Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương: Sâm Ngọc Linh liều thấp có tác dụng kích thích thần kinh, làm tăng hoạt động vận động và trí nhớ, nhưng liều cao lại ức chế thần kinh.
Tác dụng chống trầm cảm: Sâm Ngọc Linh có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống một lần 200 mg/kg hoặc liều 50 – 100 mg/kg dùng trong 7 ngày ở chuột nhắt
trắng; majonosid-R2 tiêm màng bụng có tác dụng chống trầm cảm ở cả 3 liều 3,1; 6,2 và 12,5 mg/kg.
Tác dụng tăng sinh lực: Sâm Ngọc Linh có tác dụng tăng lực trong thí nghiệm chuột bơi, làm tăng sinh lực chống lại sự mệt mỏi, giúp phục hồi sức lực.
Tác dụng sinh thích ứng (adaptogenesis): Trong stress vật lý, cho chuột nhắt trắng uống sâm Ngọc Linh liều 100 mg/kg có tác dụng làm tăng khả năng chịu đựng của chuột đối với nhiệt độ cao (37-42oC) và nhiệt độ thấp (–5oC), làm kéo dài thời gian sống thêm của chuột thí nghiệm.
Trong stress vật lý, chuột nhắt trắng được nuôi riêng từng con trong 4 tuần, thời gian ngủ khi tiêm natri barbital giảm đi 30%. Sâm Ngọc Linh liều uống 50-200 mg/kg hoặc hoạt chất majonosid-R2 tiêm màng bụng liều 3,1-12,5 mg/kg làm cho thời gian ngủ trở lại bình thường.
Tác dụng chống oxy hóa: Trên thí nghiệm in vitro dùng dịch nổi của mô não,
gan và phân đoạn vi thể gan của chuột nhắt trắng, saponin sâm Ngọc Linh ở nồng độ 0,05-0,5 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA (malonyl dialdehyde) là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng sinh học.
Tác dụng kích thích miễn dịch: Bột chiết sâm Ngọc Linh liều uống 500 mg/kg và majonosid-R2 tiêm trong màng bụng có tác dụng làm tăng chỉ số thực bào trong thí nghiệm in vitro và in vivo ở chuột nhắt trắng. Dùng liều E. coli gây chết chuột
nhắt trắng. Nếu kết hợp dùng sâm và majonosid-R2 với liều như trên sẽ làm tăng tỉ lệ chuột sống sót. Có lẽ do thuốc có tác dụng làm tăng đại thực bào đối với E. coli.
Tác dụng phục hồi máu: Trong thí nghiệm làm giảm hồng cầu và bạch cầu ở động vật thí nghiệm, sâm Ngọc Linh có tác dụng làm phục hồi số lượng hồng cầu và bạch cầu đã bị giảm.
Tác dụng dược lý khác: Sâm Ngọc Linh còn có tác dụng tăng cường nội tiết tố sinh dục, điều hòa hoạt động của tim, tác dụng chống tăng cholesterol máu, tác dụng bảo vệ gan khỏi các yếu tố gây độc đối với gan.
Chương 2
VẬT LIỆU &
2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Nguồn mẫu
Vật liệu thí nghiệm là các mẫu cấy lá, cuống lá, củ từ cây sâm Ngọc Linh in
vitro 3 tháng tuổi được nuôi cấy tại phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây
trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. Vật liệu thực vật được cắt với kích thước: Lá 1 x 1 cm, cuống dài 1 cm, củ 0,5 x 0,5 x 0,1 cm; mô sẹo 0,5 x 0,5 cm.
2.1.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường MS cơ bản, ½MS, MS½, SH, ½SH và SH½. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật: 2,4-D, NAA, Kin.
Các chất phụ gia: các tiền chất của nhóm PA (Arg, Orn), các hợp chất thuộc nhóm PA (Put, Spd, Spm).
Các thành phần khác: đường sucrose (30 g/l), agar (8 g/l).
Môi trường được điều chỉnh về pH = 5,8 (bằng NaOH 1N hay HCl 1N) trước khi hấp khử trùng bằng autoclave ở 1 atm (121oC) trong 30 phút.
