Trong tự nhiên, PA xuất hiện như là phân tử tự do cơ bản nhưng thường được tiếp hợp thành những phân tử nhỏ như những acid phenolic và cũng thành những phân tử lớn khác nhau như protein [Tiburcio et al., 1997].
Những PA tiếp hợp nói chung kết nối đồng hóa trị thành acid hydroxycinnamic. PA được tiếp hợp bởi sự hình thành của liên kết amide, sử dụng este của CoA để cung cấp nhóm carboxyl hoạt động và sự liên kết này được xúc tác bởi một nhóm enzyme được biết đến như transferase. Những hợp chất này xuất hiện như là dạng cơ bản hay là dạng trung tính. Trong dạng cơ bản, nhóm amine tự do của amine aliphatic được liên kết với acid phenolic cinnamic. Trong dạng trung hòa, mỗi nhóm amine kết thúc của amine aliphatic được kết hợp thành acid cinnamic. Sự kết nối đồng hóa trị của PA thành protein sau quá trình phiên mã được xúc tác bởi một nhóm enzyme transglutaminase, chúng được định vị cả trong và ngoài tế bào. 1.3.2.4. Polyamine trong tương tác với các con đường sinh tổng hợp khác
Sự trao đổi chất PA được kết nối với một số đường nội tiết và trao đổi chất quan trọng có liên quan đến phát triển, phản ứng stress, đồng hóa nitơ và chuyển hóa hô hấp. Con đường trao đổi chất PA cũng được kết nối với các con đường trao đổi chất khác có liên quan đến sự hình thành các phân tử tín hiệu khác nhau và các chất chuyển hóa khác nhau trong đáp ứng stress ở thực vật. Theo đó, sự tổng hợp PA và ethylene thông qua một tiền chất chung là SAM – một tiền chất phổ biến cho sinh tổng hợp.PA và ethylene có hiệu quả đối kháng trong quá trình già lá và chín quả. Năm 2006, Yamasaki và Cohen cũng đã chứng minh sự sinh tổng hợp PA có ảnh hưởng tới sự hình thành NO. GABA – một sản phẩm của quá trình dị hóa PA được hình thành thông qua pyroline (xem sơ đồ Hình 1.4).
1.3.2.5. Các chất ức chế sinh tổng hợp Polyamine
Các chất ức chế sinh tổng hợp PA là các chất làm bất hoạt các enzyme sinh tổng hợp PA gồm: DL--diflouromethylarginine (DFMA) ức chế enzyme ADC; -
diflouromethylornithine (DFMO) ức chế ODC; methylglyoxal-bis- (guanylhydrazone) (MGBG) ức chế SAM; Dicyclohexylammonium sulphate (DCHA) hoặc Cyclohexylammonium phosphate (CHAP): ức chế enzyme spermidine synthase.
Khi bổ sung các chất trên vào môi trường nuôi cấy làm giảm hiệu quả của PA, gây ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát sinh hình thái thông qua tăng cường hoặc giảm bớt tác dụng của các chất khác. Ví dụ, xử lý với DFMA và DFMO làm tăng cường sản xuất ethylene ở một số thực vật; DFMO ức chế sự thành lập rễ từ đoạn cắt dưới lá mầm cây Euphorbia esula nhưng bổ sung IAA và 2,4-D có thể khắc phục điều này; DFMO ức chế sự tạo phôi trực tiếp từ lá mầm Solanum melongena cao hơn so với DFMA song điều này được khắc phục khi thêm Put vào môi trường nuôi cấy; MGBG ngăn chặn sự tạo rễ nhưng thúc đẩy sự tạo củ ở cây Solanum tuberosum (Bais và Ravishankar, 2002).
1.3.3. Polyamine đóng vai trò là chất điều hòa sinh trưởng
Các PA đã được quan tâm như là một lớp mới trong các chất điều hòa sinh trưởng và là tín hiệu hormone sơ cấp trong quá trình nhân lên và biệt hóa tế bào ở nhiều quá trình sinh lý thực vật [Kakkar et al., 2000; Bais và Ravishankar, 2002;
Jiménez, 2005]. Trong những năm đầu tiên sau khi nghiên cứu PA trong tế bào thực vật, một điều đáng chú ý về khả năng của chúng mang những hoạt động sinh trưởng cao ở những giai đoạn phát triển. Những tác động của PA ngoại sinh và nội sinh được nhận thấy rõ ở cấp độ thực vật tương đồng không làm ảnh hưởng đến tác động của phytohormone. Điều đáng chú ý là nó tác động gián tiếp và trực tiếp giữa PA và các phytohormone cảm ứng phát triển. Vì vậy, trong một vài thực vật, auxin, gibberellin và cytokinin kích thích sinh tổng hợp và gia tăng hàm lượng PA, ở đó PA ngoại sinh tác động đến các phytohormone nội sinh. Đối với Arabidopsis, IAA cảm ứng gene ACL5 ghi mã tổng hợp Spm nhưng ABA hay acid gibberelic có thể không cảm ứng gene này. Sự không hoạt động của gene này làm chậm trễ sự kéo dài thân và ức chế sự phân chia tế bào.
