Tài liệu Công nghệ sinh học_ Chương 2 docx

57 Chương Các phương pháp chuyển gen Nhiều phương pháp khác phát minh để đưa gen vào tế bào mô động vật thực vật Kỹ thuật đơn giản chuyển DNA trần vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), súng bắn gen Các phương pháp phức tạp hiệu bao gồm sử dụng phức hợp lipid-DNA (liposome), vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium, chuyển gen súng bắn gen Tuỳ thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp chuyển gen phù hợp I DEAE-dextran DEAE-dextran polycation Ðây tác nhân hóa học sử dụng để chuyển DNA vào tế bào động vật nuôi cấy Trong phương pháp này, DNA ngoại lai cho vào trường ni cấy với có mặt DEAE-dextran DEAE-dextran kết hợp với DNA tích điện âm (Hình 2.1) Sự dư thừa điện tích dương phức hợp DNA-polycation đóng góp polycation, cho phép phức hợp đến kết hợp chặt chẽ với màng tế bào tích điện âm Sự xâm nhập phức hợp đạt nhờ nhập bào (endocytosis) Hình 2.1: Sự kết hợp DEAE-dextran DNA 58 Phương pháp sử dụng thành công việc chuyển DNA vào tế bào biểu thời, có nghĩa thời gian biểu ngắn vài ngày trình nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp nói chung khơng hữu ích nghiên cứu cần chuyển nhiễm ổn định dựa vào hợp DNA ngoại lai vào nhiễm sắc thể, hiệu biến nạp thấp, sử dụng cho số loại tế bào cho kết tốt tế bào ex vivo Các polycation khác sử dụng để chuyển DNA vào tế bào polybrene, polyethyleneimine dendrimers II Kỹ thuật calcium phosphate Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) phát triển để xác định lây nhiễm DNA virus (Graham,1973) sử dụng rông rãi để thử nghiệm hoạt động biến nạp DNA virus DNA tách chiết từ tế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979; Pellicer, 1980) Kỹ thuật yêu cầu ủ tế bào nhận với chất đồng kết tủa DNA calcium phosphat (Hình 2.2) Kết tủa bám vào tế bào sau hấp thụ vào tế bào qua trình ẩm bào (Loyter, 1982) Trong tế bào, phân tử DNA ngoại lai nằm không bào tạo thành ẩm bào lysosome thứ hai DNA đến nhân vả hợp vào genome chủ Hình 2.2: Phức hợp DNA-calcium phosphat 59 Cho đến nay, kỹ thuật vô có giá trị nghiên cứu chuyển gen vào tế bào soma nuôi cấy sử dụng nhiều để chuyển dòng genome vào tế bào đích Tỉ lệ tế bào biến nạp ổn định kỹ thuật tương đương với phương pháp vi tiêm khác với vi tiêm nhiều tế bào biến nạp lần Hơn nữa, biến nạp DNA tách chiết từ tế bào ung thư vào tế bào nhận không ung thư cho thấy phương pháp để nghiên cứu kiểm soát di truyền ung thư Phương pháp sử dụng phổ biến đơn giản, protocol dễ thực hiện, tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp không đáng kể, biểu gen thời ổn định quan trọng việc thiết kế vector virus tái tổ hợp Tuy nhiên hiệu biến nạp mức độ biểu gen chuyển thấp III Chuyển gen qua liposome Vào thập niên 1980, liposome nhân tạo sử dụng để đưa DNA vào tế bào Lipid với tồn lưới tích điện dương pH sinh lý thành phần lipid tổng hợp phổ biến liposome phát triển cho chuyển gen (Hình 2.3) Thường lipid cation trộn với lipid trung tính L-dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) (Hình 2.4) Phần cation phân tử lipid kết hợp với DNA tích điện âm kết chứa đầy DNA phức hợp liposome-DNA (Hình 2.5) Ðối với tế bào ni cấy, tồn lưới tích điện dương phức hợp liposome-DNA nói chung gây hiệu chuyển gen cao cho