luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm: nghiên cứu vai trò của một số polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro

luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm: nghiên cứu vai trò của một số polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm: nghiên cứu vai trò của một số polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm: nghiên cứu vai trò của một số polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm: nghiên cứu vai trò của một số polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro

NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET

GRUSHV.) NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS DƯƠNG TẤN NHỰT

2 PGS TS BÙI VĂN LỆ Học viên thực hiện: VŨ THỊ THỦY

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình và đồ thị

Mở đầu 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƯỢC VỀ PHÔI VÔ TÍNH 3

1.1.1 Quá trình phát sinh phôi ở thực vật 3

1.1.2 Khả năng phát sinh phôi vô tính của các tế bào sinh dưỡng 4

1.1.3 Sự cảm ứng phát sinh phôi vô tính 8

1.1.4 Trạng thái của các tế bào phát sinh phôi vô tính 9

1.1.5 Sự phát sinh phôi vô tính 11

1.1.6 Ứng dụng của quá trình tạo phôi vô tính 13

1.2 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH 13

1.2.1 Chất điều hòa sinh trưởng 13

1.2.2 Nguồn Nitơ 15

1.2.3 Ánh sáng 16

1.2.4 Đường 16

1.2.5 Độ pH 17

1.3 VAI TRÒ CỦA POLYAMINE 17

1.3.1 Giới thiệu 17

1.3.2 Con đường trao đổi chất của Polyamine 18

1.3.2.1 Sinh tổng hợp Polyamine 18

1.3.2.2 Sự vận chuyển Polyamine 21

1.3.2.3 Sự tiếp hợp Polyamine 22

1.3.2.4 Polyamine trong tương tác với các con đường sinh tổng hợp khác 22

1.3.2.5 Các chất ức chế sinh tổng hợp Polyamine 22

1.3.3 Polyamine đóng vai trò là chất điều hòa sinh trưởng 23

1.4 SƠ LƯỢC VỀ CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) 25

1.4.1 Phân loại và đặc điểm hình thái 25

1.4.1.1 Phân loại 25

1.4.1.2 Đặc điểm hình thái 25

1.4.2 Phân bố 26

1.4.3 Thành phần hóa học 26

1.4.3.1 Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ) 26

1.4.3.2 Phần trên mặt đất (thân và lá) 28

1.4.3.3 Các thành phần khác 28

1.4.4 Các tác dụng của sâm Ngọc Linh 28

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU 30

2.1.1 Nguồn mẫu 30

2.1.2 Môi trường nuôi cấy 30

2.1.3 Điều kiện thí nghiệm 30

2.1.4 Địa điểm thực hiện đề tài 30

2.2 PHƯƠNG PHÁP 31

2.2.1 Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang 31

2.2.2 Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét 31

2.2.3 Thu thập mẫu và phân tích Polyamine nội sinh 32

2.2.4 Bố trí thí nghiệm 32

2.2.4.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát khả năng hình thành mô sẹo xốp

từ các nguồn mẫu cấy khác nhau của cây sâm Ngọc Linh 32 2.2.4.2 Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường

khoáng khác nhau lên sự hình thành mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 33 2.2.4.3 Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D

kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 33 2.2.4.4 Thí nghiệm 4 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện

nuôi cấy và điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi

vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 34 2.2.4.5 Thí nghiệm 5 Khảo sát ảnh hưởng của một số tiền chất

sinh tổng hợp Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính

từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 35 2.2.4.6 Thí nghiệm 6 Khảo sát ảnh hưởng của một số

Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 35

2.2.5 Xử lý số liệu 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU LÊN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO

CÓ KHẢ NĂNG PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH SÂM NGỌC LINH 36 3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC MÔI TRƯỜNG KHOÁNG LÊN KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH 38 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ 2,4-D KẾT HỢP VỚI 0,5 mg/l NAA

VÀ 0,2 mg/l KIN LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH 41 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH 44

3.4.1 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (đặc, lỏng tĩnh, lỏng lắc)

lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 44 3.4.2 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô

tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 46 3.5 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ TIỀN CHẤT SINH TỔNG HỢP POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH 49 3.5.1 Ảnh hưởng của Arginine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo

xốp sâm Ngọc Linh 49 3.5.2 Ảnh hưởng của Ornithine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo

xốp sâm Ngọc Linh 50 3.6 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THUỘC NHÓM POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH TỪ MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH 52 3.6.1 Ảnh hưởng của Putrescine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô

sẹo xốp sâm Ngọc Linh 52 3.6.2 Ảnh hưởng của Spermidine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô

sẹo xốp sâm Ngọc Linh 55 3.6.3 Ảnh hưởng của Spermine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo

xốp sâm Ngọc Linh 57 3.7 PHÂN TÍCH POLYAMINE NỘI SINH 60 3.8 GIẢI PHẪU CÁC DẠNG HÌNH THÁI PHÔI KHÁC NHAU CỦA SÂM NGỌC LINH 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN 65 KIẾN NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

ABA : Absisic acid

ACC : 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid

ACD : Arginine decarboxylase

IAA : Indole-3-acetic acid

IBA : Indole-3-butyric acid

Kin : Kinetin

LDC : Udecarboxylase

MR2 : Majonoside-R2

MS : Môi trường Murashige và Skoog, 1962

MS½ : Môi trường MS với thành phần khoáng đa lượng và vi lượng giảm ½ NAA : Acid -naphtaleneacetic

ODC : Ornithine decarboxylase

Orn : Ornithine

PA : Polyamine

PEM : Cụm tiền phôi (Pre-embryo mass)

pkl : Gene pickle (Một dạng đột biến gene ở cây Arabidopsis)

Put : Putrescine

SAM : S-adenosylmethionine

SERK : Somatic embryogenesis receptor-like kinase

SH : Môi trường Schenk and Hildebrandt, 1972

SH½ : Môi trường SH với thành phần khoáng đa lượng và vi lượng giảm ½ Spd : Spermidine

Spm : Spermine

TDZ : Thidiazuron

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu khác nhau

của sâm Ngọc Linh 36

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên khả năng hình thành mô

sẹo xốp từ lá sâm Ngọc Linh 39

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,5; 2

mg/l) kết hợp với 0,5 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kin lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 42

Bảng 3.4.1 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự hình thành phôi vô

tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 45

Bảng 3.4.2 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô

tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 47

Bảng 3.5.1 Ảnh hưởng của Arg lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo

Hình 1.3 Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển của phôi 9

Hình 1.4 Trao đổi chất PA và tương tác với các con đường trao đổi chất

khác 19

Hình 1.5 Cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 25

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nguồn mẫu lên khả năng hình thành mô sẹo xốp

sâm Ngọc Linh 37

Hình 3.2 Ảnh hưởng của các môi trường khoáng lên khả năng hình thành

mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 41

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D lên sự hình thành phôi vô tính từ

mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 44

Hình 3.4.1 Mô sẹo và phôi trong điều kiện nuôi cấy lỏng lắc, lỏng tĩnh và

đặc 46 Hình 3.4.2 Mô sẹo trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày và tối hoàn toàn 48 Hình 3.5.1 Ảnh hưởng của Arg lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp

Hình 3.6.4 Một số cây con tái sinh từ mô sẹo xốp trên môi trường ĐC, Spd,

Put và Spm 58

Biểu đồ 3.1 Sự thay đổi hàm lượng PA ở các giai đoạn phát triển cụm mô

phôi ở sâm Ngọc Linh trên môi trường ĐC và môi trường bổ sung Spd 61

Hình 3.7 Sự thay đổi hình thái và cấu trúc trong quá trình phát sinh phôi

vô tính sâm Ngọc Linh 64

MỞ ĐẦU

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là cây dược liệu đặc hữu

quý hiếm của Việt Nam và thế giới, được biết đến bởi hàm lượng cao các hợp chất Saponin triterpenoic tiêu biểu như MR2, G-Rb1 và G-Rg1 [Trần Công Luận, 2003] Không chỉ có dược tính đặc trưng của chi nhân sâm mà loài cây này còn có tác dụng

điển hình như chống stress, chống trầm cảm, tác dụng chống oxi hóa in vitro và in vivo… Hiện nay, do nhu cầu cao của thị trường kết hợp với việc khai thác ồ ạt, thiếu

khoa học, trồng, nhân giống hạn chế và bảo tồn lỏng lẻo, đã và đang đẩy sâm Ngọc Linh đến bờ vực của sự tuyệt chủng Do đó, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã

được áp dụng cho loài cây này [Nguyễn Ngọc Dung, 1995; Dương Tấn Nhựt et al.,

2010] Đây là phương pháp hiệu quả trong việc nhân nhanh số lượng cây sâm Ngọc Linh trong thời gian ngắn mà vẫn đảm bảo chất lượng cây giống Trong đó, nhân giống vô tính thông qua con đường phát sinh phôi vô tính đã mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn, có tính thương mại cao bởi tạo ra lượng lớn cây con sâm Ngọc Linh trong thời gian ngắn, cây con đồng đều về di truyền và có tỉ lệ sống sót cao ngoài vườn ươm