Theo sự hoạt động sinh hóa của chúng, PA có thể phân chia thành 2 nhóm: Put và Cad kích thích sự phân chia tế bào và hình thành rễ như những auxin và gibberellin, trong khi đó Spd và Spm điều hòa sự phân chia tế bào, hình thành các cơ quan và nhiễm sắc thể như những cytokinin. Nồng độ PA cao thường có mặt trong các mô sinh trưởng mạnh và trong giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi sinh dưỡng. Trong nuôi cấy tế bào cà rốt, PA được biến nạp với gene ODC cDNA và nồng độ Put được gia tăng trong không bào. Điều này cho phép PA được đưa vào sử dụng như auxin ở giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi trong tế bào sinh dưỡng cà rốt.
Sự thay đổi trong trao đổi PA ở giai đoạn phát sinh phôi sinh dưỡng được nghiên cứu trong nhiều hệ thống khác nhau ở thực vật. Đây là một hướng đi quan trọng trong sự tái sinh cây trồng và là hệ thống hiện đại, tiềm năng để nghiên cứu các sự kiện sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái in vitro [Yadav và Rajam, 1998]. Vì vậy những nghiên cứu gần đây, sự phân tích toàn diện hàm lượng của PA, hoạt động của những enzyme tổng hợp nên chúng, sự biểu hiện của gene điều hòa phiên mã được biểu diễn ở những giai đoạn khác nhau của sự phát sinh phôi sinh dưỡng ở Vitis vinifera: hình tim, hình cá đuối, phôi trưởng thành và tái sinh cây.
Hoạt động của ODC vượt quá ADC. Sự biểu hiện của gene ODC và SAMDC có liên quan đến hoạt động của những enzyme tương ứng với những cấp độ của Put và Spd ở giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi. Mối quan hệ không có mặt giữa hàm lượng PA tự do, hoạt động của enzyme để sinh tổng hợp và cấp độ biểu hiện gene ở giai đoạn sau của sự phát sinh phôi và tái sinh cây có thể mang lại kết quả hệ thống điều hòa tế bào.
Nghiên cứu gần đây chỉ ra vai trò quan trọng của PA ngoại sinh trong quá trình phát triển in vitro như quá trình phát sinh phôi vô tính. Tần xuất phát sinh phôi vô tính cũng có thể được điều chỉnh bởi nồng độ các PA đã được Kever và cộng sự (2000) chứng minh trên cây Panax ginseng. Đối với cây Araucaria angustifolia, sự thay đổi hàm lượng các PA cũng đã được tìm thấy trong các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi và ở mô hạt trong suốt quá trình phát triển của hạt [Astarita và
cộng sự 2003]. Trục phôi là cơ quan xuất hiện hàm lượng PA cao nhất gồm Put và Spm trong giai đoạn phôi sớm; trong khi nồng độ Spd cao và nồng độ Put giảm xuống khi lá mầm mọc ra.
1.4. SƠ LƯỢC VỀ CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA
ET GRUSHV.)
1.4.1. Phân loại và đặc điểm hình thái 1.4.1.1. Phân loại 1.4.1.1. Phân loại Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Apiales Họ : Araliaceae Chi : Panax
Loài : Panax vietnamensis Ha et Grushv.
