớn hoặc bị hỏng không thể đóng lại sau khi tế bào phóng điện, làm cho tế bào bị tổn thương hoặc bị thủng (Weaver, 1995) Một hạn chế nữa là sự vận chuyển DNA ngoại lai vào và ra khỏi tế bào trong suốt thời gian điện biến nạp là tương đối không đặc hiệu Ðiều này dẫn đến kết quả là không cân bằng ion mà sau đó sẽ làm rối loạn chức năng của tế bào và tế bào chết (Weaver, 1995). Kỹ thuật xung điện được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của sinh học phân tử và y học Các ứng dụng của kỹ thuật xung điện bao gồm: - Biến nạp DNA: các gen đặc hiệu có thể được tạo dòng trong plamid và sau đó plasmid này được đưa vào tế bào chủ để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen và protein - Chuyển plasmid trực tiếp giữa các tế bào: tế bào vi khuẩn đã chứa plasmid có thể được ủ với một dòng khác không mang plasmid nhưng lại có đặc tính mong muốn khác. Ðiện áp của xung điện sẽ tạo ra các lỗ, cho phép một số plasmid đi ra khỏi tế bào và lại đi vào tế bào khác Sau đó các tế bào mong muốn sẽ được chọn lọc bằng tính kháng thuốc kháng sinh hoặc bằng phương pháp tương tự khác (Withers, 1995) Kiểu chuyển gen này cũng có thể được thực hiện giữa các loài khác nhau Vì vậy, một lượng lớn plasmid sinh trưởng trong các khuẩn lạc vi khuẩn được nhân lên một cách nhanh chóng và sau đó được chuyển vào các tế bào nấm men bằng kỹ thuật xung điện để nghiên cứu (Gunn, 1995) - Dung hợp tế bào đã kích thích: sự tạo thành các lỗ thủng trên màng xảy ra do xung điện chớp nhoáng tạo ra cho thấy đã kích thích sự dung hợp tế bào (Weber và Berrg, 1995) - Phân phối thuốc qua da: Chỉ khi xung điện gây ra các lỗ tạm thời trên màng sinh chất, các lỗ tương tự đã tạo ra ở màng lipid kép của lớp da chết ở phía ngoài cùng Các lỗ này cho phép thuốc đi qua da đến các mô đích Các bệnh nhân thích phương pháp này hơn phương pháp tiêm (không cần kim tiêm) và có thể tránh được các vấn đề phân hủy hoặc hấp thu không đúng của liệu pháp uống thuốc (oral medication) trong hệ tiêu hóa (Praustmitz, 1993). - Liệu pháp hóa điện khối u ung thư (cancer tumor electrochemotherapy): các nhà khoa học đang nghiên cứu tiềm năng của kỹ thuật xung điện để tăng tính hiệu quả của liệu pháp hóa học Khi sử dụng kỹ thuật xung điện để biến nạp DNA, xung điện này sẽ phá vỡ màng tế bào ung thư và làm tăng lượng thuốc đi đến các vị trí Một số nghiên cứu cho rằng đã làm giảm sự phát triển khối u khi áp dụng phương pháp này cho các tế bào ung thư ở hệ thống mô hình động vật (Maeda, 1998) - Liệu pháp gen: kỹ thuật xung điện cho phép các vector mang các gen quan tâm được biến nạp qua da đến các mô đích. Khi đã hợp nhất vào các tế bào của cơ thể, các protein được tổng hợp từ các gen này có thể thay thế gen sai hỏng và vì vậy đã điều trị các rối loạn di truyền - hóa chất chuyển gen c. Công cụ chuyển gen gián tiếp * chuyển gen vào tb nhờ vecter - Bản chất hóa học. - Phân loại -Các đặc tính của vector - Vector phải đủ lớn để mang DNA ngoại lai nhưng không quá lớn. - Vector phải chứa các trình tự kiểm soát (control sequences) như khởi điểm tái bản (origin of replication), promoter. - Vector phải mang một hoặc nhiều vị trí nhận biết của enzym hạn chế. - Vector phải mang các gen marker chọn lọc (thường là các gen kháng chất kháng sinh). Vì vậy các tế bào chứa chúng có thể được phát hiện một cách dễ dàng. * Plasmid tự nhiên Các vector biến nạp vào tế bào thực vật sử dụng