Tương tự phôi hữu tính, phôi vô tính gồm có mầm chóp rễ và chồi đỉnh nên có thể nảy mầm thành một cây hoàn chỉnh Tuy nhiên, sự hình thành phôi vô tính là một quá trình phức tạp, chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nguồn mẫu, nhiệt độ, ánh sáng, độ pH … Trong đó, các chất điều hòa sinh trưởng như 2,4-D, NAA, Kinetin, Proline… đóng vai trò rất quan trọng Gần đây, các Polyamine gồm Putrescine, Spermidine và Spermine cùng các tiền chất của chúng (Arginine và Ornithine) được chú ý như là một lớp chất điều hòa sinh trưởng mới có các dụng trong nhiều chu trình của cây như sự chín quả, già lá, sinh trưởng và phát triển hoa; đặc biệt, có sự liên quan mật thiết với quá trình phát sinh phôi vô tính Ở nồng độ cao, Polyamine có tác dụng giúp cho tế bào lớn lên và phân chia Trong giai đoạn cảm ứng tạo phôi, Polyamine thúc đẩy các tế bào vùng mô phân sinh phân chia nhanh chóng và biệt hóa tạo phôi Nồng độ Polyamine giảm có thể gia tăng các tế bào mô sẹo nhưng sẽ làm giảm sự hình thành phôi Polyamine nâng cao hiệu suất

phát sinh phôi ở nhiều loại cây đã được nghiên cứu như cây cà rốt, Pinus gerardiana Wall, Momordica charatia L., cây ổi [Hadrami và D’Auzac, 1992; Ravindra et al., 2007; Ananya et al., 2009; Nasim, 2013]

Mặc dù, việc sử dụng Polyamine kết hợp với các chất điều hòa sinh trưởng khác mang lại hiệu quả trong biệt hóa tế bào hình thành phôi [Rajam, 1997] cũng như các giai đoạn hình thành cây hoàn chỉnh ở thực vật đã được chứng minh

[Kevers et al., 2000] song cơ chế tác động vẫn chưa được hiểu một cách rõ ràng

Trong nỗ lực bảo tồn và nhân giống cây sâm Ngọc Linh, chúng tôi đã tiến hành

“Nghiên cứu vai trò của một số Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây

sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro” Ảnh

hưởng nguồn mẫu, điều kiện khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, điều kiện nuôi cấy

và điều kiện chiếu sáng được đánh giá trước khi nghiên cứu vai trò của các Polyamine cũng như tiền chất của chúng lên sự hình thành và tần suất phát sinh

phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh in vitro Đồng thời, nồng độ Polyamine nội sinh

cũng được tiến thành phân tích để những kết luận trở nên thuyết phục, có giá trị hơn

và mở đầu cho những nghiên cứu tiếp theo về Polyamine trên loài cây quý này

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC VỀ PHÔI VÔ TÍNH

Phôi vô tính chứa chất dinh dưỡng tương tự phôi hữu tính, có mầm chóp rễ và chồi đỉnh nên có thể nảy mầm trực tiếp thành cây không qua giai đoạn phát sinh

chồi, rễ Các mô và tế bào sinh dưỡng nuôi cấy in vitro tạo ra phôi vô tính trực tiếp;

hoặc gián tiếp thông qua một quá trình tạo mô sẹo Tế bào mô sẹo có thể phân chia theo cấp số nhân, nhờ vậy chỉ sau một thời gian ngắn nó có thể tạo được một số lượng phôi đáng kể Ưu điểm nổi bật của phôi vô tính là có thể bảo quản được lâu dài và cho nảy mầm vào thời vụ thích hợp Hiện nay, trên 200 loài cây trồng đã được nhân giống thành công bằng công nghệ phôi vô tính Công nghệ tạo phôi vô tính hiện nay vẫn đang là công nghệ tiên tiến trên thế giới [Nguyễn Văn Uyển, 2006; Dương Tấn Nhựt, 2007]

1.1.1 Quá trình phát sinh phôi ở thực vật

Hình 1.1 Các dạng phát sinh phôi ở thực vật [Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007]

Ở các loài thực vật bậc cao, phôi và nội nhũ là kết quả của sự thụ phấn kép (sự thụ phấn của tế bào noãn đồng thời với sự thụ phấn của tế bào trung tâm) được bao bọc trong hạt Sự phát sinh phôi hợp tử ở thực vật là một quá trình phức tạp ẩn sâu trong mô mẹ Ngoài những dữ liệu mô học thu thập được trên nhiều loài thực vật thì

việc phân tích các dạng đột biến ở cây Arabidopsis cũng đã góp phần làm sáng tỏ

một chuỗi các sự kiện xảy ra trong quá trình phát triển phôi ở thực vật Ngày nay, vi

nhân giống và thụ phấn in vitro, kết hợp với các biện pháp phân tử và gene, đã làm

rõ ràng thêm một số chi tiết và đồng thời cũng có những đóng góp thiết thực vào vốn hiểu biết của chúng ta về quá trình phát sinh phôi sinh dưỡng ở thực vật Tuy nhiên, ở các loài thực vật bậc cao, việc không thể phát sinh phôi hợp tử ở một số loài được cho là có liên quan đến sự sinh sản vô phối (apomixis-sự sinh sản không thông qua quá trình thụ tinh) (gồm hơn 400 loài cây thuộc ít nhất 40 họ khác nhau) Trong quá trình sinh sản vô phối, sự hình thành hạt vô tính bắt đầu từ mô mẹ của noãn, không trải qua quá trình giảm phân và thụ phấn, dẫn đến sự phát triển của phôi Hiện tượng sinh sản vô phối đã bộc lộ hai khía cạnh quan trọng của quá trình phát sinh phôi ở thực vật: (1) Các điểm nhấn kích hoạt sự thụ phấn có thể được thay thế bằng những cơ chế nội sinh; (2) Ở một số loài thực vật bậc cao, ngoài tế bào noãn được thụ phấn thì các loại tế bào khác cũng có thể duy trì và giữ lại khả năng phát triển phôi Mặc dù quá trình sinh sản vô phối chỉ hạn chế ở các tế bào phát sinh đỉnh hoặc noãn, nhưng cũng có một số lượng lớn tế bào sinh dưỡng thực vật có thể trải qua quá trình phát triển phôi dưới những điều kiện thích hợp Ví dụ, sự hình thành phôi (có vai trò như lá mầm sinh dưỡng) cũng có thể xảy ra trên mép lá của

cây sống đời Kalanchoe, cây Malaxis paludosa [Taylor, 1967] Có nhiều thí nghiệm phát sinh phôi được bắt đầu từ nuôi cấy in vitro các tế bào sinh dưỡng hoặc tế bào

giao tử (ví dụ: tiểu bào tử) Các dạng thức phát sinh phôi ở thực vật được tóm lược trên Hình 1.1

1.1.2 Khả năng phát sinh phôi vô tính của các tế bào sinh dưỡng

Theo Moltrasio và cộng sự (2004) thì khả năng phát sinh phôi vô tính được biểu hiện trước hết là ở mức kiểu gene và điều này có thể được chứng minh dễ dàng bằng cách chuyển khả năng phát sinh phôi từ kiểu gene có khả năng phát sinh phôi sang kiểu gene ngăn cản sự phát sinh phôi thông qua quá trình lai giống hữu tính Mặc dù các điều kiện kích thích sự phát sinh phôi đã được thiết lập cho nhiều loài, nhưng vẫn còn một số lượng lớn các loài chưa thể tạo phôi vô tính Thậm chí ngay trong cùng một loài, có kiểu gene dễ tạo phôi nhưng cũng có kiểu gene ngăn cản sự tạo phôi Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, sự ngăn cản tạo phôi có thể được giải quyết bằng cách tối ưu hóa các điều kiện sinh trưởng của cây hoặc bằng cách chọn

lựa mẫu cấy thích hợp Vì vậy, việc xác định các đặc tính di truyền có thể chỉ được

sử dụng để xác định vị trí và thời điểm biểu hiện khả năng phát sinh phôi Do đó khả năng phát sinh phôi chủ yếu được xác định thông qua chương trình phát triển của thực vật cũng như những dấu hiệu của môi trường

Phôi vô tính có thể phát triển trên tất cả các cơ quan của cây cà rốt hoặc cỏ linh lăng mà có mang những kiểu gene nhất định quy định sự phát sinh phôi; từ đó, cho thấy biên độ biểu hiện rộng của khả năng phát sinh phôi Tuy nhiên, ở phần lớn các loài thực vật, khả năng phát sinh phôi bị hạn chế ở những mô nhất định của kiểu gene nói trên Những thí nghiệm nuôi cấy mô cho thấy giữa các cơ quan khác nhau của cây tồn tại một gradient phản ứng phát sinh phôi Các mô có nguồn gốc từ phôi thì có khả năng phát sinh phôi cao nhất và khả năng này giảm dần ở cọng dưới lá mầm, cuống lá, lá và rễ [Neumann, 2000] Nhưng điều thú vị là vẫn có thể được phục hồi khả năng phát sinh phôi vô tính bằng con đường tạo mô sẹo trung gian từ các tế bào sinh dưỡng đã mất đi tiềm năng này

Rõ ràng, khả năng phát sinh phôi của tế bào thực vật không ngừng giảm trong suốt quá trình phát triển cá thể và phụ thuộc vào loài Ở thực vật một lá mầm, bao gồm hầu hết các loài ngũ cốc quan trọng, khả năng phát sinh phôi hầu như chỉ giới hạn ở các tế bào có nguồn gốc từ phôi hoặc mô phân sinh bao gồm phôi non, hạt,

gốc lá của Graminae, đỉnh chồi của Orchidaceae, vảy củ và chồi bên của Liliaceae Trong nuôi cấy in vitro, khả năng phát sinh phôi của những tế bào mô phân sinh này

có thể được duy trì nếu mẫu cấy được nuôi trên môi trường có bổ sung 2,4-D, tiếp

đó cho tạo mô sẹo Cấy chuyền những tế bào mô sẹo có khả năng phát sinh phôi này sang môi trường không có chất kích thích sinh trưởng hoặc môi trường có bổ sung auxin với nồng độ thấp thì có thể đạt được một tỉ lệ phát sinh phôi vô tính cao Ngược với các tế bào mô phân sinh, các tế bào sinh dưỡng của cây một lá mầm được biệt hóa sớm hơn và nhanh hơn, điều này làm mất khả năng phân chia và phát sinh hình thái của chúng Ở mặt này, cần lưu ý là sự điều hòa quá trình phát triển chuyển tiếp từ giai đoạn còn non đến giai đoạn trưởng thành có thể khác nhau giữa cây một lá mầm và hai lá mầm Mặc dù lý do trực tiếp của việc sớm mất đi tính toàn

năng ở thực vật một lá mầm vẫn chưa được biết đến, nhưng người ta đã có thể liên

hệ giữa sự điều hòa nghiêm ngặt của quá trình tổng hợp này với quá trình chuyển hóa của các chất điều hoà nội sinh, chẳng hạn như auxin