Hình 1.5. Cây sâm Ngọc Linh(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) [Nguồn: http://samngoclinhtkh.com/]
1.4.1.2. Đặc điểm hình thái
Sâm Ngọc Linh trưởng thành có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ với đường kính thân khoảng 4-8 cm, thường tàn lụi hàng năm. Phần thân rễ có đường kính 1-2 cm, mọc bò ngang như củ hoàng tinh trên hoặc dưới mặt đất khoảng 1-3 cm, mang nhiều rễ nhánh và củ. Các thân mang lá và tương ứng với mỗi thân mang lá là một đốt dài khoảng 0,5-0,7 cm. Cây chỉ có một lá duy nhất trong suốt từ năm thứ 1 đến năm thứ 3 và chỉ từ năm thứ 4 trở đi mới mọc thêm 2 đến 3 lá. Trên đỉnh của thân mang lá kép hình chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá. Cuống lá kép dài 6-12 mm, mang 5 lá chét, lá chét ở chính giữa lớn hơn cả với độ dài 12-15 cm, rộng 3-4 cm. Lá chét có phiến hình bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, lá có lông ở cả hai mặt. Cây 4-5 năm tuổi có hoa hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân, cuống tán hoa dài 10-20 cm có thể kèm 1-4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính. Mỗi tán có 60-100 hoa, cuống hoa ngắn 1-1,5 cm, lá đài, cánh hoa màu vàng nhạt, nhị, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy. Quả mọc tập trung ở
trung tâm của tán lá, dài độ 0,8-1 cm và rộng khoảng 0,5-0,6 cm, sau hai tháng bắt đầu chuyển từ màu xanh đến xanh thẫm, vàng lục, khi chín ngả sang màu đỏ cam với một chấm đen không đều ở đỉnh quả. Mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả.
Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con. Vào đầu tháng 1 hàng năm, sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây trưởng thành có 1 tán hoa. Từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả. Tháng 7 quả bắt đầu chín và kéo dài đến tháng 9. Cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng, để lại một vết sẹo ở đầu củ và cây bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến hết tháng 12. Dựa vào số lượng vết sẹo trên đầu củ, người ta có thể nhận biết độ tuổi của cây sâm. Sau 3 năm đầu, cây sâm mới rụng lá và để lại vết sẹo đầu tiên. Khi thu hoạch, chỉ nên thu nhận các củ từ 3 tuổi trở lên, tốt nhất là trên 5 tuổi. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm.
1.4.2. Phân bố
Đến nay, vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum là nơi duy nhất được phát hiện có sâm Ngọc Linh. Đây cũng là giới hạn xa nhất về phía Nam (ở 15o vĩ tuyến Bắc) của bản đồ phân bố chi Panax L. trên thế giới.
Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai ở Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o5’- 108o7’ kinh tuyến Đông và từ 15o0’-15o1’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao 2598 m. Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500-2200 m, chủ yếu tập trung ở 1800-2000 m, thuộc địa bàn của hai huyện Đắk Tô (Kon Tum) và Trà My (Quảng Nam). Hiện nay, về giới hạn cũng như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh đã có nhiều thay đổi [Nguyễn Thượng Dong et al., 2007].
1.4.3. Thành phần hóa học
1.4.3.1. Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ)
Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây sâm Ngọc Linh cũng như các loài sâm khác trên thế giới. Từ phần dưới mặt đất của sâm
Ngọc Linh hoang dại đã phân lập và xác định được cấu trúc protopanaxatriol oxyd II và 52 hợp chất saponin bao gồm 26 saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-ginsenoside (VG) -R1 đến -R25 và 20-O-Me-G-Rh1.
Các saponin dammaran được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học có giá trị của sâm Triều Tiên cũng chiếm một tỉ lệ rất cao về hàm lượng và số lượng trong thành phần hợp chất saponin của sâm Ngọc Linh (50/52 saponin phân lập được). Trong đó các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol gồm 22 hợp chất với đại diện chính là ginsenoside-Rb1, -Rb3, -Rd. Các saponin dẫn chất của protopanaxatriol gồm 17 hợp chất với các đại diện chính là ginsenoside-Re, - Rg1, notoginsenoside-R1. Các saponin có cấu trúc occotillol gồm 11 hợp chất với các đại diện chính là majoside-R1 và -R2 [Nguyễn Thượng Dong et al., 2007].
Theo Yamasaki (2000), các hợp chất saponin mới của sâm Ngọc Linh có một số đặc điểm đáng chú ý như sau:
+ VG-R1 và VG-R2 là saponin ocotillol có nhóm acetyl trên chuỗi đường ở C-6.
+ VG-R3 là chất duy nhất thiếu nhóm -OH tại vị trí C-12 trong tất cả các saponin được phân lập từ loài này.
+ VG-R4 là một saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol có mang một trong hai chuỗi đường ở C-3, trong khi các saponin này được tìm thấy trước đây chỉ mang các chuỗi đường ở C-6 và C-20, hoặc C-6 và C-12.