Agrobacterium chuyển gene gián tiếp qua sử dụng các vector, đặc biệt là vector plasmid pBI12A chứa sẵn một gene khởi đầu promoter mạnh nhất và gene CaMV35S (Cauliflower mosaic virus) gene kết thúc và gene đánh dấu GUS-A. Plasmid này được gắn thêm các gene lạ có đặc tính mong muốn đưa vào vi khuẩn hay ở thực vật dùng Agrobacterium tumefaciene để đưa vào cây. Người ta có thể đưa gene ngoại lai vào qua con đường vector plasmid: DNA được đánh dấu phóng xạ rồi đưa vào hạt phấn, chồi non, các tế bào nuôi cấy protoplast hay nhân tế bào được tách ra. DNA ngoại lai dễ nhận cảm với sự tiêu hóa của enzyme nuclease vật chủ. Phải đưa DNA vào lyposome, sau đó dung hợp vào protoplast để làm giảm tác dụng tấn công của nuclease tế bào chủ. Dần dà người ta nghiên cứu đưa DNA ngoại lai vào qua con đường vector plasmid. DNA plasmid được tìm thấy ở ti thể của động vật bậc cao. Những plasmid đó có thể là một hệ thống duy nhất của sự chuyển gene. Chúng sao chép một cách tự quản trong ti thể. Plasmid cũng được tìm thấy trong nhiều vi khuẩn. Những plasmid đó thường được liên kết với vi khuẩn bệnh lí và được dùng để kiểm tra sự sinh bệnh của một tác nhân gây bệnh cây trồng. Vai trò plasmid Ti của Agrobacterium tumefaciens trong sự hình thành khối u ngày nay đã được sử dụng phổ biến để chuyển gene thực vật. Agrbacterium gồm các loài A. tumefaciens và A. rhizogenes. A. tumefaciens là vi khuẩn đất gram âm, hình que. Vi khuẩn này có ở họ Rhizobiaceae có khả năng gây u ở thực vật. Nó là một plasmid dài vào khoảng 120-150 kb, có tính chất gây u nên gọi là plasmid Ti. Ti bắt nguồn từ chữ đầu của tumer inducing. Còn A. rhizogenes là plasmid có khả năng gây bệnh rễ tóc (hairy root) và gọi là plasmid Ri. Ri bắt nguồn từ chữ đầu của root inducing tức là sinh rễ. Kích thước plasmid này tương tự plasmid Ti. Đối với các cây trồng, người ta có thể tạo ra giống mới cũng có những đặc tính mong muốn qua việc chuyển gene. Các gene đó có thể từ một cây không có quan hệ họ hàng hoặc từ động vật, Côn trùng, nấm men, hoặc từ các vi sinh vật. Các cây được nhận gene bằng nhiều cách khác nhau nhưng gần đây nhờ hệ thống vi khuẩn Agrobacterium có đặc tính sẵn có trong tự nhiên là chuyển được gene của chúng vào cây cối thông qua một phần T-DNA của plasmid Ti hoặc Ri. Chính T-DNA của vi khuẩn CNSHphục vụ nông lâm ngư nghiệp được gắn vào bộ gene của thực vật sẽ làm xuất hiện khối uhoặc rễ tóc vì chúng chứa oncogene. T-DNA có kích thước 25 kb trong đó chứa gene mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinine, opine và các gene gây khối u (oncogene). Trong plasmid Ti, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng bờ phải và bờ trái. Ngoài plasmid Ti còn có các vùng DNA mã hóa cho việc tái sinh plasmid, cho khả năng lây nhiễm (vùng vir) và chuyển nạp, cho việc tiêu hóa opine.Trong các vùng DNA của plasmid Ti, ngoài T-DNA được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm hoạt động của các gene nằm trong vùng vir được tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loại protein đặc biệt như vir E , vir B, vir D, vir D , vir C …Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây 2 lá mầm), kích thích sinh sản ra các đoạn T-DNA bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ gene của cây chủ một cách an toàn. Khi cây nhiễm bệnh do T-DNA nạp vào trong hệ gene của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinine và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn” nhờ gene chuyển hóa opine trên plasmid Ti. Cơ chế lây nhiễm của A. rhizigenes đối với cây 2 lá mầm cũng tương tự nhưng trong vùng T- DNA của A. rhizogenes chỉ có gene sản sinh ra auxin, vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tóc khi bị nhiễm bệnh CNSHphục vụ nông lâm ngư nghiệp Trên thực tế bệnh cây, Agrobacterium chỉ gây hại ở cây 2 lá mầm. Vì vậy, người ta cho rằng chúng chỉ có thể nạp T-DNA vào hệ gene các cây 2 lá mầm . Gần đây nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây 1 lá mầm cũng có thể sản xuất opine và có thể khai thác khả năng biến nạp gene của Agrobacterium ở cây 1 lá mầm. Nhưng nếu phần T-DNA bị cắt thì plasmid Ti này vẫn giữ nguyên khả năng chuyển gene lạ vào thực vật. Do đó, plasmid Ti hiện nay trở thành một công cụ sắc bén theo đặc tính gây u vào các cây trồng. Việc chuyển gene lạ được tiến hành theo những bước sau: * Tách plasmid Ti từ vi khuẩn A. tumefaciens * Cắt bỏ phần T-DNA của plasmid đi * Chuẩn bị gene lạ chứa di truyền mong muốn, chẳng hạn gene độc tố của Bacillus thuringiensis để tiêu diệt sâu bọ hại cây trồng. * Chuẩn bị gene đánh dấu để theo dõi việc chuyển gene lạ vào thực vật có thành công hay không? Chẳng hạn, gene mã hóa cho một enzyme có phản ứng màu mà ở thực vật ít có như gene mã hóa enzyme - glucuronidase gọi tắt là GUS-A tạo ra màu xanh da trời đặc trưng với cơ chất 5-bromo-4- chloro-3-indolyl, -galactopyranoside được kí hiệu là X- gluc. Đôi khi người ta sử dụng khả năng đánh dấu của gene mã hóa luciferase - một enzyme của Đom đóm phát sáng trong tối ở các mô được chuyển gene. Cũng có khi sử dụng những gene kháng kháng sinh kanamycine - một chất ức chế sinh trưởng thực vật. * Gắn gene lạ và gene đánh dấu vào plasmid Ti thay thế vào chỗ T- DNA đã bị cắt bỏ rồi đưa vào vi khuẩn Agrobacterium. *Chuẩn bị tế bào vật chủ tiếp nhận vi khuẩn Agrobacterium chứa plasmid có gene lạ như chuẩn bị các protoplast từ các thể mô, các đĩa lá. * Nuôi cấy chung vật chủ với vi khuẩn A. tumefaciens chứa plasmid Ti gắn gene lạmột thời gian vài ngày ở nhiệt độ ánh sáng thích hợp. * Loại bỏ vi khuẩn bằng dùng các kháng sinh đặc hiệu như carbenicilline. * Chuyển nguyên liệu thực vật vào môi trường dinh dưỡng nuôi cấy tế bào và mô để tái sinh có thêm những chất kích thích sinh trưởng như 2,4 D, auxin khác v.v. * Cây tái sinh được nuôi trong vườn ươm và cuối cùng trồng ra đất. * Theo dõi các đặc tính của gene lạ biểu hiện ở cây trồng. d. Môi trường nuôi cấy tế bào 3. Quy trình chuyển gen tạo giống cây trồng B1; Chuẩn bị gen ngoại lai B2: Chuẩn bị đối tượng chuyển gen B3: Chyển gen - chuyển gen trực tiếp - chuyển gen gián tiêp B4 : Nuoi cấy tb nhận gen * so sánh chuyển gen trực tiếp và gián tiếp( chỉ hỏi quy trình thì bỏ cơ sở kh) - giống : cskh,chuẩn bị gen, nuôi cấy - khác: phương pháp Chuyển gen trực tiếp Chuyển gen gián tiếp Công cụ Vecter : các loại Bơm tiêm gen, súng, máy phat xung điện, chát hóa học. Qui trình Vở Ưu, nhược III. CNSH BẢO VỆ CÂY TRỒNG 1. Tác hại của sâu bệnh với trồng trọt theo thống kê, sâu bọ gây thiệt hại lớn cho mùa màng khoảng 20- 40%. Năng suất mùa màng càng cao thì thiệt hại càng lớn. Người nông dân từ xưa đến nay, qua kinh nghiệm thực tế cũng đã có nhiều biện pháp phòng trừ như xới xáo, chăm sóc bắt sâu bọ, thay đổi vụ trồng hợp lí, trồng thảm xen kẽ, phun thuốc trừ sâu v.v. Riêng nước Mĩ, mỗi