Quy trình tạo chuột chuyển gen (transgenic mice). Chiết tách các gen cần cấy vào cơ thể chuột, sau đó cấy gen này vào trứng chuột. Đưa trứng đã cấy gen này vào trong tử cung chuột mẹ trung gian để tạo ra thế hệ con cái có mang gen cần cấy.
- Phương pháp :
+. Sử dụng các vector retrovirus để lây nhiễm các DNA vào các tế bào ở giai đoạn phôi sớm trước khi cấy vào con cái nhận.
+. Dùng phương pháp vi tiêm, tiêm DAN vào tiền nhân đực của trứng đã thụ tinh.
- việc tạo ra chuột chuyển gen là một định hướng quan trọng trong ngiên cứu liệu pháp gen để diều trị các rỗi loạn gây nên bởi các lỗi của mã di truyền.
- Palmiter và Brinster đã phát hiện ra cơ chế đọc mã di truyền và dịch các thông tin đó thành cấu trúc sinh học.
- Cơ sở của kỹ thuật chuyển gen mà họ sử dụng dựa trên cấu trúc của gen có 2 vùng là vùng mã hóa protein và vùng điều hòa hoạt động gen. khi mà gen ngoại lai được đưa vào thì được nối với vùng điều hòa và chịu sự chi phối của vùng này.
+. Hai ông đã sử dụng Promoter metallothionein (MT) làm thí ngiệm, promoter bình thường được hạt hóa bơỉ
cadimium, nhưng khi được nối với gen mã hóa thymidin kiase thì cadimium sẽ hoạt hóa gen thymidin kiase.
+. Bằng cách này người ta gắn promoter MT với gen tạo hormone chuột cống chuyển vào cho chuột nhắt để tạo chuột nhắt khổng lồ.
- Cho đến nay thì hàng trăm gen khác nhau đã được đư vào các dòng chuột khác nhau đã tạo ra hàng trăm dòng chuột chuển gen khác nhau.
- ứng dụng
+. Cung cấp hiểu biết về sự điều hòa hoạt động gen, sự phát triển các khối u..ứng dụng trong việc nghiên cứu điều trị các bệnh ung thư, tiểu đường…
+. Sử dụng chuột chuyển gen để sản xuất các protein quý hiếm thông qua tuyển sữa và nước tiểu.
Cấy gene người vào chuột
[nguồn 27/09/2005 - Sinh học Việt Nam)
Các nhà khoa học do Victor Tybulewicz đứng đầu tại Viện Sức khoẻ y tế quốc gia ở London và Viện thần kinh học đã lần đầu tiên chuyển ghép thành công nhiễm sắc thể người vào chuột, tạo nên một bước đột phá có thể mở ra hướng mới trong việc điều trị bệnh Down và các chứng rối loạn khác.
Các nhà khoa học thuộc Trung tâm Nghiên cứu khoa học quốc gia Pháp đã chuyển gen thành công tạo ra những con chuột mang các tế bào có chứa một loại protein huỳnh quang.
2. Thỏ chuyển gen
- Tạo thỏ chuyển gen lần đầu tiên thành công vào năm 1985, với việc chuyển gen hormone sinh truơngr có cấu trúc MT- hGH.
- Năm 2001, Kac và một nhà di truyền học pháp đã tạo ra một con thỏ chuyển gen có khả năng phát ra màu lục trong tối. - Phương pháp : sử dụng vi tiêm như ở chuột.
- ứng dụng : ngiên cứu thỏ chuyển gen để tạo ra protein quý sử dụng trong y dược thông qua tuyến sữa
- Việc sử dụng thỏ chuyển gen ngày càng rộng rãi bởi các lý do:
+. Giá phôi thỏ thấp.
+. Thời gian mang thai ngắn, thời gian thành thục sinh dục nhanh.
+. Chi phí sản xuất thấp.
+. Thỏ là động vật có vú rất gần với người nên có thành phần các protein phức tạp gần gióng với ngơời.
+. Không truyền các bênh nghiêm trọng do vius gây ra cho người.
+. Một thỏ cái có thể cho lương sữa 15lit mỗi năm. Và lượng protein khoảng 1-10/lit sữa.
3. Lợn chuyển gen
- Năm 1985, hammer và cộng sự đã chuyển thành công gen GH vào lợn bằng phương pháp gắn Promotor MT vào gen tạo GH.
- Quy trình :
+. Ly tâm các hợp tử của lợn để nhìn thấy các tiền nhân. +. Nuôi cấy invitro các hợp tử đến giai đoạn phôi dâu hoặc
phôi nang.
+. Dùng phương pháp vi tiêm để chuyển các gen ngoại lai vào hợp tử.
+. Nuôi cấy các hợ tử phát triển thành lợn con.