Nhiều thí nghiệm đã được thực hiện để so sánh kiểu gene điều khiển sự phát sinh phôi và kiểu gene ngăn cản sự phát sinh phôi nhằm chỉ ra những khác biệt

chính giữa chúng [Fehér et al., 2003] Ở cỏ linh lăng (Medicago sativa), những kiểu

gene có quan hệ mật thiết được chọn lọc dựa trên khả năng phát sinh phôi của chúng; các phản ứng của chúng với auxin được so sánh và những đặc điểm khác nhau được ghi nhận; trong đó, những gene đáp ứng với auxin được kích thích hoặc

bị ức chế ở nồng độ auxin rất thấp để chống lại những kiểu gene ngăn cản sự phát

sinh phôi [Börge et al., 1990] Ngoài ra, auxin còn có tác dụng ức chế sự ra rễ của những mẫu cắt chồi sinh trưởng in vitro ở nồng độ thấp hơn nhiều [Börge et al.,

1990] Mô sẹo của các kiểu gene không phát sinh phôi vẫn tiếp tục sinh trưởng trong môi trường bổ sung 2,4-D có nồng độ tương đương với nồng độ ức chế sự phân bào của những kiểu gene điều khiển sự phát sinh phôi Các quan sát trên chỉ ra những khác biệt đáng kể về tính nhạy cảm với auxin của hai kiểu gene này Vai trò quan trọng của các hormone biến dưỡng nội sinh (bị ảnh hưởng bởi tính di truyền, các dấu hiệu sinh lý và môi trường) trong giai đoạn kích thích phát sinh phôi sinh dưỡng đã được thừa nhận

Những tế bào có khả năng phát sinh phôi có đặc điểm là nhân nằm ở vị trí trung tâm, có những ống siêu nhỏ nổi bật ở gần nhân và những sợi nhỏ actin [Šamaj

et al., 2003] Verdeil và cộng sự (2001), đã mô tả các tế bào phát sinh phôi ở cây

dừa có các đặc điểm rất rõ ràng: lõm sâu vào vỏ nhân, các thể lưới dictyosomes và

bộ máy golgi nhân lên có quan hệ trực tiếp với sự dày lên các vách tế bào Ngoài ra, chúng còn có một cấu trúc thành tế bào đặc biệt Các dạng tế bào này vừa có nguồn gốc từ các mô phân sinh (hoặc mô phát sinh phôi) vừa có thể được tạo ra từ những

tế bào có khoảng không bào lớn trong một số điều kiện thích hợp; chẳng hạn như sau khi xử lý với 2,4-D Tuy nhiên, một số loại hormone (ABA, cytokinin) hoặc

stress khác cũng có thể kích thích sự hình thành những kiểu tế bào có khả năng phát sinh phôi

chất (có khả năng phát sinh phôi) [Pasternak et al., 2002] Ngoài ra, hệ thống này

còn được sử dụng để tiến hành so sánh giữa các kiểu gene có hoặc không có khả

năng phát sinh phôi [Bögre et al., 1990] Kết quả so sánh giữa những tế bào có khả

năng phát sinh phôi và những tế bào không có khả năng phát sinh phôi cho thấy cả

2 kiểu gene trên không những thể hiện những khác biệt về đặc điểm hình thái mà còn thể hiện những biến đổi trong quá trình sinh lý

Gene đặc trưng nhất liên quan đến tiềm năng phát sinh phôi là gene mã hóa cho enzyme SERK1, được Schmidt và cộng sự (1997) phát hiện lần đầu tiên ở cây

cà rốt Tác giả này dụng promoter SERK để nối vào đoạn gene mã hóa cho enzyme luciferase và tiến hành theo dõi tế bào bằng video, kết quả cho thấy tế bào đơn mà

có sự biểu hiện của SERK thì thực sự có thể phát triển thành phôi sinh dưỡng

Ngoài ra, sự biểu hiện lệch vị trí gene AtSERK có thể làm cho sự hình thành phôi sinh dưỡng diễn ra một cách dễ dàng hơn [Hecht et al., 2001] Do đó, sự biểu hiện của gene SERK được sử dụng như là một nhân tố đánh dấu khả năng sinh phôi Ở thực vật, AtSERK được biểu hiện lần đầu tiên trong quá trình phát sinh đại bào tử và

sau đó là trong các đại bào tử có chức năng, trong tất cả các tế bào của túi phôi cho đến khi thụ phấn và trong túi phôi cho tới giai đoạn hình tim Sau giai đoạn hình tim này, sự biểu hiện của gene không còn được tìm thấy ở bất kì bộ phận nào của hạt đang phát triển Tuy nhiên, gene này có sự biểu hiện thấp ở những mô mạch trưởng

thành Sự biểu hiện gene AtSERK1 cũng được quan sát ở đỉnh chồi, mô phân sinh

và lá mầm của hạt cây Arabidopsis nuôi cấy trong môi trường có bổ sung auxin trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy mô sẹo phát sinh phôi [Hecht et al.,

2001] Có ý kiến cho rằng protein SERK đơn thuần chỉ là một marker phát sinh hình thái tổng quát chứ không hẳn là một marker phát sinh phôi

1.1.3 Sự cảm ứng phát sinh phôi vô tính

Có nhiều hệ thống nuôi cấy mô sử dụng 2,4-D như là một chất cảm ứng có hiệu quả trong quá trình phát sinh phôi vô tính Hiện nay, thừa nhận quan điểm rằng việc xác định trạng thái của tế bào xảy ra trong môi trường có 2,4-D, nhưng trong cùng thời điểm đó thì sự phát triển lại bị ức chế Việc 2,4-D chỉ là một điểm nút chuyển đổi trạng thái của tế bào thì đã được nhấn mạnh bằng các thí nghiệm sử dụng một hệ thống đặc biệt (nuôi cấy huyền phù các vi mô sẹo) nuôi cấy các tế bào

Medicago trong môi trường có bổ sung một loại auxin tổng hợp khác là NAA [Dudits et al., 1991] Nếu cấy chuyền những tế bào này sang môi trường không có

chất điều hòa sinh trưởng thì chúng sẽ tạo rễ với tần số cao Nếu những tế bào này được xử lý 2,4-D ở nồng độ cao (100 M) trong một khoảng thời gian ngắn (khoảng vài phút) rồi cấy chuyền sang môi trường không có chất điều hòa tăng trưởng thì chúng sẽ phát triển thành phôi vô tính Tuy nhiên, phải 2-3 tuần sau khi

xử lý thì mới có thể quan sát được những khối phôi đầu tiên trên bề mặt của mô sẹo Dựa trên cơ sở những thí nghiệm này, hiệu quả phát sinh phôi cao đạt được khi nuôi cấy các mảnh cấy lá mầm cây cà rốt trên môi trường bổ sung 450 M 2,4-D trong

thời gian 2 giờ [Kitamiya et al., 2000]

Thực ra, những nghiên cứu này đã chỉ ra rằng 2,4-D rất cần thiết để khởi sự chương trình phát sinh phôi Việc cấy chuyền mẫu cấy sang môi trường không có 2,4-D có vai trò quan trọng trong việc thiết lập tính phân cực của tế bào, đây được

xem là một trong những sự kiện đầu tiên của quá trình phát triển phôi [Fehér et al.,

2003]

1.1.4 Trạng thái của các tế bào phát sinh phôi vô tính

Hình 1.3 Các biến đổi hình thái trong quá trình phát triển của phôi

[Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2007]

Sự khởi đầu quá trình phát triển phát sinh phôi ở các tế bào đã biệt hóa đòi hỏi một quá trình tái chương trình hóa tế bào hoàn chỉnh Quá trình này đi kèm với những thay đổi hoàn toàn về mặt hình thái và sinh lý; trong đó, việc tái chương trình hóa kiểu biểu hiện tổng thể của các gene là hết sức quan trọng Trong những năm gần đây, việc kiểm soát nghiêm ngặt sự cải biến các nhiễm sắc thể phản ứng lại các tín hiệu môi trường và tín hiệu phát triển nhằm xác định chính xác vị trí và thời

điểm biểu hiện của các gene này đã được chấp nhận rộng rãi [Li et al., 2002] Mức

độ tổ chức cao của nhiễm sắc thể sẽ tạo ra tính ổn định về kiểu biểu hiện của những gene xác định vùng nào của bộ gene là im lặng hay hoạt động trong tế bào hoặc trong giai đoạn phát triển đang khảo sát Các bằng chứng thực nghiệm đã chứng tỏ được tầm quan trọng của cấu trúc nhiễm sắc thể trong việc điều hòa sự chuyển vị sinh phôi Ví dụ, việc bất hoạt một số gene trong bộ nhiễm sắc thể có vai trò quan

trọng trong việc quyết định sự sinh trưởng của phôi và nội nhũ của Arabidopsis

Người ta đã xác định được những gene đột biến mã hóa cho những protein tương tự như những protein có chức năng bất hoạt nhiễm sắc thể (nhóm Polycomb trong suốt

quá trình phát triển của ruồi giấm) ở Arabidopsis Kết quả của những đột biến này

là sự hình thành hạt hoặc nội nhũ mà không lệ thuộc vào quá trình thụ phấn Dạng

đột biến medea gây ra sự thiếu hụt protein trong cùng một con đường điều hòa Các

kết quả nghiên cứu cho thấy chương trình phát sinh phôi bị ức chế bởi các gene im lặng trong nhiễm sắc thể và sau đó được kích hoạt nhằm đáp ứng với sự thụ phấn