+ VG-R5 và -R6 là hai saponin có chứa cầu nối α-glycoside hiếm gặp trong tự nhiên. VG-R7 là G-Rd xylosyl hoá.
+ VG-R8 có một mạch có liên kết đôi có hướng tại -OH ở C-25. Cấu trúc này có điểm tương đồng với majonoside F4, có 3-O- và 20-O-diβ-d-glucoside trên cùng một nhóm aglycone. VG-R9 cũng có liên kết đôi có hướng tại C-36 và có cấu trúc tương đồng với majonoside-F1.
+ Các VG-R10, -R12, -R13, -R14, -R15, -R16, -R17, -R19, -R20, -R21 là các saponin có cấu trúc aglycon mới. VG-R13 là một glycoside đầu tiên phát hiện trong một loài Panax có aglycon là dammarenediol. Chất này có thể là một chất trung
gian trong quá trình sinh tổng hợp của 20(S)-protopanaxadiol và 20(S)- protopanaxatriol [Nguyễn Thượng Dong et al., 2007].
1.4.3.2. Phần trên mặt đất (thân và lá)
Có 19 saponin dammaran đã được phân lập từ phần trên mặt đất của sâm Ngọc Linh, bao gồm 11 saponin đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vinaginsenoside-L1 đến -L8. Khác với phần dưới mặt đất, các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol chiếm tỉ lệ rất cao trong thành phần saponin từ phần trên mặt đất với đại diện chính là notoginsenoside-Fc, G-Rb3, N-Fe và VG-L2. Các saponin 20(S)-protopanaxatriol gồm có P-RS1, G-Re và G-Rg1 với tỉ lệ thấp. Ngoài ra còn có các saponin có cấu trúc ocotillol với đại diện chính là VG-R1 nhưng chiếm tỉ lệ thấp.
1.4.3.3. Các thành phần khác
Polyacetylene: 7 hợp chất polyacetylene đã được phân lập ở phân đoạn ít phân cực từ phần dưới mặt đất của sâm Ngọc Linh.
Acid béo: Có 17 acid béo từ 8-20 cacbon, trong đó chiếm tỉ lệ lớn nhất là acid linoleic (40,04%); acid palmitic (29,62%); acid oleic (13,26%); acid stearic (4,48%) và acid linolenic (2,61%).
Acid amin: 18 acid amin đã được xác định. Thành phần này gồm đủ 8 acid amin cần thiết cho cơ thể, một số acid amin có tỉ lệ rất cao như arginine 46,66%, lysine 17,90% và tryptophan 10,20% đã được xác định có tính chống lão hoá tế bào.
Các nguyên tố vi lượng và đa lượng: 20 nguyên tố vi lượng và đa lượng của phần dưới mặt đất sâm Ngọc Linh đã được xác định, trong đó bao gồm một số các nguyên tố có tác dụng sinh học như K, Na, Mg, Mn, Cu, Fe, Co, Zn, Se.
1.4.4. Các tác dụng của sâm Ngọc Linh
Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương: Sâm Ngọc Linh liều thấp có tác dụng kích thích thần kinh, làm tăng hoạt động vận động và trí nhớ, nhưng liều cao lại ức chế thần kinh.
Tác dụng chống trầm cảm: Sâm Ngọc Linh có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống một lần 200 mg/kg hoặc liều 50 – 100 mg/kg dùng trong 7 ngày ở chuột nhắt
trắng; majonosid-R2 tiêm màng bụng có tác dụng chống trầm cảm ở cả 3 liều 3,1; 6,2 và 12,5 mg/kg.
Tác dụng tăng sinh lực: Sâm Ngọc Linh có tác dụng tăng lực trong thí nghiệm chuột bơi, làm tăng sinh lực chống lại sự mệt mỏi, giúp phục hồi sức lực.
Tác dụng sinh thích ứng (adaptogenesis): Trong stress vật lý, cho chuột nhắt trắng uống sâm Ngọc Linh liều 100 mg/kg có tác dụng làm tăng khả năng chịu đựng của chuột đối với nhiệt độ cao (37-42oC) và nhiệt độ thấp (–5oC), làm kéo dài thời gian sống thêm của chuột thí nghiệm.
Trong stress vật lý, chuột nhắt trắng được nuôi riêng từng con trong 4 tuần, thời gian ngủ khi tiêm natri barbital giảm đi 30%. Sâm Ngọc Linh liều uống 50-200