phép phức hợp kết hợp với màng tế bào tích điện âm bền Nhờ chế nhập bào, phức hợp xuất endosome sau vào nhân (Hình 2.6) Chưa rõ DNA phóng thích từ endosome qua màng nhân DOPE xem lipid kích thích dung hợp vai trị phóng thích phức hợp từ endosome làm cho dung hợp màng tế bào phía ngồi với phức hợp liposome-DNA xảy dễ dàng Trong phương pháp này, đại phân tử trước hết đưa vào túi phospholipid Các loại túi khác mô tả, túi lớp mỏng thích hợp cho chuyển gen chúng có tỉ lệ khoảng trống chứa nước bên tương đối cao đơn vị lipid chúng có tỉ lệ 60 phân phối cao Sự dung hợp liposome với màng plasma kiện Hiệu biến nạp phương pháp thấp so với phương pháp vi tiêm vào tiền nhân Các nổ lực nghiên cứu tiến hành để tìm điều kiện thí nghiệm mà làm tăng phóng thích phân tử kết nang từ đường ẩm bào Hình 2.3: Cấu trúc tổng quát lipid cation tổng hợp Hình 2.4: Cấu trúc DOPE (L-diolecyl phosphatidylethanolamine) Hình 2.5: Phức hợp liposome-DNA 61 Hình 2.6: Sơ đồ hoạt động vector liposome Liposome sử dụng để đưa protein, lipid phân tử nhỏ vào nhiều loại tế bào nuôi cấy, nhiên hiệu thấp vi tiêm RNA protein Cũng thế, chuyển gen qua liposome biểu gen chuyển không vượt qua phương pháp chuyển gen thông thường (như hệ thống virus), biểu gen chuyển thường thời, ức chế thành phần huyết xảy Bên cạnh đó, kỹ thuật có nhiều ưu điểm gen chuyển không hợp vào genome chủ, có hiệu tốt tế bào in vitro in vivo, mang DNA có kích thước lớn, độ tinh khiết cao, khơng gây miễn dịch, sử dụng với tế bào mà biến nạp kỹ thuật calcium phosphat khơng có hiệu 62 Ứng dụng tương lai kỹ thuật chủ yếu khả phân phối thuốc vào tế bào thể sống Hiện kỹ thật phát triển để cải tiến phân phối đặc hiệu liposome cách ghép kháng thể đặc hiệu với bề mặt liposome đích IV Phương pháp vi tiêm Sự thành công nghiên cứu tạo chuột chuyển gen phương pháp vi tiêm vào tiền nhân công bố vào năm 1980 (Gordon, 1980) Mặc dầu cấu trúc tổ hợp gen chuyển chứng minh tích hợp vào genome chuột, xếp lại gen ngoại lai không biểu Các công bố (Brister, 1981; Costantini Lacy; 1981) chứng minh với phương pháp vi tiêm, gen chuyển tích hợp có khả biểu Vào năm 1982, lần thay đổi kiểu hình nhìn thấy chuột nhắt chuyển gen mô tả (Palmiter, 1982) Ðây kết biểu gen hormon sinh trưởng chuột cống chuột nhắt Từ đến có nhiều cơng trình chuyển gen, phần lớn nghiên cứu hiệu gen vi tiêm với sinh trưởng động vật có vú bệnh học Nguyên tắc phương pháp vi tiêm lượng nhỏ DNA tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần tế bào nguyên vẹn cách học kính hiển vi Phương pháp cho phép đưa gen vào vị trí mong muốn tế bào với hiệu tương đối cao.Tuy nhiên đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ xác nên hạn chế số lượng tế bào vi tiêm ngồi cịn làm tổn thương đến tế bào phơi tác nhân học gây tiến hành vi tiêm Ðể biến nạp gen vào tế bào phương pháp vi tiêm trước hết phải chế tạo kim tiêm kim giữ Kim tạo từ ống thuỷ tinh dẻo capillar đường kính 0,1-1,5 mm có sợi wolfram mảnh nhờ hệ thống thiết bị làm kim Hệ thống gồm có máy kéo kim tự động (pipette puller), máy mài kim máy gia cố kim 63 Hình 2.7: Vi tiêm gen ngoại lai vào tiền nhân trứng thụ tinh Ðể tạo kim tiêm trước hết phải tạo đầu kim nhọn nhờ máy kéo kim Sau sử dụng máy gia cố để cắt đầu nhọn ống capillar sau kéo tạo mũi kim tiêm có đường