Một dạng đột biến nữa ở Arabidopsis, pickle (pkl), có kiểu hình được xác định

dựa trên sự biểu hiện của các marker phôi chuyên biệt trong giai đoạn hậu phát sinh

phôi và quá trình tái sinh tự phát của các phôi vô tính ở rễ Sản phẩm của gene pkl

được mô tả như là một nhân tố tái tổ chức nhiễm sắc thể mà có thể ức chế sự biểu hiện của những gene liên quan đến sự phát sinh phôi cũng như điều hòa sự chuyển

vị phát triển từ trạng thái phát sinh phôi sang trạng thái sinh dưỡng Ngoài việc tổ chức nhiễm sắc thể, sự điều hòa trực tiếp của các gene liên quan đến các nhân tố

phiên mã đặc hiệu Cho tới nay, nhiều nhân tố phiên mã (leafy cotyledon 1 và 2, wuschell, baby woom) đã được xác định là có liên quan đến sự phát sinh phôi hợp tử

và gây ra sự lệch vị trí trong quá trình hình thành phôi nếu chúng được biểu hiện trong mô sinh dưỡng Mối liên hệ giữa sự tái tổ chức nhiễm sắc thể và những nhân

tố phiên mã này đã được chứng minh bằng cách làm giảm tác dụng ức chế biểu hiện

của lec1 trong đột biến pickle, và điều này đã dẫn tới sự phát triển phôi ở rễ Pickle

được nhận định là nhân tố ức chế tế bào phát sinh phôi trong tất cả các mô sinh dưỡng, nhưng người ta cũng đã chứng minh được rằng có thể chọn lọc được những

chức năng không ức chế sự phát sinh phôi trong những đột biến pickle

Dựa vào những bằng chứng trên, chúng ta có thể đưa ra giả thiết rằng trong suốt quá trình cảm ứng phát sinh phôi vô tính, sự tái tổ chức của nhiễm sắc thể đã làm giảm chương trình phát sinh phôi, mặt khác bị ức chế bởi các cơ chế bất hoạt nhiễm sắc thể trong các tế bào sinh dưỡng thực vật Những protein có chứa vùng nhiễm sắc thể có cấu trúc tương tự Polycomb đã được tìm thấy trong quá trình phát

sinh phôi hợp tử và phôi vô tính của cà rốt Ngoài ra, sự biểu hiện của lec1 trong

suốt quá trình phát sinh phôi vô tính đã được chứng minh ở cà rốt và cỏ linh lăng

[Yazawa et al., 2004] Cụ thể, với cà rốt, gene c-lec1 xuất hiện trong các mẫu cấy

phôi và gene này biểu hiện rõ chỉ 1 ngày sau khi cấy chuyền sang môi trường không

có 2,4-D ; trong khi đó, ở cỏ linh lăng, khi gây shock mẫu cấy bằng 2,4-D trong 1 giờ sau nhiều tuần nuôi cấy trong môi trường không có chất điều hòa tăng trưởng,

sự biểu hiện của ms-lec1 chỉ gia tăng vào giai đoạn biệt hóa phôi (3 tuần sau khi cảm ứng) [Fehér et al., 2003] Nghiên cứu này đã củng cố cho giả thuyết rằng ở hệ

thống nuôi cấy phát sinh phôi cây cà rốt thì quá trình phát sinh phôi diễn ra trước khi mẫu cấy được cấy chuyền sang môi trường không có 2,4-D

1.1.5 Sự phát sinh phôi vô tính

Sự phát sinh phôi vô tính được định nghĩa là một quá trình mà trong đó cấu trúc lưỡng cực giống phôi hữu tính phát triển từ một tế bào sinh dưỡng và không có liên kết mao mạch với tế bào gốc ban đầu Sự phát sinh phôi vô tính xảy ra thông qua một số giai đoạn tương tự như phôi hữu tính Phôi vô tính có thể biệt hóa trực tiếp từ mẫu cấy không cần đi qua giai đoạn mô sẹo hoặc gián tiếp thông qua giai

đoạn tạo mô sẹo trung gian Mẫu cấy trong phát sinh phôi trực tiếp thường là các vi bào tử, noãn bào, phôi hữu tính hoặc phôi vô tính và cây con

Khác biệt giữa phát sinh phôi trực tiếp và gián tiếp vẫn chưa được hiểu rõ Theo những giả thuyết trước đây, phát sinh trực tiếp xảy ra từ các tế bào có nguồn gốc từ phôi Ngược lại, phát sinh gián tiếp lại xảy ra ở các tế bào chưa biệt hóa và đầu tiên sẽ tạo thành các mô sẹo không biệt hóa Tuy nhiên, trong thực tế mô sẹo được tạo thành có thể là những mô sẹo có khả năng phát sinh phôi (embryogenic callus) hoặc không có khả năng phát sinh phôi (non-embryogenic callus) Thông thường dễ phân biệt giữa embryogenic callus và non-embryogenic callus dựa vào hình thái và màu sắc của chúng Embryogenic callus bao gồm các cụm tiền phôi (PEM) Hiện tại, người ta chưa biết liệu các PEM này có phải là phôi hay không, có phải do chúng đi chệch con đường phát triển phôi và chỉ tăng sinh khi đáp ứng lại

sự hiện diện của các chất điều hòa sinh trưởng?

Phát sinh phôi vô tính là một quá trình gồm nhiều bước khởi đầu bằng PEM, theo sau đó là sự hình thành phôi vô tính, phôi trưởng thành, phôi ở giai đoạn miên trạng và cuối cùng là giai đoạn tái sinh cây Tóm lại, các giai đoạn phát triển phôi

vô tính đều phải trải qua các giai đoạn như minh họa ở Hình 1.3 Để theo đúng con đường này, một số các biện pháp lý hóa quan trọng phải được xử lý đúng thời điểm Mặc dù có những tiến bộ đáng kể trong việc tìm kiếm, khám phá các hướng xử lý mới nhưng một số cách tiếp cận trong việc cải thiện khả năng trưởng thành của phôi nhằm tăng hiệu quả phát triển phôi lại gây ra những ảnh hưởng xấu đến chất lượng

phôi, từ đó làm giảm khả năng nảy mầm và tăng trưởng ex vitro của thực vật từ phôi

vô tính Do vậy, tăng trưởng ex vitro của thực vật chịu ảnh hưởng của toàn bộ quá trình nuôi cấy và biện pháp xử lý trong giai đoạn in vitro

Tóm lại, có thể tóm tắt sự tái sinh thực vật thông qua con đường phát sinh phôi vô tính bao gồm năm giai đoạn:

 Nuôi cấy tạo phôi bằng cách chọn lựa mẫu cấy sơ cấp cấy vào môi trường bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, chủ yếu là auxin (đôi khi là cytokinin)

 Tăng sinh của quá trình nuôi cấy phôi trên môi trường rắn hoặc lỏng có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng tương tự như trên

 Giai đoạn trước khi trưởng thành của phôi trong môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng, để ngăn sự tăng sinh và kích thích sự tạo phôi và phát triển sớm

 Giai đoạn phôi trưởng thành bằng cách nuôi cấy phôi trong môi trường bổ sung ABA và/hoặc giảm áp lực thẩm thấu

 Sự phát triển của cây trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng

1.1.6 Ứng dụng của quá trình tạo phôi vô tính

Quá trình hình thành phôi vô tính đã mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn quan

trọng và có tính chất thương mại rất lớn, đặc biệt là trong vi nhân giống in vitro

Trên lý thuyết, từ một mẫu mô được nuôi cấy có thể sản xuất ra vô số tế bào phôi Tốc độ nhân giống từ phôi cao hơn nhiều so với nhân giống từ mô phân sinh Ngoài

ra, số lượng lớn của phôi chính là một nguồn nguyên liệu đáng kể phục vụ cho những ứng dụng thực tiễn quan trọng khác như sản xuất hạt nhân tạo, cải thiện chất lượng cây trồng (là nguyên liệu cho chọn lọc tế bào, biến nạp gene, lai soma, tạo thành những cây đa bội), bảo quản chất mầm, loại trừ virus, sản xuất các chất biến

dưỡng in vitro và sự thành lập khuẩn căn in vitro

1.2 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH 1.2.1 Chất điều hòa sinh trưởng

Nhằm khôi phục khả năng phát sinh phôi vô tính từ các tế bào đã suy giảm hoặc mất đi khả năng này, các chất điều hòa sinh trưởng phải được sử dụng trong hầu hết các hệ thống nuôi cấy phôi vô tính Trong đó, 2,4-D là loại auxin tổng hợp được sử dụng phổ biến nhất Những auxin khác như IBA và picloram cũng được sử dụng; thậm chí cả các auxin yếu như NAA và IAA cũng được dùng trong một vài

hệ thống nuôi cấy Auxin được dùng cho cảm ứng hình thành tế bào phát triển phôi,

có lẽ do hoạt hóa phân hóa gene khởi đầu và cũng thúc đẩy tăng quần thể tế bào qua phân bào liên tiếp; đồng thời ngăn cản sinh trưởng và biệt hóa tế bào thành các

phôi Trong trường hợp mẫu cấy có chứa các tế bào phát triển phôi thì môi trường nuôi cấy có thể không cần đến auxin

Ngoài auxin, các cytokinin cũng được dùng cho cảm ứng phát sinh ở các loài thực vật hai lá mầm Loại cytokinin được sử dụng nhiều trong môi trường nuôi cấy

là BAP, nhưng các cytokinin khác như Kin, zeatin và TDZ cũng cho kết quả tốt tùy thuộc vào loại thực vật Trong nuôi cấy phôi, nồng độ của các chất điều hòa sinh trưởng là rất quan trọng đối với phản ứng sinh trưởng tối ưu của mẫu cấy Khi nồng

độ quá thấp sẽ không kích thích sinh trưởng, ngược lại hàm lượng quá cao có thể gây độc cho mẫu…

Ví dụ điển hình là về sự phát triển của phôi vô tính cà rốt trong nuôi cấy trải qua một quá trình gồm hai giai đoạn, mỗi giai đoạn cần có môi trường riêng Các

mô sẹo được nuôi cấy khởi đầu và nhân sinh khối trên môi trường giàu auxin và thường được sử dụng 2,4-D ở nồng độ 0,5-1 mg/l Trên môi trường này, sự phân hóa mô sẹo xảy ra tại các nhóm tế bào phân sinh được gọi là “các cụm phát triển phôi” (EC) Nếu các EC được chuyển sang môi trường có nồng độ auxin rất thấp (0,01-0,1 mg/l) hoặc không có auxin, chúng sẽ phát triển thành phôi trưởng thành

Sự có mặt của auxin trong môi trường tăng sinh là cần thiết cho mẫu có thể phát triển thành phôi khi chuyển sang môi trường phù hợp Các môi trường tăng sinh có thể coi là môi trường cảm ứng đối với sự hình thành phôi vô tính Những mẫu duy trì liên tục trong môi trường không có auxin sẽ không hình thành phôi

Ở cây cà phê Coffea arabica, các phôi vô tính chỉ phát triển khi mô sẹo hình

thành trên môi trường chứa 2,4-D được chuyển sang môi trường không có loại hormone này Đối với một số loài thực vật, những auxin khác lại sử dụng hiệu quả hơn 2,4-D, như trong trường hợp của cây bí ngô, NAA và IBA được dùng cho phát

sinh phôi Trong nuôi cấy phôi tâm cây Vitus, sự hình thành phôi xảy ra khi có mặt của NAA và BAP [Mullin và Schlegel, 1976] Các mô sẹo của phôi tâm cây Citrus sinensis thuộc họ Cam chanh yêu cầu có IAA và Kin cho sinh trưởng và biệt hóa

phôi Sự cấy chuyền lặp lại của mô sẹo đã làm giảm dần khả năng phát sinh phôi và sau khoảng hai năm các dòng mô có biểu hiện tự dưỡng hormone Ở những dòng

mô này, sự có mặt của IAA nồng độ thấp (0,001 mg/l) trong môi trường đã ức chế

sự hình thành phôi Khi xử lý mô với những hóa chất ức chế sinh tổng hợp auxin như 2-hydroxy-5-nitro-benzyl bromide hoặc 7-aza-indole và chiếu xạ, sự phân hóa phôi đã có sự cải thiện rõ rệt Như vậy nồng độ auxin nội sinh cao đã làm giảm khả

năng phát sinh phôi của mô sẹo Citrus

Các chất điều hòa sinh trưởng khác như GA3, ABA ở nồng độ thấp cũng có tác

dụng kích thích trong phát sinh phôi của cà rốt, Citrus medica, Phaseolus…, GA3

có thể thúc đẩy sự phát triển phôi đến giai đoạn trưởng thành và hình thành cây con

1.2.2 Nguồn nitơ

Nitơ (N) là thành phần của acid nucleic và thành phần chủ yếu của chất nguyên sinh đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất nên ảnh hưởng trực tiếp tới

sự trao đổi chất ở cây Dạng sử dụng của N trong môi trường nuôi cấy là amonium

NH4+ và nitrat NO3- Tỉ lệ và tổng nồng độ của hai ion này trong môi trường thay đổi tùy loại cây và trạng thái phát triển của mô thực vật [Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2002] Thiếu một trong hai ion trên, có thể khiến thực vật phát triển

bất thường Do đó, trong môi trường nuôi cấy, phải có sự cân bằng giữa NO3-/NH4+ Thông thường, hàm lượng NO3- được trung hòa bởi NH4+ trong môi trường nuôi cấy

và hàm lượng N trong môi trường nuôi cấy khoảng từ 25-40 mM và tỉ lệ NO3-/NH4+

từ 50:50 tới 85:15 [Grimes và Hodges, 1990] Thiếu NH4+ khiến rễ bên hình thành

nhiều hơn rễ chính ở cây Carica papaya [Drew, 1987] Cả hai ion NO3-/NH4+ đều thiết yếu cho cảm ứng mô sẹo có khả năng phát sinh phôi và phôi cây lúa mì; đặc biệt, ở nồng độ 50 mM NH4NO3 kết hợp với 20 mM KNO3 tạo số lượng phôi cao Song ở mức 100 mM KNO3 thì ức chế cảm ứng tạo phôi [Menke-Milczarek và Zimmy, 2001]

Amonium dùng trong môi trường nuôi cấy thường phối hợp với các acid hữu

cơ, đặc biệt là các hợp chất của acid malic và citric Phôi của lúa mì đã sinh trưởng tốt khi môi trường có chứa amon malat, glutamin và saccharose ở nồng độ thấp Nhưng nếu chỉ có amon (NH4+) làm nguồn nitơ vô cơ sẽ gây ra hiện tượng acid hóa môi trường, vì vậy thường kết hợp với nitơ dạng nitrat (NO3-) Theo Dougall và

Verna (1978), trong môi trường chỉ chứa NH4Cl làm nguồn nitơ độc nhất, độ pH đã giảm từ 5,4 xuống đến 4-3,5 sau 4 ngày nuôi cấy và có biểu hiện ức chế sự hình thành phôi

Các nitơ hữu cơ bao gồm các amino acid và các amit được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi Glutamin và asparagin có tác dụng kích thích phát triển phôi cây cà

độc dược Datura và nhiều loại thực vật khác, nhưng glutamin có hiệu quả rõ rệt

hơn Những hỗn hợp hữu cơ không xác định như casein (CH), nước dừa cũng có ảnh hưởng tốt với sự hình thành phôi, do chúng chứa nhiều thành phần khoáng, các amino acid… Sự phát sinh phôi đã xảy ra trong nuôi cấy tế bào trần trụ dưới lá mầm

cây cải Brassica naplus và Brassica nigra Các mô sẹo được hình thành từ trụ dưới

lá mầm sau hai tuần nuôi trên môi trường MS có 2,4-D và 10% nước dừa được chuyển sang môi trường không chứa chất kích thích sinh trưởng đã hình thành phôi Phát sinh phôi vô tính trực tiếp và tái sinh cây con có thể xảy ra trong nuôi cấy tế

bào trần Brassic naplus

1.2.3 Ánh sáng

Phôi vô tính có thể được tạo ra trong những điều kiện sáng và tối khác nhau

Có những loài có nhu cầu ánh sáng cao nhưng cũng có những loài sự hình thành phôi xảy ra trong điều kiện tối hoàn toàn Ở cây họ Cà, sự phát sinh phôi vô tính

hoàn toàn cần ánh sáng [Gleddie et al., 1983] nhưng ở cây Podophyllum, cây bí đỏ Cucurbita pepo L hoàn toàn cần điều kiện tối [Arumugam et al., 1990; Lelkak- Levanic et al., 2004] Ở cây Vân Sam Nauy thì việc hình thành phôi vô tính chỉ có

thể thực hiện được trong điều kiện tối hoàn toàn nếu có sự hiện diện của ammonium trong môi trường và việc loại bỏ ammonium ra khỏi môi trường là hoàn toàn cần

thiết trước khi việc tạo phôi được tiến hành ngoài sáng [Verhagen et al., 1989]

Hiểu biết về hiệu quả và vai trò của ánh sáng lên quá trình phát sinh phôi vô tính có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu tạo phôi vô tính

1.2.4 Đường

Sucrose là một loại đường thường được sử dụng để cung cấp nguồn cacbonhydrate cho sự phát sinh phôi nhất Người ta còn thấy rằng sucrose và auxin

có mối tương tác với nhau, nồng độ sucrose hoặc auxin đều phụ thuộc lẫn nhau Bên cạnh sucrose cũng có một số đường đôi, đường đơn khác có thể được sử dụng thành công và cho thấy có hiệu quả hơn trên những đối tượng khác Galactose và

lactose tốt hơn sucrose cho việc cảm ứng tạo phôi từ mô sẹo của Citrus, trong khi

đó thì sucrose tốt hơn glucose và fructose [Kochba et al., 1982] Đôi khi sự kết hợp

hai loại đường được sử dụng cho sự thành lập các phôi vô tính

1.2.5 Độ pH

Độ pH trong tế bào là một nhân tố ảnh hưởng đến sự biệt hóa và sự phân chia

tế bào Sự biến đổi pH trong tế bào chất được biết là rất cần thiết để điều khiển chu

kì tế bào, sự sinh trưởng và phân chia tế bào [Pasternak et al., 2002] Giá trị pH

trong không bào cũng như trong lục lạp có thể được xem như là một nhân tố chỉ thị của kiểu tế bào có khả năng phát sinh và không có khả năng phát sinh phôi hay không; đồng thời sự tăng pH trong tế bào chất có liên quan đến sự phân chia tế bào Auxin làm tăng sự vận chuyển proton đi ra, kết quả là làm giảm pH Độ pH trong tế bào thấp được đề nghị là có liên quan đến quá trình nới lỏng thành tế bào cần thiết cho sự kéo dài tế bào trực tiếp trong quá trình phát triển phôi

1.3 VAI TRÒ CỦA POLYAMINE

1.3.1 Giới thiệu

Trong số các hợp chất hóa học được biết đến, PA là một trong những hợp chất lâu đời nhất [Galston, 1991] Ngay từ hơn 300 năm trước trong tinh trùng lạnh (Sperm) ở người, Spm dạng tinh thể đã được phát hiện, sau đó là Spermidine Tên gọi gắn chữ “Sperm” ghi nhận nguồn gốc tìm thấy chúng Gần 200 năm sau, các diamine Put và Cadverine (Cad) cũng được tìm thấy Cấu trúc hóa học của hầu hết các dẫn xuất Put, Spm và Spd đã được hiểu biết đầy đủ hơn vào cuối thế kỉ thứ 20

Có rất nhiều dạng PA khác nhau, phổ biến là Put, Spd và Spm PA được biết đến là những hợp chất chứa nitơ kết hợp của các phân tử có trọng lượng thấp Đây là những polycation phân tử nhỏ được tìm thấy trong tất cả các cơ thể sống Ở thực vật, PA xuất hiện ở nhiều quá trình khác nhau gồm sự phát sinh cơ quan, sự cảm ứng và sự phát triển hoa; sự già hóa lá, quá trình phát triển và chín của quả, đáp ứng

với các stress vô sinh và hữu sinh [Kusano et al., 2008] và cả quá trình phát sinh phôi vô tính [Silveira et al., 2004a,b]

Trong tế bào thực vật, các diamine (Put), triamine (Spd) và tetramine (Spm)

là những PA chủ yếu Chúng xuất hiện dưới dạng tự do hoặc là hợp chất liên kết với các acid phenolic và các hợp chất có phân tử lượng thấp khác hoặc các đại phân tử như protein và acid nucleic Hỗn hợp của các PA cũng cần thiết trong thực vật, phản ứng với những vi sinh vật cộng sinh quan trọng trong dinh dưỡng của thực vật Bản chất polycation tự nhiên của PA tại pH sinh lý giải thích cho hoạt động sinh học của chúng Do đó, PA cũng liên quan đến sự phosphoryl hóa protein, sự cải thiện sau quá trình phiên mã và sự vận chuyển thích hợp của DNA Có một dấu hiệu trực tiếp cho thấy chúng cũng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển ở Procaryote và

Eucaryote [Slocum, 1991; Tiburcio et al., 1990] và vai trò của chúng trong quá trình

điều hòa sự sinh trưởng và phát triển thực vật đã được quan tâm nhiều trong những thập kỉ vừa qua [Evans và Malmberg, 1989]

1.3.2 Con đường trao đổi chất của Polyamine

1.3.2.1 Sinh tổng hợp Polyamine

Các PA như Put, Spd, Spm và tiền chất của chúng gồm Arg và Orn đều là các amine có mặt trong tất cả các tế bào Sự tổng hợp các PA từ các amino acid thông qua quá trình loại CO2 Các amino acid cơ bản như Arginine và Ornithine có vai trò cung cấp khung carbon chính để tạo nên Put, nhờ hoạt động của ODC và ADC, trong khi có sự đóng góp của Methinonine với nhóm propylamine để Put chuyển

thành Spd và từ Spd chuyển thành Spm đã được thực hiện bởi SAMDC [Kakkar et al., 2000]

Ở động vật có vú và nấm, Put được hình thành từ Orn trong một phản ứng được xúc tác bởi ODC Tuy nhiên ở thực vật, tồn tại thêm một con đường thay thế cho sự hình thành Put bắt đầu từ Arg trong phản ứng được xúc tác bởi Agmatine

iminohydrolase và N-carbamonylputrescine amidohydrolase (CPA) [Slocum et al.,

1984] Trong hai con đường ODC và ADC, con đường ODC có phổ biến ở tất cả các sinh vật sống Hoạt động của con đường này đã được phát hiện có trong hầu hết

các loài và gene mã hóa cho ODC cũng đã được mô tả [Michael et al., 1996, Imanishi et al., 1998]

Hình 1.4 Trao đổi chất PA và tương tác với các con đường trao đổi chất khác

[Alcázar et al., 2010]

Con đường sinh tổng hợp cho PA và các chất chuyển hóa có liên quan được mô tả bởi các đường liên tục Đường đứt nét cho thấy sự hình thành của alkaloid putrescine có nguồn gốc từ PA liên hợp và các quá trình dị hóa Các số tương ứng với các enzyme sau: 1 nitrate reductase, 2 reductase nitrit, 3 nitrogenase, 4 glutamine synthetase, 5 glutamate synthase, 6 glutamate N-acetyltransferase, 7 acetylglutamate kinase, 8 N-acetyl - reductase phosphate, 9 acetylornithine transaminase, 10 acetylornithine deacetylase, 11 ornithine-carbamoyl transferase, 12 synthase arginosuccinate, 13 arginosuccinate lyase, 14 decarboxylase arginine, 15 agmatine iminohydrolase, 16 N-carbamoylputrescine amidohydrolase, 17 decarboxylase ornithine, 18 SAM synthetase, 19 SAM decarboxylase,

20 spermidine synthase, 21 spermine synthase , 22 thermospermine synthase, 23 glutamate decarboxylase, 24 diamine oxidase, 25 putrescine hydroxycinnamoyl transferase, 26 polyamine oxidase, 27 aminotransferase -aminobutyrate, 28 succinic dehydrogenase semialdehyde, 29 arginase, 30 aminotransferase ornithine, 31 nitric oxide synthase, 32 ACC synthase, 33 ACC oxidase, 34 reductase nitrat, 35 lysine decarboxylase Chứng minh gần đây cho thấy rằng polyamine oxidase (26) không chỉ tham gia vào quá trình dị hóa sản phẩm đầu cuối của PA mà còn ở phía sau chuyển đổi từ spermine ra spermidine và từ spermidine tạo ra putrescine

Đầu tiên, L-Arginine được biến đổi thành agmatine (Agm) nhờ enzyme ADC; sau đó Agmatine được biến đổi thành N-carbamoylputrescine nhờ enzyme agmitine iminohydrolase và cuối cùng biến đổi thành Put bởi enzyme N-carbamoylputrescine

amidohydrolase Có vai trò cho methyl, SAM là một tiền chất cho cả PA và ethylene thông qua 1-aminocyclopropane 1-carboxylic acid (Hình 1.4) và SAM dùng để điều hòa con đường sinh tổng hợp [Evans và Malmberg, 1989] Hơn thế nữa, ở một vài loài thực vật, một nửa aminopropyl của SAM có thể chuyển thành

Put thông qua Put-N-methyl-transferase để hình thành N-methyl-Put [Hibi et al., 1994; Tiburcio et al., 1990]

Sự tổng hợp Put bởi hai con đường xen kẽ ACD/ODC có thể được giải thích là

do sự tạo ngăn tế bào khác biệt của 2 enzyme trong sự điều hòa các quá trình thực

vật riêng biệt đặc hiệu [Borrell et al., 1995] Điều này cũng chỉ ra rằng hoạt động

của ADC thật sự được tìm thấy ở động vật Nhưng sự biểu hiện nói chung cho thấy ADC có thể chỉ là con đường thứ yếu cho sự tổng hợp Put trong mô động vật có vú đặc hiệu PA được giới hạn trong không bào, ti thể và lục lạp [Slocum, 1991]

Borrell và cộng sự (1995) tìm thấy PA trong màng thylakoid của loài spinach, kết

hợp với phức hợp tiếp nhận ánh sáng (LHC) và quang hệ thống II Những kháng thể tăng ADC của lúa yến mạch đã tiết lộ rằng enzyme này có mặt trong màng thylakoid của lục lạp và bởi sự định vị của ADC trong diệp lục, ông kết luận rằng vai trò của sự tổng hợp PA có thể duy trì hoạt động của quá trình quang hợp, ngăn cản stress thẩm thấu được cảm ứng Nói chung, SAMDC và Spd synthase định vị trong tế bào chất, trong khi ODC được phân bố trong nhân tế bào; đồng thời, vòng tuần hoàn của ODC khá nhanh với bán chu kì sống thường ít hơn 1 giờ và thỉnh thoảng nhanh hơn một vài phút [Slocum, 1991] SAMDC của cây thuốc lá có bán chu kì sống ức chế việc tổng hợp SAMDC bởi những PA (Spd và Spm) có thể mô

tả cơ chế điều hòa quan trọng của việc tổng hợp PA ở thực vật [Slocum, 1991] Tuy nhiên, ở lúa yến mạch, ADC được tổng hợp như là một tiền chất được tách ra để sản xuất các enzyme hoạt động trong một phản ứng mà chúng bị ức chế bởi Spm

[Borrell et al., 1996]

Sự đa dạng của những hợp chất sơ cấp khác được tìm thấy ở thực vật, gồm có udecarboxylase (LDC) Hoạt động của nó tương quan chặt chẽ với sự tích lũy của alkaloid quinolizidine mà Cad là một tiền chất Hoạt động của LDC được phân bố

trong stroma của lục lạp [Slocum, 1991] Một vài mạch chính PA dị thường (caidine, thermine, caldopentamine) mà chúng khác biệt từ PA tổng quát trong số lượng một nửa methylenic giữa những chức năng amine mà nó được thăm dò trong

sự phát triển của thực vật ở môi trường tối ưu Có một bằng chứng tiêu biểu chống lại những giả thuyết rằng những mạch chính PA có thể đáp ứng các chất bảo vệ stress khô hạn hay stress nhiệt từ những điều kiện trong thực vật

