TÀI LIỆU VỀ NHÂN BẢN VÔ TÍNH

1959 Thỏ ra đời bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm.1968 Edwards và Bavister thụ tinh trứng người trên in vitro.1979 Karl Illmensee công bố nhân bản được ba con chuột từ một phôi ban đầu. 1984 Steen Willadsen nhân bản thành công cừu từ các tế bào phôi bằng kỹ thuật chuyển nhân tế bào phôi. 1986 Steen Willadsen nhân bản một con bò từ các tế bào phôi một tuần tuổi đã biệt hóa. 1993 Bò được tạo ra bằng cách chuyển nhân từ các tế bào phôi nuôi cấy1996 Ian Wilmut và Keith Campbell ở viện Roslin, Scotland nhân bản thành công cừu Dolly từ các tế bào tuyến vú của một con cừu mẹ. 1998 Ryuzo Yanagimachi, Toni Perry, và Teruhiko Wakayama ở đại học Hawaii công bố đã nhân bản thành công 50 chuột từ các tế bào đã trưởng thành. Kỹ thuật nhân bản mới này do Wakayama phát triển và được chứng minh là hiệu quả hơn phương pháp dùng nhân bản cừu Dolly.1999 Khỉ Rhesus cái Tetra được nhân bản bằng phân chia các tế bào phôi sớm2002 Thỏ và mèo được nhân bản từ các tế bào trưởng thành.82005, Tiến sĩ Hwang cho ra đời con chó đầu tiên bằng sinh sản vô tính

Tạo dòng vô tính

1 Khái niệm

Nhân bản vô tính là hiện tượng chuyển nhân của một

tế bào soma vào một tế bào trứng đã lấy mất nhân, rồi kích thích phát triển thành phôi, từ đó làm cho phôi phát triển thành một cơ thể mới

2 Lịch sử tạo dòng vô tính

1959 - Thỏ ra đời bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm

1968 - Edwards và Bavister thụ tinh trứng người trên in vitro

1979 - Karl Illmensee công bố nhân bản được ba con chuột từ một phôi ban đầu

1984 - Steen Willadsen nhân bản thành công cừu từ các tế bào phôi bằng kỹ thuật chuyển nhân tế bào phôi

1986 - Steen Willadsen nhân bản một con bò từ các tế bào phôi một tuần tuổi đã biệt hóa

1993 - Bò được tạo ra bằng cách chuyển nhân từ các tế bào phôi nuôi cấy

1996 - Ian Wilmut và Keith Campbell ở viện Roslin, Scotland nhân bản thành công cừu Dolly từ các tế bào tuyến vú của một con cừu

mẹ

1998 - Ryuzo Yanagimachi, Toni Perry, và Teruhiko Wakayama ở đại học Hawaii công bố đã nhân bản thành công

50 chuột từ các tế bào đã trưởng thành Kỹ thuật nhân bản mới này do Wakayama phát triển và được chứng minh là hiệu quả hơn phương pháp dùng nhân bản cừu Dolly

1999 - Khỉ Rhesus cái Tetra được nhân bản bằng phân chia các

tế bào phôi sớm

2002 - Thỏ và mèo được nhân bản từ các tế bào trưởng thành.8/2005, Tiến sĩ Hwang cho ra đời con chó đầu tiên bằng sinh sản vô tính

3 Quy trình chung nhân bản vô tính động vật

- Lấy tế bào trứng (nhân đơn bội) của cơ thể “mẹ”, hút bỏ nhân đơn bội

- Lấy tế bào thân trưởng thành (máu, da …) của cá thể sẽ nhân bản, đồng bộ hóa chu trình tế bào của tế bào này, hút lấy nhân lưỡng bội

- Đưa nhân lưỡng bội vào trong trứng đã hút bỏ nhân nói trên (bằng tiêm trực tiếp hoặc bằng kích thích xung điện) để tạo nên “hợp tử” hay “phôi vô tính”

- Kích thích để “hợp tử” tiếp tục phát triển và phân chia tạo nên khối blastocyst (dùng shock điện hoặc dùng môi trường có chứa chất cytochalasin B)

- Sau đó khối blastocyst này được đem cấy vào tử cung của một

“mẹ nuôi” để cho phát triển thành bào thai, qua đó có thể tạo nên một “bản sao” giống hệt cơ thể cho nhân tế bào

4 Nhân bản vô tính cừu Dolly

- Năm 1996 Ian Wilmus, Keith Campbell và các cộng sự tạo

ra cừu Dolly

- Từ 277 quả trứng có 29 phôi được tạo thành, chỉ có 3 con cừu được sinh ra và có duy nhất Dolly sống sót

- Đầu tiên một tế bào (tế bào cho thông tin di truyền) được lấy ra từ tuyến vú của một cừu mẹ Finn Dorset Tế bào này sau đó được nuôi cấy nhân lên trên in vitro nhằm tạo ra nhiều bản sao nhân tế bào Sau

đó một tế bào được lấy ra khỏi nuôi cấy và đưa vào trong môi trường thiếu dinh dưỡng (lượng chất dinh dưỡng chỉ vừa đủ giữ cho

tế bào không chết) nhằm làm ngừng hoàn toàn chu kỳ tế bào

- Loại bỏ nhân của tế bào trứng chưa thụ tinh lấy từ một cừu Scottish Blackface Đặt tế bào trứng này sát vách tế bào cho (đã đưa

về pha G0) Sau khi rút nhân trứng từ 1 đến 8 tiếng, cho một dòng điện chạy qua hai tế bào này, có tác dụng hòa tế bào trứng (đã bỏ nhân) và tế bào cho nhân với nhau, đồng thời khởi động tế bào mới tạo thành phát triển thành phôi Nếu phôi đó sống, nó được cho phát triển trong khoảng 6 ngày và cuối cùng được đặt vào tử cung cừu cái mang cho phát triển thành thai và sinh sản như bình thường

- Phục vụ cho lợi ích kinh tế

- Thay thế các bộ phận cho con người

- Phục vụ cho nghiên cứu và y học

- Khôi phục một số loài động vật bị tuyệt chủng, bảo tồn nguồn gen quý, cải thiện chất lượng giống gia súc

6 Ý nghĩa của việc tạo dòng động vật

CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT

CHUYỂN GEN

I Ðộng vật chuyển gen

Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào trong DNA genome của nó Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ thành công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau

II Công nghệ tạo động vật chuyển gen

Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp và

ở những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội dung cơ bản gồm các bước chính sau: tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật; tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen; biến nạp gen vào phôi động vật; nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao); phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ và tạo

ra dòng động vật chuyển gen gốc một cách liên tục, sản xuất động vật chuyển gen

Hình 4.1: Sơ đồ tạo động vật chuyển gen

1 Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong

tế bào động vật

1.1 Tách chiết, phân lập gen mong muốn

• Một gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập và tinh chế hay nói cách khác là nó phải được tạo dòng Các công cụ sử dụng để tạo dòng bao gồm các enzyme đặc biệt có hoạt tính cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase), các mẫu dò (probe), vector và tế bào vật

chủ Tế bào vật chủ thường được sử dụng là tế bào vi khuẩn E.coli và

vector thường được sử dụng là plasmid

• Việc tách chiết một gen riêng lẻ là rất phức tạp bởi vì DNA mẫu chứa hàng triệu gen Do đó để thực hiện điều này, DNA mẫu chứa gen mong muốn và vector plasmid phải được cắt bởi cùng một loại enzyme hạn chế Các đoạn DNA mẫu sau khi được cắt có mang gen mong muốn sẽ được xen vào vector plasmid và các đầu của các đoạn DNA mẫu này và các đầu của vector plasmid sẽ được nối với nhau nhờ ligase tạo thành plasmid tái tổ hợp Sau đó các plasmid tái tổ hợp

được biến nạp vào các tế bào vi khuẩn E.coli và các tế bào vi khuẩn

tiến hành sinh trưởng

Vào thời điểm này, các tế bào vi khuẩn chứa plasmid mang gen mong muốn sẽ được phát hiện bằng mẫu dò Chúng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để sinh trưởng phát triển tạo ra hàng triệu bản sao của vector chứa gen này Vector chứa gen này sẽ được tách ra khỏi tế bào vi khuẩn và gen mong muốn sẽ được tách chiết Phương pháp này có thể tạo ra hàng triệu bản sao của gen mong muốn mà không bị nhiễm bởi các gen khác Gen chuyển có nguồn gốc từ genome này chứa các đoạn exon

mã hoá và các đoạn intron không mã hoá (Hình 4.2)

Hình 4.2: So sánh hai dạng gen chuyển

Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn từ sản phẩm biểu hiện của nó như mRNA hoặc protein Từ mRNA dưới tác động của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch đơn (single strand complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA) DNA bổ sung (complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không chứa các intron mà chỉ bao gồm các exon (Hình 4.2) Hoặc từ sản phẩm protein,

có thể suy ra trình tự nucleotid của gen cấu trúc trên cơ sở trình tự các axit amin trong phân tử protein Sau đó có thể thiết kế cặp mồi (primer)

để dò tìm đoạn gen mong muốn

1.2 Tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật

• Ðể tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật, các vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các loài khác nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và ligase Tất cả các thành phần của gen có thể được tách chiết và tái tổ hợp để tạo thành một cấu trúc gen chuyển biểu hiện (Hình 4.3)

• Ở các đầu của cấu trúc đầy đủ này có thể được sửa đổi bằng cách bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận biết các enzyme hạn chế khác nhau Trình tự polylinker cho phép có thể xen vào cấu trúc này một vector để kiểm tra và tạo dòng

• Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có vai trò điều hoà sự biểu hiện của gen Các yếu tố điều hoà cũng có thể nằm ở trong đoạn intron Yếu tố điều hoà ở gần đầu 5’ của gen là promoter,

có vai trò quyết định trong việc điều hoà sự biểu hiện của gen

Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc hoặc từ động vật như methallothionein (MT), thymidine kinase, ß-actin, amylase, insulin, ß-lactoglobulin, adiposite P2 hoặc từ virus động vật như Simian virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV)

Hình 4.3: Sơ đồ cấu trúc gen chuyển biểu hiện

enhancer: gen tăng cườngATG: vị trí khởi đầu phiên mãSIG: trình tự tín hiệu

AAA: đuôi polyA

2 Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen

• Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân của tinh trùng và trứng chưa dung hợp (fusion) với nhau Ở giai đoạn này tổ hợp gen lạ

có cơ hội xâm nhập vào genome của động vật nhờ sự tái tổ hợp DNA của tinh trùng và của trứng Do tế bào phôi chưa phân chia và phân hoá nên tổ hợp gen lạ được biến nạp vào giai đoạn này sẽ có mặt ở tất

cả các tế bào kể cả tế bào sinh sản của động vật trưởng thành sau này

• Ðối với động vật có vú, trứng chín được thu nhận bằng phương pháp

sử dụng kích dục tố theo chương trình đã được xây dựng cho mỗi loài hoặc bằng phương pháp nuôi cấy trứng trong ống nghiệm Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân

- Ðối với cá, giai đoạn biến nạp thích hợp là phôi ở giai đoạn 1-4 tế bào Giai đọan này được tạo ra bằng thu nhận trứng, tinh dịch bằng phương pháp sử dụng kích dục tố (kích thích tố trong nhau thai của người (HCG) hoặc não thuỳ thể cá chép ), rồi thụ tinh nhân tạo.

3 Chuyển gen vào động vật

• Hiện nay có nhiều phương pháp khác chuyển gen nhau đang được sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiêm, chuyển gen bằng cách sử dụng các tế bào gốc phôi, chuyển gen bằng cách sử dụng vector virus

4 Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm

• Tế bào trứng tiền nhân sau khi vi tiêm được nuôi cấy trong ống nghiệm để phát triển đến giai đoạn phôi dâu (morula) hoặc túi phôi (blastocyst) Ở giai đoạn này màng trong (pellucida) bị bong ra và phôi có thể làm tổ được ở dạ con Những phôi này được cấy chuyển vào con nhận đã được gây chửa giả (pseudopregnant) để phát triển thành cá thể con

• Ðối với động vật bậc thấp như cá không cần giai đoạn này

• Tuy nhiên ở cá, trứng sau khi thụ tinh màng thứ cấp (chorion) dày lên, rất dai và dính gây trở ngại cho việc định vị chính xác mũi kim tiêm vào vị trí mong muốn để có thể đưa được DNA vào trứng (Hình 4.4A) Mặt khác giai đoạn phôi một tế bào ở cá rất ngắn trong khi đó việc vi tiêm đòi hỏi nhiều thao tác tỉ mỉ và chính xác Ðể khắc phục các nhược điểm này, người ta có thể tiến hành loại màng thứ cấp (Hình 4.4B), kéo dài giai đoạn phôi 1-4 tế bào và ấp nhân tạo phôi trần để tạo cá bột

Hình 4.3: Trứng cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) trước và sau khi

khử màng thứ cấp (chorion)

A.Trứng cá chạch chưa khử màng thứ cấp B.Trứng cá chạch đã được khử màng thứ cấp

5 Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen

• Ðể khẳng định động vật có được chuyển gen lạ vào hay không, người

ta phải kiểm tra xem gen lạ có xâm nhập được vào bộ máy di truyền của động vật trưởng thành hay không và sản phẩm của gen lạ có được tổng hợp ra hay không

• Ðối với vấn đề thứ nhất người ta sử dụng phương pháp lai phân tử trên pha rắn (Southern blot, Northern blot ) hoặc PCR

• Ðối với vấn đề thứ hai, sản phẩm của gen lạ được đánh giá ở hai mức độ: phiên mã và dịch mã Sản phẩm phiên mã được đánh giá bằng phương pháp RT-PCR, sản phẩm dịch mã được đánh giá bằng phương pháp Western blot, ELISA hoặc kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA)

để phát hiện protein lạ trong động vật

• Theo dõi các thế hệ sau của động vật chuyển gen (F1, F2, F3, ) để xác định gen lạ có di truyền hay không

6 Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục

Sau khi kiểm tra thấy gen ngoại lai đã được di truyền ổn định, tiến hành lai tạo và chọn lọc để tạo dòng động vật chuyển gen

1 Chuột chuyển gen

- Năm 1982, Palmiter và Brinster tạo ra động vật chuyển gen đầu tiên Hai ông đã chuyển gen của loài chuột này sang

phôi của loài chuột khác và gen được chuyển đã biểu hiện ở chuột chuyển gen và thế hệ con cháu của nó

- Quy trình :

+ Chuyển một gen ngoại lai vào trứng chuột thụ tinh

+ Cấy các trứng đã được chuyển gen vào các chuột mẹ

thay thế

+ Nhân giống chuột thế hệ con để kiểm tra sự di truyền

III MỘT SỐ THÀNH TỰU

Quy trình tạo chuột chuyển gen (transgenic mice) Chiết tách các gen cần cấy vào cơ thể chuột, sau đó cấy gen này vào trứng chuột Đưa trứng đã cấy gen này vào trong tử cung chuột mẹ trung gian để tạo ra thế hệ con cái có mang gen cần cấy.

- Phương pháp :

+ Sử dụng các vector retrovirus để lây nhiễm các DNA vào các tế bào ở giai đoạn phôi sớm trước khi cấy vào con cái nhận

+ Dùng phương pháp vi tiêm, tiêm DAN vào tiền nhân đực của trứng đã thụ tinh

- việc tạo ra chuột chuyển gen là một định hướng quan trọng trong ngiên cứu liệu pháp gen để diều trị các rỗi loạn gây nên bởi các lỗi của mã di truyền

- Palmiter và Brinster đã phát hiện ra cơ chế đọc mã di truyền

và dịch các thông tin đó thành cấu trúc sinh học

- Cơ sở của kỹ thuật chuyển gen mà họ sử dụng dựa trên cấu trúc của gen có 2 vùng là vùng mã hóa protein và vùng điều hòa hoạt động gen khi mà gen ngoại lai được đưa vào thì được nối với vùng điều hòa và chịu sự chi phối của vùng

- Cho đến nay thì hàng trăm gen khác nhau đã được đư vào các dòng chuột khác nhau đã tạo ra hàng trăm dòng chuột chuển gen khác nhau.

- ứng dụng

+ Cung cấp hiểu biết về sự điều hòa hoạt động gen, sự phát triển các khối u ứng dụng trong việc nghiên cứu điều trị các bệnh ung thư, tiểu đường…

+ Sử dụng chuột chuyển gen để sản xuất các protein quý hiếm thông qua tuyển sữa và nước tiểu

Cấy gene người vào chuột

[nguồn 27/09/2005 - Sinh học Việt Nam)

Các nhà khoa học do Victor

Tybulewicz đứng đầu tại Viện

Sức khoẻ y tế quốc gia ở

London và Viện thần kinh học

đã lần đầu tiên chuyển ghép

Các nhà khoa học thuộc Trung tâm Nghiên cứu khoa học quốc gia Pháp đã chuyển gen thành công tạo ra những con chuột mang các tế bào có chứa một loại protein huỳnh quang

2 Thỏ chuyển gen

- Tạo thỏ chuyển gen lần đầu tiên thành công vào năm 1985, với việc chuyển gen hormone sinh truơngr có cấu trúc MT-hGH

- Năm 2001, Kac và một nhà di truyền học pháp đã tạo ra một con thỏ chuyển gen có khả năng phát ra màu lục trong tối

- Phương pháp : sử dụng vi tiêm như ở chuột

- ứng dụng : ngiên cứu thỏ chuyển gen để tạo ra protein quý

sử dụng trong y dược thông qua tuyến sữa

- Việc sử dụng thỏ chuyển gen ngày càng rộng rãi bởi các lý do:

+ Một thỏ cái có thể cho lương sữa 15lit mỗi năm Và

lượng protein khoảng 1-10/lit sữa

Thỏ được chuyển gen huỳnh quang

3 Lợn chuyển gen

- Năm 1985, hammer và cộng sự đã chuyển thành công gen

GH vào lợn bằng phương pháp gắn Promotor MT vào gen tạo GH

- Quy trình :

+ Ly tâm các hợp tử của lợn để nhìn thấy các tiền nhân.+ Nuôi cấy invitro các hợp tử đến giai đoạn phôi dâu hoặc phôi nang

+ Dùng phương pháp vi tiêm để chuyển các gen ngoại lai vào hợp tử

+ Nuôi cấy các hợ tử phát triển thành lợn con

- Các gen ngoại lai đã được chuyển thành công vào chuột là: mMT-hGH, mMT-bGH , mMT-pGH