kính thích hợp Ðường kính bên mũi kim tiêm tuỳ thuộc vào loại tế bào chuyển gen Ðối với trứng tiền nhân động vật có vú có đường kính khoảng 70 µm đường kính kim tiêm khoảng 0,75 µm thích hợp, phơi cá tế bào đường kính kim tiêm khoảng 3-4 µm Cuối đưa kim lên máy mài để làm sắc nhọn trơn láng đầu kim (Hình 2.8) Kim giữ chế tạo từ ống capillar có đầu nhẵn bình thường để cố định trứng trình vi tiêm Ðể tạo kim giữ, dùng máy kéo kim tự động để tạo đầu kim nhỏ sau dùng bút kim cương sợi platin đốt nóng cắt bớt đầu nhọn để tạo đầu kim với đường kính thích hợp Làm nhẵn đầu kim giữ cách để đứng kim mặt đoạn cong platin máy gia cố Ðốt nóng sợi platin điều chỉnh đầu kim giữ cho chảy từ từ Quan sát kính hiển vi dừng lại đầu kim đạt yêu cầu 64 Vi tiêm tiến hành hệ thống thiết bị vi tiêm (Hình 2.9) Hệ thống gồm có hai phận kính hiển vi máy vi thao tác Hình 2.8 : Các máy làm kim (Hãng Narishige) Máy gia cố kim Microforge Máy mài kim Máy kéo kim tự động Pipette Puller Kính hiển vi dùng cho mục đích kính hiển vi soi ngược (vật kính xoay ngược lên) Ðộ phóng đại thích hợp cho việc tiến hành vi tiêm vào phôi cá tế bào khoảng từ 40-60 lần Máy vi thao tác gồm phần giống hệt bố trí hai bên kính hiển vi, dùng để điều chỉnh kim tiêm, dùng cho kim giữ Tính máy cho phép điều chỉnh kim theo không gian chiều Kim tiêm kim giữ lắp vào máy vi thao tác nối với syringe qua ống chất dẻo nạp đầy dầu parafin Chuẩn bị dung dịch gen chuyển: gen chuyển xen vào vector plasmid tạo dòng E.coli Các vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp phát mơi trường 65 ni cấy có thuốc kháng sinh plasmid mang gen kháng thuốc đặc hiệu Các vi khuẩn sống sót sinh trưởng mơi trường dinh dưỡng thích hợp plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển chép tế bào vi khuẩn phân chia Sau đó, hàng triệu plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển tách chiết từ tế bào vi khuẩn đoạn gen chuyển tách từ plasmid tái tổ hợp nhờ sử dụng enzym hạn chế Ðể Hình 2.9: Máy vi thao tác Olympus (Hãng Narishige) Kính hiển vi soi ngược Máy vi điều chỉnh tinh sạch, gen chuyển điện di gel agarose Hoà tan gen chuyển dung dịch đệm đặc trưng (như dung dịch Tris-EDTA; dung dịch TE ) tính nồng độ dung dịch gen chuyển nhờ quang phổ kế Nồng độ dung dịch DNA sử dụng cho vi tiêm thường 1-5 µg/ml Trước chuyển vào phơi, gen chuyển kiểm tra biểu tế bào nuôi cấy chuyển nhiễm (transfection) Vi tiêm tiến hành qua bước: nạp gen vào kim tiêm phương pháp capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10-12 giờ) bơm trực tiếp dung dịch gen vào, lắp kim tiêm kim giữ vào máy vi thao tác, chuyển trứng tiền nhân vào đĩa 66 petri có chứa mơi trường đặt kính hiển vi, giữ trứng tiền nhân vào đầu kim giữ lực hút syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phôi điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí trứng tiền nhân, đẩy gen vào trứng tiền nhân cách vặn nhẹ syringe Khi thấy trứng tiền nhân phồng to trở nên sáng dừng lại kéo nhanh kim tiêm Trứng tiền nhân sau tiêm di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước tiêm trứng tiền nhân Mỗi nhóm trứng tiền nhân hồn thành chuyển sang đĩa môi trường khác để ấp đánh giá mắt vài tiếng Sau tất trứng tiền nhân nhìn thấy rõ ràng chuyển vào ống dẫn trứng nhận Cho đến nay, kỹ thuật