- Các gen ngoại lai đã được chuyển thành công vào chuột là: mMT-hGH, mMT-bGH , mMT-pGH..
- ứng dụng : lợn chuyển gen được sử dụng để tăng năng suất, trọng lượng cơ thể. Người ta chuyển các gen cần thiết vào để tạo lợn chuyển gen, sử dụng làm nguồn cơ quan nội tạng cung cấp cho ngiên cứu cấy ghép cơ quan trên người.
Lợn phát sáng xanh.(nguồn Sinh học Việt Nam 13/01/2006)
Bằng cách tiêm protein phát sáng xanh vào phôi lợn, nhóm nghiên cứu của GS Wu Shinn-Chih thuộc ĐH Đài Loan đã tạo ra ba con lợn đực chuyển gen. các nhà khoa học ở những nơi khác đã tạo ra lợn phát sáng xanh từng phần. Tuy nhiên, những con lợn ở Đài Loan Ngay cả tim và các cơ quan nội tạng của chúng cũng xanh.
Con lợn nhân bản mang gien người.( nguồn - Sinh học Việt Nam 14/07/2005)
TS Park Kwang-Wook và nhóm nhiên cứu đã nhân bản thành công một con lợn mang gien người. những con lợn nhân bản này đã được chuyển gien để mang gien HLA-G của người. Gien HLA-G sẽ giúp cơ quan nội tạng của lợn có cơ hội được chấp nhận cao hơn nếu được ghép cho người.
4. Cừu chuyển gen
- Qúa trình chuyển gen vào cừu giống như chuyển gen vào lợn chỉ khác ở chỗ khi vi tiêm phôi cừu không cần ly tâm phôi để nhìn tháy các tiền nhân.
- Ngoài các gen dùng để chuyển vào cho lợn thì người ta còn dùng các gen sMT-sGH 5, sMT-sGH 9..
Những con cừu là con đẻ của ewes có một gen của con người kết hợp vào DNA. Gen chịu trách nhiệm sản xuất của các protein alpha-1 antitrypsin (AAT). AAT được sản xuất trong các tế bào vú, và bài tiết trong sữa của cừu.
Các AAT sau đó có thể được cô lập và được sử dụng để điều trị thiếu AAT di truyền ở người
5. Dê chuyển gen
- 1999, Genzyme transgenic hợp tác với các nhà khoa học thuộc đại học louisiana và trường Ykhoa Tufts tạo ra con dê cái chuyển gen đầu tiên. Con dê cái mang gen
antithrombin III (AT III) của người. - quy trình :
- +. AT III được gắn vào một promoter thích hợp.
- +. Tiêm tổ hợp trên vào nhân của trứng dê mới thụ tinh. - +. Loại bỏ nhân của các tế bào nhận và dung hợp các
trứng khong nhân này với các nguyên bào sợi có nguồn gốc từ thai dê cái chuyển gen AT III.
- Ưu thế của dê chuyển gen:
+. Chi phí sản xuất ít hơn bò chuyển gen.
+. Thời gian mang thai của dê là 5 thnags, ngắn hơn so với bò (9 tháng)
6 Bò chuyển gen
- Phương pháp và quy trình chuyển gen giống như chuyển gen ở lợn.
- 1985, lohse và cộng sự tiêm gen thimidine kinase vào hợp tử bò sau 24h tháy có khoảng 30% phôi có thimidine kinase
- 1986, loskutoff và cộng sự thu được 3 thai sau khi tiêm 72 hợp tử và 17 phôi ở giai đoạn 2 tế bào.
- 1986 church và cộng sự tiêm 852 hợ tử bò với gen
anpha- fetoprotein thấy 4 phôi có sự hợp nhất gen trong óố 111 phôi I phát triển.
- 1988, Roschlaw và cộng sự sử dụng vi tiêm chuyển vào hợp tử bò các DNA có nguồn gốc từ virus, tỉ lệ thành cong là 2.7%.
7. Gà chuyển gen
- Gà được chuyển gen nhằm mục đích phát triển và cải tiến các phương pháp nghiên cứu.
- ngoài ra còn được nghiên cứu với mục đích sản xuất dược phẩm và các protein trong trứng để sử dugnj trong y học và thú y.
- Nhận biết và khai thá c các tính trạng sinh học có lợi cho sản xuất thịt gia cầm,
các nhà khoa học thuộc Trung tâm Sinh học Roslin (Roslin Biocentre), Edinburgh, Anh, tạo ra những con gà chuyển gen và sẽ sản xuất ra dược liệu điều trị ung thư trong lòng trắng trứng cảu gà chuyển gen
8. Khỉ chuyển gen
- Các nhà khoa học thuộc đại học y khoa oregon đã tạo ra các phôi biểu hiên gen chuyên ở khỉ Rhesus.