1.3.2.2 Sự vận chuyển Polyamine

Thông thường, những tế bào có thể tổng hợp PA mà chúng cần Thật vậy, những tế bào này được trang bị với hệ thống vận chuyển đặc hiệu để hấp thu PA ngoại sinh Nó được biết đến như là những hệ thống vận chuyển riêng cho các PA khác nhau, hay chỉ một hệ thống vận chuyển riêng biệt có khả năng vận chuyển tất

cả các phân tử PA Ở thực vật bậc cao hơn, PA hấp thu ở cấp độ tế bào rất nhanh, đạt trạng thái bão hòa sau 1-2 phút và biểu lộ 2 pha hệ thống với 2 thành phần bão hòa cho Put Sự vận chuyển PA là một cơ chế hoạt động mạnh được kích thích bởi auxin và PA hấp thu được bảo quản chủ yếu là trong nội bào [Bagni và Pistocchi, 1991] Sự vận chuyển PA đến các cơ quan tế bào, sự vận chuyển gián tiếp dọc theo tonoplast được tìm thấy trong không bào, trong khi hoạt động vận chuyển đến khoảng matrix, phụ thuộc vào khả năng của màng được tìm thấy trong ti thể Sự vận chuyển PA dọc theo plasma phụ thuộc vào năng lượng và canxi mà chúng cần trong

cơ chế Những xử lý hóa học mà nó đối kháng với phản ứng calmodulin hay ức chế hoạt động của protein kinase và phosphatase khử Ca2+- hấp thu Put hoạt động Những kết quả này đề nghị những giả thuyết rằng canxi ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển trong suốt con đường truyền tín hiệu thứ cấp, gồm hoạt động protein kinasephophatase

Vận chuyển đường dài có lẽ là một phần chức năng của hormone cần thiết Do

đó, xác định việc PA được chuyển chỗ trong thực vật là rất quan trọng Những nghiên cứu trong sự vận chuyển PA đoạn đường dài không nhiều nhưng chúng có khả năng chứng tỏ sự tồn tại của sự chuyển chỗ không cực ở phạm vi thực vật Kết

luận là có sự chuyển chỗ PA xuất hiện chính thông qua mạch xylem và nó phụ thuộc vào tỉ số thoát hơi nước [Bagni và Pistocchi, 1991]

1.3.2.3 Sự tiếp hợp Polyamine

Trong tự nhiên, PA xuất hiện như là phân tử tự do cơ bản nhưng thường được tiếp hợp thành những phân tử nhỏ như những acid phenolic và cũng thành những

phân tử lớn khác nhau như protein [Tiburcio et al., 1997]

Những PA tiếp hợp nói chung kết nối đồng hóa trị thành acid hydroxycinnamic PA được tiếp hợp bởi sự hình thành của liên kết amide, sử dụng este của CoA để cung cấp nhóm carboxyl hoạt động và sự liên kết này được xúc tác bởi một nhóm enzyme được biết đến như transferase Những hợp chất này xuất hiện như là dạng cơ bản hay là dạng trung tính Trong dạng cơ bản, nhóm amine tự do của amine aliphatic được liên kết với acid phenolic cinnamic Trong dạng trung hòa, mỗi nhóm amine kết thúc của amine aliphatic được kết hợp thành acid cinnamic Sự kết nối đồng hóa trị của PA thành protein sau quá trình phiên mã được xúc tác bởi

một nhóm enzyme transglutaminase, chúng được định vị cả trong và ngoài tế bào 1.3.2.4 Polyamine trong tương tác với các con đường sinh tổng hợp khác

Sự trao đổi chất PA được kết nối với một số đường nội tiết và trao đổi chất quan trọng có liên quan đến phát triển, phản ứng stress, đồng hóa nitơ và chuyển hóa hô hấp Con đường trao đổi chất PA cũng được kết nối với các con đường trao đổi chất khác có liên quan đến sự hình thành các phân tử tín hiệu khác nhau và các chất chuyển hóa khác nhau trong đáp ứng stress ở thực vật Theo đó, sự tổng hợp

PA và ethylene thông qua một tiền chất chung là SAM – một tiền chất phổ biến cho sinh tổng hợp.PA và ethylene có hiệu quả đối kháng trong quá trình già lá và chín quả Năm 2006, Yamasaki và Cohen cũng đã chứng minh sự sinh tổng hợp PA có ảnh hưởng tới sự hình thành NO GABA – một sản phẩm của quá trình dị hóa PA được hình thành thông qua pyroline (xem sơ đồ Hình 1.4)

1.3.2.5 Các chất ức chế sinh tổng hợp Polyamine

Các chất ức chế sinh tổng hợp PA là các chất làm bất hoạt các enzyme sinh tổng hợp PA gồm: DL--diflouromethylarginine (DFMA) ức chế enzyme ADC; -

diflouromethylornithine (DFMO) ức chế ODC; (guanylhydrazone) (MGBG) ức chế SAM; Dicyclohexylammonium sulphate (DCHA) hoặc Cyclohexylammonium phosphate (CHAP): ức chế enzyme spermidine synthase

methylglyoxal-bis-Khi bổ sung các chất trên vào môi trường nuôi cấy làm giảm hiệu quả của PA, gây ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát sinh hình thái thông qua tăng cường hoặc giảm bớt tác dụng của các chất khác Ví dụ, xử lý với DFMA và DFMO làm tăng cường sản xuất ethylene ở một số thực vật; DFMO ức chế sự thành lập rễ từ đoạn

cắt dưới lá mầm cây Euphorbia esula nhưng bổ sung IAA và 2,4-D có thể khắc phục điều này; DFMO ức chế sự tạo phôi trực tiếp từ lá mầm Solanum melongena

cao hơn so với DFMA song điều này được khắc phục khi thêm Put vào môi trường

nuôi cấy; MGBG ngăn chặn sự tạo rễ nhưng thúc đẩy sự tạo củ ở cây Solanum tuberosum (Bais và Ravishankar, 2002)

1.3.3 Polyamine đóng vai trò là chất điều hòa sinh trưởng

Các PA đã được quan tâm như là một lớp mới trong các chất điều hòa sinh trưởng và là tín hiệu hormone sơ cấp trong quá trình nhân lên và biệt hóa tế bào ở

nhiều quá trình sinh lý thực vật [Kakkar et al., 2000; Bais và Ravishankar, 2002;

Jiménez, 2005] Trong những năm đầu tiên sau khi nghiên cứu PA trong tế bào thực vật, một điều đáng chú ý về khả năng của chúng mang những hoạt động sinh trưởng cao ở những giai đoạn phát triển Những tác động của PA ngoại sinh và nội sinh được nhận thấy rõ ở cấp độ thực vật tương đồng không làm ảnh hưởng đến tác động của phytohormone Điều đáng chú ý là nó tác động gián tiếp và trực tiếp giữa PA và các phytohormone cảm ứng phát triển Vì vậy, trong một vài thực vật, auxin, gibberellin và cytokinin kích thích sinh tổng hợp và gia tăng hàm lượng PA, ở đó

PA ngoại sinh tác động đến các phytohormone nội sinh Đối với Arabidopsis, IAA cảm ứng gene ACL5 ghi mã tổng hợp Spm nhưng ABA hay acid gibberelic có thể

không cảm ứng gene này Sự không hoạt động của gene này làm chậm trễ sự kéo dài thân và ức chế sự phân chia tế bào

Theo sự hoạt động sinh hóa của chúng, PA có thể phân chia thành 2 nhóm: Put

và Cad kích thích sự phân chia tế bào và hình thành rễ như những auxin và gibberellin, trong khi đó Spd và Spm điều hòa sự phân chia tế bào, hình thành các

cơ quan và nhiễm sắc thể như những cytokinin Nồng độ PA cao thường có mặt trong các mô sinh trưởng mạnh và trong giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi sinh dưỡng Trong nuôi cấy tế bào cà rốt, PA được biến nạp với gene ODC cDNA và nồng độ Put được gia tăng trong không bào Điều này cho phép PA được đưa vào sử dụng như auxin ở giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi trong tế bào sinh dưỡng cà rốt

Sự thay đổi trong trao đổi PA ở giai đoạn phát sinh phôi sinh dưỡng được nghiên cứu trong nhiều hệ thống khác nhau ở thực vật Đây là một hướng đi quan trọng trong sự tái sinh cây trồng và là hệ thống hiện đại, tiềm năng để nghiên cứu

các sự kiện sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái in vitro [Yadav và Rajam,

1998] Vì vậy những nghiên cứu gần đây, sự phân tích toàn diện hàm lượng của PA, hoạt động của những enzyme tổng hợp nên chúng, sự biểu hiện của gene điều hòa phiên mã được biểu diễn ở những giai đoạn khác nhau của sự phát sinh phôi sinh

dưỡng ở Vitis vinifera: hình tim, hình cá đuối, phôi trưởng thành và tái sinh cây

Hoạt động của ODC vượt quá ADC Sự biểu hiện của gene ODC và SAMDC có liên quan đến hoạt động của những enzyme tương ứng với những cấp độ của Put và Spd ở giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi Mối quan hệ không có mặt giữa hàm lượng PA tự do, hoạt động của enzyme để sinh tổng hợp và cấp độ biểu hiện gene ở giai đoạn sau của sự phát sinh phôi và tái sinh cây có thể mang lại kết quả hệ thống điều hòa tế bào

Nghiên cứu gần đây chỉ ra vai trò quan trọng của PA ngoại sinh trong quá trình

phát triển in vitro như quá trình phát sinh phôi vô tính Tần xuất phát sinh phôi vô

tính cũng có thể được điều chỉnh bởi nồng độ các PA đã được Kever và cộng sự

(2000) chứng minh trên cây Panax ginseng Đối với cây Araucaria angustifolia, sự

thay đổi hàm lượng các PA cũng đã được tìm thấy trong các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi và ở mô hạt trong suốt quá trình phát triển của hạt [Astarita và

cộng sự 2003] Trục phôi là cơ quan xuất hiện hàm lượng PA cao nhất gồm Put và Spm trong giai đoạn phôi sớm; trong khi nồng độ Spd cao và nồng độ Put giảm xuống khi lá mầm mọc ra

1.4 SƠ LƯỢC VỀ CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA

Loài : Panax vietnamensis Ha et Grushv

Hình 1.5 Cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

[Nguồn: http://samngoclinhtkh.com/]

1.4.1.2 Đặc điểm hình thái

Sâm Ngọc Linh trưởng thành có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ với đường kính thân khoảng 4-8 cm, thường tàn lụi hàng năm Phần thân rễ có đường kính 1-2 cm, mọc bò ngang như củ hoàng tinh trên hoặc dưới mặt