chuyển gen vào động vật phương pháp vi tiêm dung dịch DNA vào hợp tử phương pháp có hiệu động vật có vú phương pháp chủ yếu sử dụng để chuyển gen vào vật ni Ðối với thực vật phương pháp sử dụng tế bào tiền phôi hợp tử tế bào tiền phôi hạt phấn Tuy nhiên xâm nhập gen chuyển vào DNA tế bào vật chủ trình ngẫu nhiên xác suất để gen chuyển xen vào vị trí DNA vật chủ mà cho phép biểu thấp Hiệu vi tiêm không cao (Bảng 2.1) Bảng 2.1: Hiệu vi tiêm số loài động vật (Hammer cộng sự, 1985) Loài động vật Số lượng trứng vi tiêm Số lượng sinh từ trứng vi tiêm Số lượng chuyển gen Thỏ 1907 218 (11,4%) 28 (1,5%) Cừu 1032 73 (7,1%) 1(0,1%) Lợn 2035 192 (9,4%) 20 (1%) 79 Hình 2.19: Ứng dụng kỹ thuật xung điện liệu pháp gen 80 IX Chuyển gen súng bắn gen Súng bắn gen (Gene gun) thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, thiết kế cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật phát triển vào đầu thập niên 1980 nhà thực vật học Ðại học Corrnell với nhà nghiên cứu Corrnell Nanofabrication Facility, Newyork, USA Súng bắn gen bán thị trường vào năm 1990 Ðạn sử dụng cho loại súng hạt kim loại nặng bao bọc DNA Tên xác đầy đủ súng bắn gen hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) kỹ thuật thường gọi cách đơn giản biolistics (sự kết hợp hai thuật ngữ biology (sinh học) ballistics (sự bắn tung)) Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nguyên lý chung phương pháp sử dụng áp lực xung khí helium để gai tốc hạt Hình 2.20 : Súng bắn gen (Hãng Biorad) Súng bắn gen bao gồm hai buồng thép không gỉ, kích thước 6“x7“x10“ nối với hai bơm chân khơng DNA ngoại lai gắn vào hạt tungsten có đường kính nhỏ, khoảng 1μm (các kim loại khác vàng bạc sử dụng không thường xuyên giá đắt) Các hạt đặt 81 đĩa mặt bên súng Sự bùng nổ khí helium 1000psi làm cho đĩa bắn phía trước với tốc độ 1300 food/s, tương đương với tốc độ viên đạn rời khỏi nòng súng Một chắn làm dừng đĩa lại hạt vàng hay tungsten phóng phía tế bào đích Chúng xuyên qua vách tế bào phóng thích phân tử DNA (Hình 2.21) Súng bắn gen sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để hợp biểu gen phân phối Các tế bào biến đổi di truyền sử dụng để tạo thực vật bao gồm sửa đổi di truyền mong muốn tất tế bào chúng (Voiland, 1999) Hình 2.21: Sơ đồ nguyên lý hoạt động súng bắn gen Mục tiêu súng bắn gen thường callus tế bào thực vật giống sinh trưởng môi trường gel đĩa petri Sau hạt tungsten va chạm vào đĩa, gel callus bị phá vỡ nhiều Tuy nhiên số tế bào không bị phá vỡ va chạm mạnh 82 tiếp nhận hạt tungsten bao bọc DNA cuối phân tử DNA ngoại lai xâm nhập hợp vào nhiễm sắc thể thực vật Các tế bào từ đĩa petri tập hợp lại chọn lọc tế bào hợp thành công biểu DNA ngoại lai kỹ thuật hóa sinh đại sử dụng gen chọn lọc nối tiếp Northern blots Các tế bào đơn chọn lọc từ callus xử lý với số hormone thực vật auxin, gibberelin tế bào phân chia, biệt hóa thành tế bào mơ, quan, tế bào chun hóa tồn Cây có nguồn gốc từ tế bào nảy mầm thành công mang đặc tính di truyền Hình 2.22: Chuyển gen súng bắn gen Phương pháp có ưu điểm thao tác dễ dàng, chuyển gen vào nhiều loại tế bào mô, tế bào biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa gen vào tế bào vị trí mong muốn Do sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Các ứng dụng kỹ thuật