năm mất đi 2,5 tỉ USD về thuốc trừ sâu để bảo vệ mùa màng. Nhưng việc sử dụng thuốc trừ sâu bệnh, thuốc trừ cỏ dại (herbicide), ví dụ, thuốc trừ nấm chỉ được phuntrừ sâu trên các vùng trồng chuối ngọt (sweet banana) nơi chỉ sản xuất khoảng 10% sản lượng chuối để đưa vào thị trường quốc tế, 90% sản lượng chuối còn lại là chuối bột (platain), một trong các nguồn lương thực của nhiều nước nhiệt đới thì chủ yếu trồng ở các qui mô gia đình rải rác. Vì vậy khó sử dụng thuốc trừ nấm và giá thành không kinh tế. Hơn nữa thuốc trừ sâu bệnh đã để lại hậu quả khôn lường, người bị ngộ độc, thậm chí ung thư, động vật có thể chết. Vì vậy, công tác bảo vệ cây trồng theo hướng CNSH là tốt hơn cả. Người ta đã nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của khoai tây, dâu tây, khoai mỡ (Yam) còn gọi là khoai Ấn Độ, để làm sạch virus. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cũng giúp tạo ra các giống sắn sạch bệnh. Kĩ thuật nuôi cấy mô in vitro cũng giúp giải phóng cây sừa khỏi bệnh virus và Mycoplasma rất nghiêm trọng đối với dừa, chà là (Date palm), kháng bệnh hoặc ít nhiễm bệnh nấm hoa từ nhân vô tính, đặc biệt là chống chịu bệnh bayoud do nấm (Fusarium oxyporum f-sp-albidinis) gây ra là bệnh gây tổn thất nghiêm trọng cho chà là. Viện IRAT (Institute de Recherches Agronomiques Tropicales et des Cultures vivrieres: Viện Nghiên cứu Nông nghiệp nhiệt đới và Các cây lương thực) của Pháp đã xây dựng được phương pháp cấy tác nhân gây bệnh vào cây con đang tái sinh từ callus, Việc sàng lọc các tế bào của những cây connày có thể cho phép phân lập được các dòng kháng bệnh, kháng 3 loại bệnh quan trọng: sinut, ieafscala và bệnh rỉ sắt. Tương tự như vậy, người ta có thể tách được các dòng tế bào kháng mặn, kháng phèn và độc tố của nấm (Helminthosporium sacchari). Các kết quả nghiên cứu của CENA (Centre de Nuclear Energy in Agriculture) và CEBTEC (Divisão de Biotechnology de Plantas et Centro de Biotechnologia Agricola) ở Brazil cho thấy dung hợp protoplast cây Mía có thể giúp chuyển gene kháng thuốc trừ sâu có từ dòng mía này qua dòng mía khác. Từ năm 1985, ở phòng Hiển vi Điện tử của CENA đã bắt đầu chương trình nghiên cứu cấy chuyền gene kháng bệnhkhuẩn và virus vào tế bào cây trồng, sau đó tách protoplast và dung hợp chúng trong điện trường. Trong vòng 30 năm qua, ngườinông dân và các nhà làm vườn tin tưởng về vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) vì chúng sản xuất ra protein chống Côn trùng. Vi khuẩn này đã làm chết hàng loạt sâu tơ, Sâu róm ở vùng Thuringi. Các chế phẩm Bt đặc hiệu cao với các côn trùng thuộc loài bướm. Cơ chế hoạt động phân tử Bt như sau: protein Bt liên kết với những proceptor đặc hiệu được khu trú trên màng ruột của những côn trùng gây hại. Sự liên kết đó gây cản trở cho dòng vận chuyển ion vào trong tế bào biểu mô ruột và như vậy làm mất khả năng ăn uống dinh dưỡng của côn trùng. Những thuốc trừ sâu thiên nhiên này không gây độc hại cho người và động vật, thậm chí ngay cả các loài côn trùng khác. Mặt khác, tính chất có ích của thuốc trừ sâu Bt thường bị hạn chế vì dễ dàng bị rửa sạch khỏi cây, nhưng hiệu quả của chúng trên đồng ruộngthường được kéo dài. Bên cạnh việc đề kháng virus, Côn trùng gây hại các cây trồng còn phải chống đối các loài cỏ dại. Cỏ dại làm giảm sản lượng mùa màng có khi tới 70%. Trước đây người ta phối hợp thuốc diệt cỏ với việc làm cỏ để hạn chế