2.1.3. Điều kiện thí nghiệm
Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 25 ± 2ᴏC, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ 40 - 45 µmol.m-2.s-1 (đối với các thí nghiệm có chiếu sáng) và độ ẩm trung bình 55 - 60%. Một số thí nghiệm được đặt trong điều kiện tối hoàn toàn hoặc trên máy lắc hãng Innova 2100 plantform shaker (Hermle, Đức) ở 100 vòng/phút.
2.1.4. Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài
Đề tài được tiến hành tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, số 116 Xô Viết Nghệ Tĩnh, Đà Lạt, Lâm Đồng. Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 1 năm 2013 tới tháng 12 năm 2014.
2.2. PHƯƠNG PHÁP
2.2.1. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang
Giải phẫu hình thái thực vật bằng phương pháp nhuộm đơn, nhuộm kép hay nhuộm hai màu. Nguyên tắc chung của việc nhuộm màu: các tế bào sống (tế bào nhu mô, vùng mô phân sinh có tế bào chất đậm đặc, hoạt động trao đổi chất diễn ra mạnh) sẽ bắt màu hồng, với vùng mô phân sinh chứa các tế bào có kích thước nhỏ, nằm gần nhau dưới kính hiển vi sẽ bắt màu hồm đậm; còn các tế bào chuyên hóa hoặc đã chết (các tế bào mô mạch hóa gỗ) sẽ bắt màu xanh.
Mô nuôi cấy được cắt thành các lát mỏng đi qua trục rễ hoặc chồi. Lát cắt được xử lý với Javel 5% trong 15 phút để loại bỏ nội chất tế bào sau đó rửa với nước cất rồi xử lý tiếp tục với acid acetic 3% trong 5 phút để loại bỏ Javel trước khi tiến hành nhuộm với phẩm nhuộm 2 màu (acetocarmine và iodine) trong 3 phút. Tiếp đó đặt mẫu vật lên lame kính, đặt lamel lên và quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại tăng dần.
2.2.2. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát cấu trúc phôi bằng kính hiển vi điện tử quét
Các khối phôi được tách ra khỏi mẫu cấy ban đầu và ngâm trong dung dịch paraformaldehyde 4% ở nhiệt độ 4oC để qua đêm. Mẫu được rửa lại 3 lần trong đệm sodium phosphate 25 mM (pH = 7) trước khi tiến hành loại nước bằng cách ngâm trong ethanol lần lượt qua các nồng độ: 10% (30 phút), 30% (30 phút), 50% (30 phút), 65% (30 phút), 75% (30 phút), 90% (30 phút), 95% (30 phút), ethanol tuyệt đối (30 phút, 3 lần), ethanol tuyệt đối để qua đêm ở 4oC (18-24h). Mẫu được xử lý khô tới hạn qua carbon dioxide trước khi gắn lên đế aluminum và phủ lên một lớp palladium 60 nm [Bùi Văn Thế Vinh et al., 2014]. Ảnh hiển vi được ghi nhận bằng kính hiển vi điện tử quét SEM (scanning electron microscopy Jeol, Nhật Bản) tại Phòng hiển vi điện tử, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, số 1, đường Yersin, Hà Nội.
2.2.3. Thu thập mẫu và phân tích Polyamine nội sinh
Thu thập mẫu để phân tích các PA nội sinh: Các mẫu mô sẹo xốp có khối lượng khoảng 100 mg (trên môi trường cảm ứng phôi ở thí nghiệm 3 có bổ sung nồng độ PA tối ưu) được thu thập ở các thời điểm 0, 7, 14 và 21 ngày sau nuôi cấy.
Phân tích hàm lượng PA nội sinh: Mẫu sau khi thu thập được gửi tới Trung tâm sắc kí Hải Đăng (số 79, Trương Định, Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh) để phân tích thành phần PA nội sinh.
2.3. Bố trí thí nghiệm
2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu cấy khác nhau của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro
Mục đích: Xác định loại mẫu cấy cảm ứng tạo mô sẹo thích hợp nhất từ 3
nguồn mẫu lá, cuống lá, củ của cây sâm Ngọc Linh in vitro trên môi trường cảm
ứng tạo mô sẹo.