bắn gen bao gồm - Tạo thực vật chuyển gen: phương pháp sử dụng rộng rãi lĩnh vực tạo ngũ cốc chuyển gen Bacillus thuringiensis loài vi khuẩn tổng hợp protein crystal (crys1Ab crys1Ac) có khả giết cách chọn lọc nhóm trùng định Gen mã hoá protein crystal gọi gen 83 Bt Gen Bt bắn vào mô sẹo ngũ cốc (Rassmussen, 1994) Trong tế bào sửa chữa tổn thương, DNA ngoại lai xâm nhập vào genome tế bào chủ Vì cho phép tế bào chủ phiên mã giải mã gen Bt Sau lần q trình biến nạp hồn thành người ta tiến hành sàng lọc theo phương pháp truyền thống dựa sở marker chọn lọc xen vào DNA cấu trúc (Brettschneider, 1997) Các marker chọn lọc mang tính kháng (kháng thuốc kháng sinh hay kháng thuốc diệt cỏ) kanamycin một marker phổ biến sử dụng - Tiêm chủng vaccine di truyền: gen đưa vào thể súng bắn gen với mục đích gây phản ứng miễn dịch với protein biểu gen chuyển Phương pháp tiêm chủng vaccine an toàn phương pháp khác DNA ngoại lai đưa vào khơng có protein ngoại lai (Lin, 2000) - Liệu pháp gen tự sát (Suicide gene therapy): phương pháp bắn gen sử dụng điều trị bệnh ung thư Một gen biểu protein gây độc có promoter đặc hiệu khối u đưa vào tế bào khối u Khi protein biểu tế bào khối u chết Protein gây độc tế bào khối u promoter đặc hiệu cần cho biểu tạo tế bào khối u (Lin, 2000) - Sự điều biến miễn dịch (Immunomodulation): phương pháp sử dụng để chống lại ung thư Sử dụng súng bắn gen, protein biểu tế bào khối u làm cho phản ứng miễn dịch tăng lên đưa vào tế bào Phản ứng miễn dịch tăng lên nhắm vào tế bào khối u hiển nhiên gây hiệu mong muốn (Lin,2000) - Dược lý di truyền: súng bắn gen sử dụng để đưa gen tổng hợp protein hữu ích hay protein liệu pháp vào thể Ví dụ yếu tố đơng máu thể rối loạn đông máu tăng tổng hợp hồng cầu thể thiếu máu Sự biểu kéo dài gen đưa vào vấn đề, nhiều trường hợp thường đòi hỏi phân phối gen phức tạp (Lin, 2000) - Súng bắn gen công cụ nghiên cứu: súng bắn gen sử dụng để xen promoter mà dẫn đến biểu 84 gen định Hiệu khuyếch đại protein định phương pháp có giá trị lớn nhà khoa học để nghiên cứu chức protein (Lin, 2000) X Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium Agrobacterium có khả xâm nhiễm tế bào thực vật cách chuyển đoạn DNA vào tế bào thực vật Khi DNA vi khuẩn hợp với nhiễm sắc thể thực vật, cơng vào hệ thống tổ chức tế bào cách có hiệu sử dụng để đảm bảo cho sinh sôi quần thể vi khuẩn Thật không may mắn cho nhà trồng ăn gặp phải lồi vi khuẩn Bởi thủ phạm gây bệnh khối u hình chóp bệnh lơng rễ nhiều lồi cảnh ăn Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium có hiệu số lồi khơng phải tất thực vật biến nạp đường Ðặc biệt, lớp mầm bao gồm ngũ cốc giới lúa, lúa mì ngơ không biến nạp dễ dàng nhờ A tumefaciens Ðể khai thác sử dụng A tumefaciens vector chuyển gen nhà khoa học loại bỏ gen gây khối u gen mã hoá opine T - DNA thay vào marker chọn lọc, trì vùng bờ phải bờ trái T-DNA gen vir Gen chuyển xen vào vùng bờ TDNA Nó chuyển vào tế bào trở nên hợp với nhiễm sắc thể tế bào thực vật Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium kiểm tra xâm nhập bền vững, biểu di truyền gen chuyển đặc biệt Tuy nhiên, vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu biến nạp loại mô biến nạp, giai đoạn phát triển mô, mức độ khởi đầu vi khuẩn A tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau biến nạp, marker sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng kiểu gen thực vật 85 Hình 2.23: Tạo thực vật chuyển gen phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium 86 XI Chuyển gen vào tinh trùng tiền thể tinh trùng Chuyển gen vào tinh trùng Tinh trùng trưởng thành có genome bất hoạt khơng có khả tái DNA bao phủ protamine làm cho DNA ngoại lai khó vào genome tinh trùng Vì DNA ngoại lai khơng có hội để hợp vào DNA tinh trùng Các thí nghiệm thực cách khoảng gần thập kỷ cho thấy tinh trùng ủ với DNA mang DNA đến trứng q trình thụ tinh dẫn đến kết tạo chuột chuyển gen Các nghiên cứu hóa sinh học cho thấy DNA bám vào tinh trùng cách dễ dàng không chứng minh điều xảy xâm nhập DNA Vì tinh trùng đóng vai trò thể truyền DNA ngoại lai Sau vài năm, phương pháp áp dụng rộng rãi với bò, lợn, cừu cá medaka (Hình 2.24) Trong tất trường hợp khơng hiểu thí nghiệm khó thành cơng Hơn nữa, phần lớn trường hợp, DNA ngoại lai hợp vào genome vật chủ xếp lại mức độ cao Một nghiên cứu cho thấy sau rửa cẩn thận, tinh trùng chứa DNAse phân hủy DNA ngoại lai DNAse có nhiều nguyên sinh chất tinh trùng lượng enzyme bám vào tinh trùng thay đổi giải thích thí nghiệm không thành công DNA ngoại lai bị phân cắt DNA ngoại sinh dường gây hoạt tính DNAse tinh trùng tách chiết Có thể giải thích tượng DNAse phương tiện để bảo vệ tinh trùng tránh khỏi nhiễm DNA ngoại sinh đường từ mào tinh hoàn đến tế bào trứng (Baccetti Spadafora, 2000) Các thử nghiệm để tăng DNA xâm nhập vào tinh trùng thực Sự xung điện chuyển nhiễm với tác nhân hóa học làm tăng hấp thu DNA vào tinh trùng Hiện tượng thường kèm theo khả thụ tinh cho bào trứng tinh trùng 87 Ở Xenopus, chuyển gen vào phôi vi tiêm dẫn đến biểu gen ngoại lai tồn từ vài ngày đến vài tuần lại không hợp vào genome vật chủ Ðể khắc phục khó Hình 2.24: Chuyển gen vào tinh trùng A Tinh trùng rửa ủ với DNA sử dụng để thụ tinh in vivo in vitro Phương pháp khơng có hiệu đặc hiệu việc tạo động vật chuyển gen gen hợp thường bất hoạt xếp lại DNA B Màng tinh trùng bị tổn thương chất tẩy nhẹ DNA ngoại lai vào tinh trùng cách tự Các tinh trùng sử dụng để thụ tinh in vitro phương pháp ICSI khăn này, nhà nghiên cứu sử dụng tinh trùng làm thể mang (carrier) Protocol xác định sớm cho động vật có vú chứng tỏ không hiệu Xeponus Ðể tăng khả hấp thu DNA, tinh trùng xử lý với Triton, chất tẩy nhẹ Ðiều dẫn đến không ổn định màng tinh trùng làm cho DNA tự vào tinh trùng Kết tương tự đạt làm lạnh ấm tinh trùng Chromatin bị phân hủy enzyme hạn chế nhận biết vài vị trí chromatin tinh trùng DNA ngoại lai khơng xảy Ðiều gây chế sửa chữa làm tăng hội hợp DNA ngoại lai vào genome phơi Phương 88 pháp có tên gọi REMI (restriction enzyme mediated intergration=sự hợp qua trung gian ezyme hạn chế), phương pháp làm tăng biến nạp tế bào Sau xử lý này, tinh trùng khả thụ tinh cho trứng Tiêm trực tiếp tinh trùng vào trứng (intra-cytoplasmic sperm ịnjection=ICSI) sử dụng thụ tinh in vitro người Phương pháp áp dụng cho Xeponus tạo Xeponus chuyển gen với kết chấp nhận (Hình 2.12B) Ðặc biệt nhà sinh học ứng dụng chuyển gen vào loài để nghiên cứu phát triển (Marrsh-Arrmstrong, 1999; Perrny, 2001) Phương pháp này, trước tiên sử dụng cho Xeponus, chứng tỏ thành cơng chuột Tuy