cỏ dại. Vì trong thuốc diệt cỏ có phổ hạn chế trong hoạt động, nó chỉ gây ảnh hưởng rất nhỏ đối với cỏ dại. Công nghệ gene có thể dùng để kiểm tra một cách hữu hiệu cỏ dại. Vấn đề là ở chỗ tạo ra cho cây trồng có thể sản xuất thuốc trừ cỏ dại với phổ rộng, đơn giản và an toàn cho môi trường. Nếu sử dụng được công nghệ vào cho cây trồng sẽ làm cho nông nghiệp giảm một lượng lớn thuốc trừ cỏ dại. Có 3 hướng công nghệ để tạo ra thuốc trừ cỏ dại: * Các nhà nghiên cứu ở Monsanto, Calgene, California đã dùng thuốc trừ cỏ dại tên là Roundup. Roundup là thành phần phổ rộng trừ cỏ dại lá to và mọc dày. Roundup ức chế hoạt động enzyme tổng hợp EPSP – enzyme này tham gia vào việc tạo acid amin thơm cần cho sự sinh trưởng Trong bảo vệ quả ít bị hư hại, công nghệ gene cũng đang phát huy tác dụng. Người ta đã xác định và tách một số gene đóng vai trò trong sinh tổng hợp ethylene - một phân tử liên quan đến sự chín của hoa quả. Sự chín kéo chậm lại để kịp thu hoạch và tạo mùi tốt hơn làm phẩm chất tăng lên. Có 2 phương pháp di truyền để tăng nguồn thu hoạch quả. Một là gài đoạn dịch mã antisen của gene chín để liên kết với RNA thông tin làm tắt gene. Athanosios theologis ở California và Don Grierson trường Đại học Tổng hợp Nottingham đã chứng minh rằng, các quả Cà chua có những gene antisen đã chống sự làm mềm. Thứ hai là đưa gene vào để tạo enzyme làm thóai hóa thành phần tiền chất hình thành ethylene, như vậy sẽ làm chậm sự chín và hư hỏng (công trình của Kishora và Harry Klee ở Monsanto). Gần đây các nhà khoa học Mĩ cấy vào cây 1 gene vi khuẩn sản sinh ra 1 chất chitinase tiêu diệt các tế bào của nấm (cấy vào cà chua, khoai tây, rau diếp và các giống cây tương tự nhưng chưa làm được đối với lúa, lúa mì, ngô và các cây có hạt khác). Ngoài CNSH ra, hiện nay người ta còn dùng 1 số biện pháp sinh học để thay thế thuốc trừ sâu hóa học như; nuôi ong mắt đỏ để diệt Sâu đay, dùng hạt cây sầu đâu để diệt gần 2000 loài sâu hại (trong sầuđâu có azadirachitine có tác dụng diệt côn trùng mạnh) IV. CNSH SX PHÂN BÓN [...]... phát triển của khoa học hiện đại Sự phát triển của khoa học công nghệ đã góp phần rất lớn vào công cuộc bảo vệ môi trường xanh sạch đẹp như công nghệ hóa chất nhưng những công nghệ đó vừa xử lí nhưng lại vừa làm ô nhiễm nghĩa là công việc xử lí môi trường bằng phương pháp lí hóa chưađem lại kết quả tối ưu Nói như vậy là để ta thấy được ứng dụng và vai trò rất lớn của công nghệ sinh học trong xử lí rác... một nền nông nghiệp sinh thái Phân vi sinh là dạng có nhiều ưu điểm CNSH đã tạo ra nhiều dạng phân vi sinh có giá trị sử dụng cao, với hiệu quả khác nhau phù hợp với các loại cây trồng khác nhau, các loại đất trồng khác nhau Phổ biến nhất hiện nay là phân sinh học nitragin và Azotobacter, ngoài ra còn có phân lân sinh học Dùng phương pháp sinh học để bảo vệ thực vật Thuốc trừ sâu hóa học gây nhiều tác... biện pháp sinh học để bảo vệ thực vật có ưu điểm rất lớn trong bảo vệ môi trường, bảo vệ tính đa dạng sinh học, bảo đảm sự cân bằng sinh thái Những biện pháp sinh học để bảo vệ thực vật gồm: - Dùng vi sinh vật diệt côn trùng gây bệnh: Có 3 nhóm có khả năng gây bệnh cho côn trùng là vi khuẩn, vi nấm và virus Trong nhóm vi khuẩn người ta thường dùng Baccilus thuringiensis tạo chế phẩm trừ sâu sinh học -... sự phát triển mạnh mẽ của làn sóng công nghệ sinh học trên thế giới, vừa qua, các nhà khoa học Cuba vừa công