đất khoảng 1-3 cm, mang nhiều rễ nhánh và củ Các thân mang lá và tương ứng với

mỗi thân mang lá là một đốt dài khoảng 0,5-0,7 cm Cây chỉ có một lá duy nhất trong suốt từ năm thứ 1 đến năm thứ 3 và chỉ từ năm thứ 4 trở đi mới mọc thêm 2 đến 3 lá Trên đỉnh của thân mang lá kép hình chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá Cuống lá kép dài 6-12 mm, mang 5 lá chét, lá chét ở chính giữa lớn hơn cả với độ dài 12-15 cm, rộng 3-4 cm Lá chét có phiến hình bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, lá có lông ở cả hai mặt Cây 4-5 năm tuổi có hoa hình tán đơn mọc dưới các

lá thẳng với thân, cuống tán hoa dài 10-20 cm có thể kèm 1-4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính Mỗi tán có 60-100 hoa, cuống hoa ngắn 1-1,5 cm, lá đài, cánh hoa màu vàng nhạt, nhị, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy Quả mọc tập trung ở

trung tâm của tán lá, dài độ 0,8-1 cm và rộng khoảng 0,5-0,6 cm, sau hai tháng bắt đầu chuyển từ màu xanh đến xanh thẫm, vàng lục, khi chín ngả sang màu đỏ cam với một chấm đen không đều ở đỉnh quả Mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả

Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá

và rễ con Vào đầu tháng 1 hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây trưởng thành có 1 tán hoa Từ tháng 4 đến tháng

6, cây nở hoa và kết quả Tháng 7 quả bắt đầu chín và kéo dài đến tháng 9 Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến hết tháng 12 Dựa vào số lượng vết sẹo trên đầu củ, người ta có thể nhận biết độ tuổi của cây sâm Sau 3 năm đầu, cây sâm mới rụng lá

và để lại vết sẹo đầu tiên Khi thu hoạch, chỉ nên thu nhận các củ từ 3 tuổi trở lên, tốt nhất là trên 5 tuổi Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm

1.4.2 Phân bố

Đến nay, vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum là nơi duy nhất được phát hiện có sâm Ngọc Linh Đây cũng là giới hạn xa nhất về phía Nam (ở 15o vĩ tuyến Bắc) của bản đồ phân bố chi Panax L trên thế giới

Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai ở Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o

5’-108o7’ kinh tuyến Đông và từ 15o0’-15o1’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao 2598 m Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500-2200 m, chủ yếu tập trung ở 1800-2000 m, thuộc địa bàn của hai huyện Đắk Tô (Kon Tum) và Trà My (Quảng Nam) Hiện nay, về giới hạn cũng như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh đã có nhiều thay đổi [Nguyễn

Thượng Dong et al., 2007]

1.4.3 Thành phần hóa học

1.4.3.1 Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ)

Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây sâm Ngọc Linh cũng như các loài sâm khác trên thế giới Từ phần dưới mặt đất của sâm

Ngọc Linh hoang dại đã phân lập và xác định được cấu trúc protopanaxatriol oxyd

II và 52 hợp chất saponin bao gồm 26 saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-ginsenoside (VG) -R1 đến -R25 và 20-O-Me-G-Rh1

Các saponin dammaran được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học có giá trị của sâm Triều Tiên cũng chiếm một tỉ lệ rất cao về hàm lượng và

số lượng trong thành phần hợp chất saponin của sâm Ngọc Linh (50/52 saponin

phân lập được) Trong đó các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol gồm 22

hợp chất với đại diện chính là ginsenoside-Rb1, -Rb3, -Rd Các saponin dẫn chất của protopanaxatriol gồm 17 hợp chất với các đại diện chính là ginsenoside-Re, -Rg1, notoginsenoside-R1 Các saponin có cấu trúc occotillol gồm 11 hợp chất với

các đại diện chính là majoside-R1 và -R2 [Nguyễn Thượng Dong et al., 2007]

Theo Yamasaki (2000), các hợp chất saponin mới của sâm Ngọc Linh có một

số đặc điểm đáng chú ý như sau:

+ VG-R1 và VG-R2 là saponin ocotillol có nhóm acetyl trên chuỗi đường ở C-6 + VG-R3 là chất duy nhất thiếu nhóm -OH tại vị trí C-12 trong tất cả các saponin được phân lập từ loài này

+ VG-R4 là một saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol có mang một trong

hai chuỗi đường ở C-3, trong khi các saponin này được tìm thấy trước đây chỉ mang các chuỗi đường ở C-6 và C-20, hoặc C-6 và C-12

+ VG-R5 và -R6 là hai saponin có chứa cầu nối α-glycoside hiếm gặp trong tự nhiên VG-R7 là G-Rd xylosyl hoá

+ VG-R8 có một mạch có liên kết đôi có hướng tại -OH ở C-25 Cấu trúc này có

điểm tương đồng với majonoside F4, có 3-O- và 20-O-diβ-d-glucoside trên cùng

một nhóm aglycone VG-R9 cũng có liên kết đôi có hướng tại C-36 và có cấu trúc tương đồng với majonoside-F1

+ Các VG-R10, -R12, -R13, -R14, -R15, -R16, -R17, -R19, -R20, -R21 là các saponin có cấu trúc aglycon mới VG-R13 là một glycoside đầu tiên phát hiện trong

một loài Panax có aglycon là dammarenediol Chất này có thể là một chất trung

gian trong quá trình sinh tổng hợp của protopanaxadiol và protopanaxatriol [Nguyễn Thượng Dong et al., 2007]

20(S)-1.4.3.2 Phần trên mặt đất (thân và lá)

Có 19 saponin dammaran đã được phân lập từ phần trên mặt đất của sâm Ngọc Linh, bao gồm 11 saponin đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vinaginsenoside-L1 đến -L8 Khác với phần dưới mặt đất, các saponin dẫn chất của

20(S)-protopanaxadiol chiếm tỉ lệ rất cao trong thành phần saponin từ phần trên mặt

đất với đại diện chính là notoginsenoside-Fc, G-Rb3, N-Fe và VG-L2 Các saponin

20(S)-protopanaxatriol gồm có P-RS1, G-Re và G-Rg1 với tỉ lệ thấp Ngoài ra còn

có các saponin có cấu trúc ocotillol với đại diện chính là VG-R1 nhưng chiếm tỉ lệ thấp

 Các nguyên tố vi lượng và đa lượng: 20 nguyên tố vi lượng và đa lượng của phần dưới mặt đất sâm Ngọc Linh đã được xác định, trong đó bao gồm một số các nguyên tố có tác dụng sinh học như K, Na, Mg, Mn, Cu, Fe, Co, Zn, Se

1.4.4 Các tác dụng của sâm Ngọc Linh

 Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương: Sâm Ngọc Linh liều thấp có tác dụng kích thích thần kinh, làm tăng hoạt động vận động và trí nhớ, nhưng liều cao lại ức chế thần kinh

 Tác dụng chống trầm cảm: Sâm Ngọc Linh có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống một lần 200 mg/kg hoặc liều 50 – 100 mg/kg dùng trong 7 ngày ở chuột nhắt

trắng; majonosid-R2 tiêm màng bụng có tác dụng chống trầm cảm ở cả 3 liều 3,1; 6,2 và 12,5 mg/kg

 Tác dụng tăng sinh lực: Sâm Ngọc Linh có tác dụng tăng lực trong thí nghiệm chuột bơi, làm tăng sinh lực chống lại sự mệt mỏi, giúp phục hồi sức lực

 Tác dụng sinh thích ứng (adaptogenesis): Trong stress vật lý, cho chuột nhắt trắng uống sâm Ngọc Linh liều 100 mg/kg có tác dụng làm tăng khả năng chịu đựng của chuột đối với nhiệt độ cao (37-42oC) và nhiệt độ thấp (–5oC), làm kéo dài thời gian sống thêm của chuột thí nghiệm

Trong stress vật lý, chuột nhắt trắng được nuôi riêng từng con trong 4 tuần, thời gian ngủ khi tiêm natri barbital giảm đi 30% Sâm Ngọc Linh liều uống 50-200 mg/kg hoặc hoạt chất majonosid-R2 tiêm màng bụng liều 3,1-12,5 mg/kg làm cho thời gian ngủ trở lại bình thường

 Tác dụng chống oxy hóa: Trên thí nghiệm in vitro dùng dịch nổi của mô não,

gan và phân đoạn vi thể gan của chuột nhắt trắng, saponin sâm Ngọc Linh ở nồng

độ 0,05-0,5 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA (malonyl

dialdehyde) là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng sinh học

 Tác dụng kích thích miễn dịch: Bột chiết sâm Ngọc Linh liều uống 500 mg/kg

và majonosid-R2 tiêm trong màng bụng có tác dụng làm tăng chỉ số thực bào trong

thí nghiệm in vitro và in vivo ở chuột nhắt trắng Dùng liều E coli gây chết chuột

nhắt trắng Nếu kết hợp dùng sâm và majonosid-R2 với liều như trên sẽ làm tăng tỉ

lệ chuột sống sót Có lẽ do thuốc có tác dụng làm tăng đại thực bào đối với E coli

 Tác dụng phục hồi máu: Trong thí nghiệm làm giảm hồng cầu và bạch cầu ở động vật thí nghiệm, sâm Ngọc Linh có tác dụng làm phục hồi số lượng hồng cầu

và bạch cầu đã bị giảm

 Tác dụng dược lý khác: Sâm Ngọc Linh còn có tác dụng tăng cường nội tiết tố sinh dục, điều hòa hoạt động của tim, tác dụng chống tăng cholesterol máu, tác dụng bảo vệ gan khỏi các yếu tố gây độc đối với gan