nhiên không cho kết cao phương pháp vi tiêm vào tiền nhân phương pháp đơn giản nhiều Phương pháp ISCI sử dụng thành công hoàn toàn chuột chuyển đoạn DNA dài thiết kế vector BAC YAC (Perry, 2001) Vì phương pháp áp dụng rộng rãi loài khác kể gia súc lớn Hiện hạn chế việc sử dụng ICSI lồi khó khăn Dường khơng thể áp dụng với lồi khơng thuộc Linh trưởng mà việc chuyển gen khó sử dụng phương pháp khác Gần đây, phương pháp tuyệt vời đề xuất (Qian, 2001) DNA bám vào kháng thể đơn dòng nhận biết protein bề mặt tinh trùng hình thành nên phức hợp ổn định với tinh trùng Phương pháp sử dụng để thụ tinh in vitro chuột, gà thụ tinh nhân tạo lợn cách tiêm vào sừng tử cung Trong ba trường hợp này, khoảng 30% cá thể sinh động vật chuyển gen Gen chuyển không bị xếp lại Nó biểu truyền lại cho hệ sau Ðiều quan tâm kháng thể đơn dòng giống nhận biết tinh trùng động vật có xương sống thấp cao kể người Phương pháp dùng để tạo Linh trưởng chuyển gen Chuyển gen vào tiền thể tinh trùng in vitro Tinh trùng thành thục tạo từ tế bào gốc thông qua giai đoạn khác biệt hóa (Hình 2.25) Các tế bào gốc 89 tinh trùng tách chiết, nuôi cấy in vitro thời gian ngắn cấy chuyển vào tinh hoàn nhận Các tế bào cấy chuyển hoạt động theo chương trình biệt hóa chúng làm cho tinh trùng hoạt động chức Tỉ lệ tinh trùng tạo thành từ tế bào gốc cấy chuyển tăng lên nhiều nhờ xử lý đực nhận với bisulfan Bisulfan loại thuốc ngăn cản biệt hóa tế bào gốc tinh hoàn Protocol sử dụng cách thành công để chuyển gen vào tế bào gốc q trình ni cấy Ðiều đạt nhờ sử dụng vector retrovirus hiệu Các tế bào gốc cấy chuyển vào đực nhận xử lý bisulfan dẫn đến kết Hình 2.25: Sử dụng tế bào tiền thể tinh trùng để chuyển gen A Các bước khác biệt hóa tế bào gốc thành tinh trùng B Các tế bào gốc tế bào biệt hóa cách cục tách chiết, nuôi cấy chuyển DNA chọn lọc vào Tinh trùng mang DNA ngoại lai sử dụng để thụ tinh phương pháp ICSC C Tế bào gốc tách chiết, nuôi cấy điều kiện ngăn cản biệt hóa chúng, chuyển DNA ngoại lai vào, 90 chọn lọc đưa vào lại tinh hoàn nhận, nơi mà chúng biệt hóa Tinh trùng tạo sử dụng để thụ tinh trứng phương pháp thông thường tạo chuột chuyển gen với tỉ lệ cao, khoảng 4%(Nagano, 2001) Phương pháp hữu dụng để nghiên cứu ảnh hưởng sinh học gen trình thành thục tế bào gốc tinh trùng để tạo động vật chuyển gen Có thể suy phương pháp thành cơng lồi lớn chuột Dường cần thiết phải sử dụng tế bào biến nạp cao để tăng hội định cư tinh hoàn với tỉ lệ chấp nhận 2.2 Chuyển gen vào tiền thể tinh trùng in vivo DNA liên kết với thể chuyển nhiễm tiêm vào ống sinh tinh (Hình 2.26) Một số nhóm nghiên cứu thành cơng việc tạo chuột chuyển gen cách sử dụng tinh trùng động vật xử lý (Sato, 2002) Những kết khích lệ có hiệu vừa phải chưa đạt chuẩn Hiện chúng cải tiến chắn chưa có cách làm cho áp dụng rộng rãi phương pháp động vật lớn chuột Quả thực cấu trúc ống dẫn tinh khác việc tiêm DNA khó Mặt khác, lượng DNA tiêm vào lớn khó điều khiển Hình 2.26: Chuyển gen vào tiền thể tinh trùng cách trực tiếp 91 DNA bình thường DNA bám vào thể chuyển nhiễm tiêm trực tiếp vào ống sinh tinh Các tế bào hợp DNA ngoại lai tạo động vật chuyển gen sau thụ tinh bình thường Một điểm khác cần nghiên cứu Ðó chuột, gen chuyển vào tiền thể tinh trùng in vivo xảy cách độc lập tế bào khác dẫn