bố sản xuất thành công vaccine nhân tạo phòng chống viêm phổi và viêm màng não Khác với các dạng vaccine được sản xuất theo phương pháp truyền thống, loại vaccine mới sinh kháng thể được tạo ra bằng cách tổng hợp các chất hóa học Loại vaccine mới này chưa được công bố giá chính thức nhưng chắc... được phân loại theo nguồn gốc phát sinh ra chúng Đó là cơ sở cho việc lựa chọn các biện pháp hoặc công nghệ xử lí Chất thải được phân thành các loại: + Chất thải sinh hoạt: chất thải từ các khu dân cư, khu vực hoạt động thương mại, công sở, trường học +Chất thải công nghiệp: chất thải từ các nhà máy đang hoạt động, có cả chất thải sinh hoạt nhưng trong đó chất thải công nghiệp là chủ yếu +Chất thải... phải giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường với các qui trình, công đoạn phức tạp, có sự tham gia của nhiều lĩnh vực khoa học: vật lí, hóa lí, sinh học Trong những giải pháp khoa học thì công nghệ sinh học (CNSH) đóng góp vai trò chủ đạo, quyết định nhất CNSH ngày nay đã trở thành công cụ đắc lực để con người bảo vệ được môi trường sống khác của hành tinh CNSH được áp dụng cho nhiều lĩnh vực khác nhau... nguồn 2 cung cấp N2 cho cây Dùng phân sinh học chống ô nhiễm Phân hóa học có vai trò lớn trong việc nâng cao năng suất cây trồng Tuy nhiên nếu lạm dụng phân hóa học quá thì sẽ dẫn đến những tác hại nghiêm trọng, nhất là gây ô nhiễm môi trường Để tránh ô nhiễm môi trường biện pháp có hiệu quả nhất là sử dụng phân bón sinh học thay thế cho phân hóa học Bởi vì phân sinh học có vai trò lớn trong việc nâng... sử dụng tính đối kháng sinh học giữa các nhóm sinh vật với nhau để tiêu diệt các sinh vật gây bệnh cho cây Khi sử dụng thuốc trừ sâu, không chỉ côn trùng gây hại bị tiêu diệt mà các loài đối kháng với chúng cũng bị tiêu diệt theo làm cho yếu tố tự điều chỉnh của hệ sinh thái tự nhiên bị mất đi, hệ sinh thái tiếp tụcmất cân bằng ngày càng nghiêm trọng thêm Các phương pháp sinh học bảo vệ thực vật là... chúng và quá trình đưa các dụng cụ vào tử cung luôn được kiểm tra và điều chỉnh quatrực tràng Ở nước ta, tại Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Quốc gia, vào ngày 13 tháng 4 năm 1997, một con dê cỏ Việt Nam sau 4 tháng 23 ngày mang thai từ phôi dê Pháp được giữ đông lạnh đã sinh ra con dê cái Pháp giống Alpin màu trắng tuyền thuần chủng 6.2.2 Các thao tác phôi Chia tách phôi (embryo... sinh vật yếm khí để phân hủy chất hữu cơ trong phế thải thành khí methan Đây là hướng vừa xử lí phế thải vừa tạo ra biogas để sử dụng trong sinh hoạt Phương pháp này được sử dụng rộng rãi ở Ấn Độ, chi phí ít và tiết kiệm về kinh tế + Các phế thải công nghiệp được chia thành 2 nhóm: - Các phế thải có liên quan đến sinh học như công nghiệp sữa đường, thực phẩm Các phế thải không liên quan đến sinh học . điểm về bộ gen của TV (vở) II. CÔNG NGHỆ GEN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG 1. Cơ sở khoa học của công nghệ gen tạo giống cây trồng. (vở) 2.Các công cụ chủ yếu trong công nghệ gen a. Enzim cắt hạn chế. Khái. Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Quốc gia, vào ngày 13 tháng 4 năm 1997, một con dê cỏ Việt Nam sau 4 tháng 23 ngày mang thai từ phôi dê Pháp được giữ đông lạnh đã sinh. của nó. Với sự phát triển mạnh mẽ của làn sóng công nghệ sinh học trên thế giới, vừa qua, các nhà khoa học Cuba vừa công bố sản xuất thành công vaccine nhân tạo phòng chống viêm phổi và viêm