- các nhà khoa học đã dùng phương pháp vi tiêm tinh trùng mang plasmid tái tổ hợp trực tieos vào các tế bào chất của trứng.
+Plasmid trong thí nghiệm mang gen chỉ thị mã hóa protein huỳnh quang màu xanh lục két hợp với promoter CMV. Gen mã hóa protein huỳnh quang màu xanh lục là gen GFP .
+Biểu hiện của GFP ở giai đoạn 1-4 tế bào, phoi nang..và sử dụng 7 phôi chuyển thành công 3 phôi tạo 3 khỉ con.
- Bằng phương pháp chuyển gen nhờ vecter là vius các nhà khoa học thuộc đại học y khoa oregon mỹ cũng đã tạo được một chú khỉ Rhesus chuyển gen khác vào năm 2000.
+. Các nhà khoa học đã sử dụng một vecter virus không lây nhiếm để mang gen GFP trực tiếp vào trứng của khỉ mẹ.
+. Các trứng chuyển gen sau đó được thụ tinh nhân tạo phát triển tạo thành phôi và được đưa vào các con mẹ thay thế.
- Các nhà khoa học đã sử dụng 224 trứng để chuyển gen vào sau thu jtinh tạo 40 phôi và hình thành 5 thai, cuối cùng chỉ có môt jchus khỉ ra đời.
- ứng dụng : cung cấp công cụ để ngiên cứu nguyên nhân các bênh jnhuw ung thư, tiểu đường, tim mạch ..
Mito và Tracker, 2 trong 4 chú khỉ đã được sinh ra nhờ phương pháp mới của nhóm Mitalipov
Tiến sĩ Shoukhrat Mitalipov cùng các cộng sự tại Đại học Khoa học và Sức khỏe Oregon đã tiến hành một nghiên cứu thay mtDNA bị lỗi. Ông đã chiết xuất các thông tin di truyền (DNA) từ nhân trong những quả trứng của một con khỉ nâu và cấy chúng vào quả trứng của con khỉ khác, vốn đã bị loại bỏ DNA nhân. Quả trứng sau khi được biến đổi chứa DNA nhân của con khỉ gốc và mtDNA của con khỉ thứ hai. Tiếp đó nhóm nghiên cứu thụ tinh các quả trứng và chuyển 15 phôi vào tử cung của 9 con khỉ cái. Kết quả là 4 con khỉ nâu đã chào đời nhờ kỹ thuật mới. Trong đó có hai con khỉ sinh đôi được đặt tên là Mito và Tracker. Hai con còn lại được gọi là Spindler và Spindy.
9. Muỗi chuyển gen
Vào năm 2000, các nhà khoa học ở Học viện Hoàng gia London và Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Châu Âu lần đầu tiên trên Thế giới đã thành công trong việc đưa một gen ngoại lai vào genome của muỗi Anopheles
stephensi và đã tạo ra muỗi chuyển gen.
Các nhà nghiên cứu đã xen vào phôi A. stephensi gen mã hoá protein huỳnh quang màu lục-GFP (green fluorescent protein) sử dụng một yếu tố vận động của Drosophila hydei. Gen mã hoá protein này được sử dụng bởi vì nó hoạt động như là một marker và GFP tạo thành có khả năng được nhìn thấy dễ dàng dưới tia UV để nhận biết muỗi đã được tích hợp thành công gen ngoại lai.
Một vấn đề khó khăn gặp phải trong nghiên cứu này là các quả trứng muỗi vừa mới đẻ trở nên cứng rất nhanh làm cho việc vi tiêm gen vào là rất khó. Chỉ sau khi khám phá ra dung dịch p-nitrophenol cứng và không ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi muỗi thì mới có thể tiến hành đưa gen ngoại lai và một cách tự nhiên. Muỗi cái được cho đẻ trứng trong dung dịch pNpGB, chất này sẽ ngăn cản enzymephenoloxidase, bước đầu tiên trong quá trình melanin hoá.
Trong việc tìm kiếm các gen kháng ký sinh trùng sốt rét, người ta cũng đã thành công khi chuyển gen phospholipase A2 (PLA2) của nọc độc ong vào muỗi A. Stephensi. Gen này được gắn với promoter carboxypeptidase của A. gambiae (AgCP).
Một hướng nghiên cứu khác đang được tiến hành là ngăn cản sự xâm nhập của ký sinh trùng vào tuyến nước bọt của muỗi. Sự
ngăn cản ký sinh trùng xâm nhập vào các thời điểm khác nhau trong quá trình phát triển của nó là rất quan trọng bởi vì không có phương pháp nào là đạt hiệu quả 100%.