đến tạo động vật sơ sinh có hợp khác Ðây thuận lợi hợp khác cho kiểu hình khác biệt Với phương pháp này, nhà nghiên cứu đánh giá dòng động vật chuyển gen phức tạp từ thí nghiệm đơn giản XII Kỹ thuật viên gen (Gene pill) Kỹ thuật viêm gen phương pháp điều trị bệnh liệu pháp gen thông qua đường uống thuốc Một lượng DNA liệu pháp (dạng plasmid hay phức hợp DNApeptid) bọc màng lipid hỗn hợp đặc hiệu màng bọc viên thuốc thông thường tạo viên gen Viên gen đưa vào thể theo đường miệng cách uống Sau được phóng thích, gen liệu pháp hấp thụ qua màng vào tế bào biểu mô ruột Ở gen liệu pháp phiên mã dịch mã thành protein dược phẩm Protein dược phẩm tiết vào máu, đến mô bệnh để ức chế hoạt động gen bệnh (Hình 2.27) Kỹ thuật viên gen phương pháp (được cấp phát minh vào ngày 3/5/2001) lần sử dụng để chữa bệnh tiểu đường cách sử dụng viên gen tạo thành từ DNA mã hóa inssulin Phương pháp khắc phục hạn chế phương pháp truyền thống vấn đề liều lượng phân phối thuốc Nó cách mạng hóa liệu pháp gen cho bệnh nhân chọn lựa để đưa insulin vào thể hàng ngày Tuy nhiên, tính có ích viên gen phụ thuộc vào biểu phân phối gen tế bào ruột non chưa chắn có thích hợp protein cần thiết với liều lượng khớp cách tinh vi không 92 Hình 2.27: Sơ đồ chế hoạt động viên gen Viên gen phân phối DNA đến ruột non DNA hấp thụ vào tế bào ruột Protein dược phẩm tổng hợp tế bào Protein dược phẩm tiết vào máu Kỹ thuật viên gen khai thác cách tích cực khoảng thời gian sống ngắn tế bào biểu mô tính có lợi phân chia cách nhanh chóng tế bào đích xếp thành hàng ruột non Về mặt lý thuyết, liệu pháp gen thơng qua đường uống phân phối gen tổng hợp protein cho loại tế bào đơn ruột non, đáp ứng yêu cầu tìm vector chiến lược biến nạp cho loại tế bào đích Tuy nhiên phương pháp cho hiệu chưa cao sử dụng tế bào ruột non làm tế bào đích bị giảm nhiều nhóm tế bào có thời gian sống ngắn (2-3 ngày), môi trường acid DNAse hệ dày ruột Mặt khác, viên gen mang gen ngoại lai có kích thước nhỏ Hiện người ta tạo số loại viên gen sử 93 dụng điều trị thử nghiệm Trong tương lai viên gen trở thành kỹ thuật có hiệu để điều trị bệnh liệu pháp gen Tài liệu tham khảo Makrides SC 2003 Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells Elsevier Science B V USA Louis-Marie H 2003 Animal Transgenesis and Cloning John Wiley and Sons, Ltd USA Glick BR., Jackj P 1994 Molecular Biotechnology ASM Press Washington D.C USA Chopra VL., Anwan N 1990 Genetic Engineering and Biotechnology Oxford and IBH Publishing CO.PVT, Ltd UK John D, Roderick S, Philip A, Richard W 1988 Plant Genetics Transformation and Gene Expression (A Laboratory Manual) Blackwell Scientific Publications UK ... hoàn với tỉ lệ chấp nhận 2. 2 Chuyển gen vào tiền thể tinh trùng in vivo DNA liên kết với thể chuyển nhiễm tiêm vào ống sinh tinh (Hình 2. 26) Một số nhóm nghiên cứu thành công việc tạo chuột chuyển... trứng vi tiêm Số lượng chuyển gen Thỏ 1907 21 8 (11,4%) 28 (1,5%) Cừu 10 32 73 (7,1%) 1(0,1%) Lợn 20 35 1 92 (9,4%) 20 (1%) 67 Hình 2. 10: Chuyển gen vi tiêm V Phương pháp chuyển gen nhờ vector virus Vào... tổng hợp từ gen thay gen sai hỏng điều trị rối loạn di truyền (Hình 2. 19)(Inovio, 20 02) 79 Hình 2. 19: Ứng dụng kỹ thuật xung điện liệu pháp gen 80 IX Chuyển gen súng bắn gen Súng bắn gen (Gene gun)