Cách tiến hành: Mẫu lá in vitro được cắt thành từng mảnh nhỏ có kích thước 1
x 1 cm, mẫu cuống lá in vitro được cắt thành từng đoạn có chiều dài 1 cm, mẫu củ
in vitro được cắt thành từng mẩu nhỏ có kích thước 0,5 cm x 0,5 cm x 1 mm. Các
mẫu cấy được đặt trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA [Nhut et al., 2012].
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 8 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ
mẫu hình thành mô sẹo (%); khối lượng tươi của mẫu (mg) ; khối lượng khô của mẫu (mg); hình thái mô sẹo.
2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác nhau lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh
Mục đích: Khảo sát khả năng hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi từ
phần khoáng khác nhau để xác định thành phần khoáng thích hợp cho môi trường cảm ứng.
Cách tiến hành: mẫu cấy tốt nhất trong thí nghiệm 1 được cấy vào các môi
trường có thành phần khoáng đa lượng và vi lượng khác nhau như MS, ½MS, MS½, ½SH, SH½, SH. Mỗi môi trường đều được bổ sung thành phần vitamin của MS, 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA.
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 8 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ
mẫu hình thành mô sẹo (%); khối lượng tươi của mẫu (mg); khối lượng khô của mẫu (mg); hình thái mô sẹo.
2.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin lên sự hình thành phôi vô tính có nguồn gốc từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh
Mục đích: Tìm ra nồng độ 2,4-D phù hợp nhất khi kết hợp với 0,5 mg/l NAA
và 0,2 mg/l Kin lên khả năng cảm ứng và tần suất phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo xốp.
Cách tiến hành: Mô sẹo được cảm ứng từ thí nghiệm 2 được cấy chuyền sang
tạo phôi MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ khác nhau (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,5; 2 mg/l).
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ
mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu (mg); đặc điểm hình thái, cấu trúc phôi.
2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy và điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh nuôi
2.3.4.1. Thí nghiệm 4.1: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (đặc, lỏng tĩnh, lỏng lắc) lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh
Mục đích: Đánh giá khả năng hình thành, tần suất phát sinh phôi vô tính và
tìm ra điều kiện nuôi cấy tốt nhất trong 3 điều kiện nuôi cấy khác nhau.
Cách tiến hành: Mô sẹo từ lá cấy chuyền sang môi trường tăng sinh mô sẹo ở
thí nghiệm 2 và chuyển sang môi trường cảm ứng phôi ở thí nghiệm 3. Môi trường đặc được bổ sung 8 g/l agar, môi trường lỏng không bổ sung agar, môi trường lỏng lắc được đặt trên máy lắc vòng với tốc độ 100 vòng/phút.
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ
mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu (mg); đặc điểm hình thái, cấu trúc phôi.
2.3.4.2:Thí nghiệm 4.2: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh
Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện sáng và tối; tìm ra điều kiện
chiếu sáng thích hợp cho sự cảm ứng và nâng cao tần suất phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo.
Cách tiến hành: Mô sẹo được cấy trên môi trường tạo phôi ở thí nghiệm 3.
Các bình nuôi cấy được đặt trong điều kiện chiếu sáng 0 và 16 giờ/ngày với cường độ 40 - 45 µmol.m-2.s-1.
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ
mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu (mg); đặc điểm hình thái, cấu trúc phôi.
2.3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của một số tiền chất sinh tổng hợp Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh
Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng và hiệu quả của các tiền chất của PA lên khả
năng hình thành và tần suất phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh.
Cách tiến hành: Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường tạo phôi ở thí nghiệm
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ
mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu; đặc điểm hình thái, cấu trúc phôi.
2.3.7. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của một số Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh
Mục đích: Đánh giá hiệu quả Put, Spd, Spm và tìm ra loại PA gây tác dụng tốt
nhất lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh.
Cách tiến hành: Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường tạo phôi ở thí nghiệm
3 có bổ sung Put, Spd và Spm riêng rẽ ở các nồng độ khác nhau (0, 10, 50, 100, 150, 200 μM).
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ
mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu; đặc điểm hình thái, cấu trúc phôi.