Các nhà nghiên cứu khác trước đây đã sử dụng một loại virus đã được sửa đổi tiêm vào muỗi để làm ngưng sự lan truyền ký sinh trùng. Nhưng phương pháp này có một số hạn chế là trong thực tế virus cũng có thể nhiễm vào người và virus không thể di truyền được từ thế hệ này
sang thế hệ sau ở muỗi. Một khi muỗi chết thì sẽ chấm dứt khả năng của virus chống lại sốt rét.
Sau khi tạo ra muỗi chuyển gen, chiến lược tiếp theo để khắc
phục sốt rét là đưa dòng muỗi chuyển gen kháng ký sinh trùng sốt rét vào trong tự nhiên.
Kết quả nghiên cứu quần thể muỗi chuyển gen đầu tiên trong phòng thí nghiệm đã được các nhà khoa học thuộc Học viện Hoàng gia London công bố bố vào năm 2003.
Các nhà nghiên cứu đã chuyển gen marker huỳnh quang đỏ hoặc xanh vào 4 dòng muỗi A. stephensi. Ở các quần thể đối chứng bao gồm toàn muỗi chuyển gen, marker huỳnh quang đã duy trì một cách nguyên vẹn qua hơn 30 thế hệ. Nhưng khi muỗi chuyển gen được nhân giống với muỗi bình thường thì số lượng muỗi mang marker trong quần thể giảm mạnh và trong một số thí nghiệm gen marker biến mất hoàn toàn trong khoảng từ thế hệ thứ 4 đến thế hệ thứ 16.
Vi tiêm DNA vào phôi giai đoạn sớm của muỗi gây sốt vàng da
Ấu trùng muỗi nhìn dưới kính hiển vi
10. Cá chuyển gen
Hiện nay nghiên cứu tạo cá chuyển gen ngày càng được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm. Khoảng 10 năm trở lại đây hàng loạt cá chuyển gen đã được tạo ra: cá hồi cầu vồng, cá hồi, cá rô phi, cá vàng, cá mú vằn, cá medaka, cá chép, cá nheo Mỹ, cá trê châu Phi, cá vền biển (seabream), cá hồi
chấm hồng Bắc cực (Arcticcharr).
Có nhiều phương pháp khác nhau để chuyển gen cho động vật nói chung và cá nói riêng. Phương pháp có hiệu quả nhất là vi tiêm trực tiếp DNA vào phôi. Gần đây người ta cũng đã thử nghiệm thành công chuyển gen trực tiếp vào tinh trùng trước khi cho thụ tinh.
Muller F. và cộng sự (1992) lần đầu tiên công bố đã thành công trong việc sử dụng các tế bào tinh trùng đã xung điện để tạo cá chuyển gen.
Inoue (1992) đã chuyển gen vào phôi và cá bột thành công bằng phương pháp xung điện.
Zuoyan Zhu (1993) cũng đã thành công trong việc chuyển gen ngoại lai vào cá bằng phương pháp biến nạp bằng xung điện: tổ hợp gen MThGH được chuyển vào trứng cá thụ tinh đã được loại bỏ màng chorion.
Muller và cộng sự (1993) đã dùng gen luciferase đom đóm và
lacZ của E. coli, cả hai gen này đều được gắn với promoter CMV-IE1, để chuyển vào trứng thụ tinh đã loại bỏ màng
chorion của cá trê Châu Phi và cá mú vằn bằng phương pháp xung điện. Kết quả đạt được khoảng 25 - 50% phôi đã phát triển thành cá chuyển gen.
Anderson và cộng sự (1996) đã thành công trong việc chuyển gen trực tiếp vào cơ vân của cá hồi cầu vồng (Oncorhynchus mykiss). Gen ngoại lai được sử dụng là gen luciferase đom đóm gắn với promoter CMV-IEP
(cytomegalovirus immediate early promoter).
Tan và cộng sự (1997) đã chuyển gen chloramphenicol acetyltransferase (CAT) trực tiếp vào cơ vân cá mú vằn (zeabrafish) sử dụng plasmid pCMV-CAT1.
Zohrah Haji Sulaiman (1999) đã thành công trong việc chuyển gen trực tiếp vào cơ vân của cá mú (Seabass, Lates calcarifer) và tôm sú (Black Tiger Prawn, Penaeus monodon).
cá hồi cầu vồng
Hiện nay, ở cá người ta đang tập trung nghiên cứu theo những hướng chính sau: chuyển gen hormone sinh trưởng vào cá, chuyển gen chống băng giá vào cá, chuyển gen kháng bệnh vào cá và một số hướng nghiên cứu cá chuyển gen khác.
Cá chép (Common carp) chuyển gen hormone sinh
trưởng
Cá trê Châu Phi
(Channel catfish) chuyển gen hormonesinh trưởng
Cá hồi chuyển gen hormone sinh trưởng (phải) và cá hồi
Với những ưu điểm nổi bật, công nghệ tạo động vật chuyển gen đã,