2.4. Xử lý số liệu
Mẫu được cấy vào 10 bình thủy tinh 250 ml chứa 40 ml môi trường. Với thí nghiệm khảo sát nguồn mẫu cấy 5 mẫu/bình, 5 lần lặp lại; đối với các thí nghiệm khảo sát mô sẹo xốp: 3 mẫu/bình, 3 lần lặp lại.
Số liệu và biểu đồ được xử lý bằng phần mềm phần mềm SPSS 16.0 với
Chương 3
KẾT QUẢ &
3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU LÊN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO CÓ KHẢ NĂNG PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH SÂM NGỌC LINH
Trong thí nghiệm này, các mẫu cấy cuống lá, lá và củ của cây sâm Ngọc Linh in vitro 3 tháng tuổi được cắt thành các mẩu nhỏ có kích thước là 1 cm; 0,5 × 0,5 cm; 0,5 × 0,5 × 0,1 cm; tương ứng và cấy vào môi trường SH có bổ sung 1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 8,5 g/l agar. Sau 8 tuần nuôi cấy khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu thì khác nhau và được thể hiện trên Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu khác nhau của cây sâm Ngọc Linh
Ghi chú: Các chữ cái a, b, ... trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với =0,05 theo
Duncan’s test.
Mô sẹo phát sinh mạnh nhất đối với mẫu lá và củ (Hình 3.1b, c), đạt tỉ lệ 100%. Mô sẹo phát sinh đầu tiên trên mẫu cấy củ, có dạng xốp, hình thành xung quanh viền củ. Mẫu củ cảm ứng mô sẹo sớm nhất, chỉ sau 2 tuần nuôi cấy. Các mô sẹo này tập trung viền xung quanh củ, nơi có các tế bào nhu mô vỏ. Ở giữa củ, nơi tế bào dự trữ nhiều hạt tinh bột đã không hình thành mô sẹo xốp. Mặc dù khối lượng tươi và khối lượng khô của củ đạt cao nhất nhưng chủ yếu là do lượng tinh bột dự trữ bên trong (Hình 3.1c1). Mô sẹo xốp, trong, mọng nước cũng được tạo thành từ các mẫu cấy lá và cuống lá. Với các mẫu lá, mô sẹo hình thành từ các vết cắt và sau đó tăng sinh, lan dần vào phía trong các mẫu lá làm cho toàn bộ mặt lá dày lên (Hình 3.1b1). Cuống lá cảm ứng tạo sẹo xốp chậm nhất. Mô sẹo bắt đầu từ hai đầu cuống và đi dọc dần vào trong cuống. Một số mẫu cuống trở nên xanh hơn và cứng hơn; đồng thời không phát sinh sẹo xốp cũng được ghi nhận.
Trong thời gian từ tuần thứ 6 và thứ 7 sự tăng sinh của sẹo xốp từ mẫu lá trở nên rất nhanh. Tuy nhiên tiếp tục theo dõi thí nghiệm tới tuần thứ 12 và 16 nhận thấy rằng mẫu mô sẹo từ cuống lá tăng sinh mạnh nhất trong 3 nguồn mẫu được khảo sát (dữ liệu không thể hiện). Ngoài ra, thí nghiệm này cũng ghi nhận sự xuất
Nguồn mẫu
Cảm ứng tạo
mô sẹo (%) Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) Hình thái mô sẹo
Cuống lá 92 288,33b 17,00b Màu trắng trong, mọng nước
Lá 100 320,67b 24,67b Màu trắng trong, mọng nước
hiện phôi trên các mẫu cấy củ và lá. Phôi màu trắng sáng với các trạng thái hình cầu và hình tim là chủ yếu. Tuy nhiên, mẫu cuống lá chưa có hiện tượng này. Hiện tượng rễ bất định xuất hiện ở cả 3 nguồn mẫu cũng được quan sát từ các khối cầu nhỏ màu tím li ti trên đám sẹo xốp.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy lên khả năng hình thành mô sẹo xốp của cây sâm Ngọc Linh. a, b, c: mô sẹo trên các mẫu cấy cuống lá, lá và củ sâm Ngọc Linh; a1, b1, c1: