Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 25 ± 2ᴏC, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ 40 - 45 µmol.m-2.s-1 (đối với các thí nghiệm có chiếu sáng) và độ ẩm trung bình 55 - 60%. Một số thí nghiệm được đặt trong điều kiện tối hoàn toàn hoặc trên máy lắc hãng Innova 2100 plantform shaker (Hermle, Đức) ở 100 vòng/phút.
2.1.4. Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài
Đề tài được tiến hành tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, số 116 Xô Viết Nghệ Tĩnh, Đà Lạt, Lâm Đồng. Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 1 năm 2013 tới tháng 12 năm 2014.
2.2. PHƯƠNG PHÁP
2.2.1. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang
Giải phẫu hình thái thực vật bằng phương pháp nhuộm đơn, nhuộm kép hay nhuộm hai màu. Nguyên tắc chung của việc nhuộm màu: các tế bào sống (tế bào nhu mô, vùng mô phân sinh có tế bào chất đậm đặc, hoạt động trao đổi chất diễn ra mạnh) sẽ bắt màu hồng, với vùng mô phân sinh chứa các tế bào có kích thước nhỏ, nằm gần nhau dưới kính hiển vi sẽ bắt màu hồm đậm; còn các tế bào chuyên hóa hoặc đã chết (các tế bào mô mạch hóa gỗ) sẽ bắt màu xanh.
Mô nuôi cấy được cắt thành các lát mỏng đi qua trục rễ hoặc chồi. Lát cắt được xử lý với Javel 5% trong 15 phút để loại bỏ nội chất tế bào sau đó rửa với nước cất rồi xử lý tiếp tục với acid acetic 3% trong 5 phút để loại bỏ Javel trước khi tiến hành nhuộm với phẩm nhuộm 2 màu (acetocarmine và iodine) trong 3 phút. Tiếp đó đặt mẫu vật lên lame kính, đặt lamel lên và quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại tăng dần.
2.2.2. Giải phẫu hình thái thực vật và quan sát cấu trúc phôi bằng kính hiển vi điện tử quét
Các khối phôi được tách ra khỏi mẫu cấy ban đầu và ngâm trong dung dịch paraformaldehyde 4% ở nhiệt độ 4oC để qua đêm. Mẫu được rửa lại 3 lần trong đệm sodium phosphate 25 mM (pH = 7) trước khi tiến hành loại nước bằng cách ngâm trong ethanol lần lượt qua các nồng độ: 10% (30 phút), 30% (30 phút), 50% (30 phút), 65% (30 phút), 75% (30 phút), 90% (30 phút), 95% (30 phút), ethanol tuyệt đối (30 phút, 3 lần), ethanol tuyệt đối để qua đêm ở 4oC (18-24h). Mẫu được xử lý khô tới hạn qua carbon dioxide trước khi gắn lên đế aluminum và phủ lên một lớp palladium 60 nm [Bùi Văn Thế Vinh et al., 2014]. Ảnh hiển vi được ghi nhận bằng kính hiển vi điện tử quét SEM (scanning electron microscopy Jeol, Nhật Bản) tại Phòng hiển vi điện tử, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, số 1, đường Yersin, Hà Nội.
2.2.3. Thu thập mẫu và phân tích Polyamine nội sinh
Thu thập mẫu để phân tích các PA nội sinh: Các mẫu mô sẹo xốp có khối lượng khoảng 100 mg (trên môi trường cảm ứng phôi ở thí nghiệm 3 có bổ sung nồng độ PA tối ưu) được thu thập ở các thời điểm 0, 7, 14 và 21 ngày sau nuôi cấy.
Phân tích hàm lượng PA nội sinh: Mẫu sau khi thu thập được gửi tới Trung tâm sắc kí Hải Đăng (số 79, Trương Định, Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh) để phân tích thành phần PA nội sinh.
2.3. Bố trí thí nghiệm
2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu cấy khác nhau của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro
Mục đích: Xác định loại mẫu cấy cảm ứng tạo mô sẹo thích hợp nhất từ 3
nguồn mẫu lá, cuống lá, củ của cây sâm Ngọc Linh in vitro trên môi trường cảm
ứng tạo mô sẹo.
Cách tiến hành: Mẫu lá in vitro được cắt thành từng mảnh nhỏ có kích thước 1
x 1 cm, mẫu cuống lá in vitro được cắt thành từng đoạn có chiều dài 1 cm, mẫu củ
in vitro được cắt thành từng mẩu nhỏ có kích thước 0,5 cm x 0,5 cm x 1 mm. Các
mẫu cấy được đặt trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA [Nhut et al., 2012].
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 8 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ
mẫu hình thành mô sẹo (%); khối lượng tươi của mẫu (mg) ; khối lượng khô của mẫu (mg); hình thái mô sẹo.
2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác nhau lên sự hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh
Mục đích: Khảo sát khả năng hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi từ
phần khoáng khác nhau để xác định thành phần khoáng thích hợp cho môi trường cảm ứng.
Cách tiến hành: mẫu cấy tốt nhất trong thí nghiệm 1 được cấy vào các môi
trường có thành phần khoáng đa lượng và vi lượng khác nhau như MS, ½MS, MS½, ½SH, SH½, SH. Mỗi môi trường đều được bổ sung thành phần vitamin của MS, 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA.
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 8 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ
mẫu hình thành mô sẹo (%); khối lượng tươi của mẫu (mg); khối lượng khô của mẫu (mg); hình thái mô sẹo.
2.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin lên sự hình thành phôi vô tính có nguồn gốc từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh
Mục đích: Tìm ra nồng độ 2,4-D phù hợp nhất khi kết hợp với 0,5 mg/l NAA
và 0,2 mg/l Kin lên khả năng cảm ứng và tần suất phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo xốp.
Cách tiến hành: Mô sẹo được cảm ứng từ thí nghiệm 2 được cấy chuyền sang
tạo phôi MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l Kin kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ khác nhau (0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,5; 2 mg/l).
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ
mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu (mg); đặc điểm hình thái, cấu trúc phôi.
2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy và điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh nuôi
2.3.4.1. Thí nghiệm 4.1: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (đặc, lỏng tĩnh, lỏng lắc) lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh
Mục đích: Đánh giá khả năng hình thành, tần suất phát sinh phôi vô tính và
tìm ra điều kiện nuôi cấy tốt nhất trong 3 điều kiện nuôi cấy khác nhau.
Cách tiến hành: Mô sẹo từ lá cấy chuyền sang môi trường tăng sinh mô sẹo ở
thí nghiệm 2 và chuyển sang môi trường cảm ứng phôi ở thí nghiệm 3. Môi trường đặc được bổ sung 8 g/l agar, môi trường lỏng không bổ sung agar, môi trường lỏng lắc được đặt trên máy lắc vòng với tốc độ 100 vòng/phút.
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ
mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu (mg); đặc điểm hình thái, cấu trúc phôi.
2.3.4.2:Thí nghiệm 4.2: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh
Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện sáng và tối; tìm ra điều kiện
chiếu sáng thích hợp cho sự cảm ứng và nâng cao tần suất phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo.
Cách tiến hành: Mô sẹo được cấy trên môi trường tạo phôi ở thí nghiệm 3.
Các bình nuôi cấy được đặt trong điều kiện chiếu sáng 0 và 16 giờ/ngày với cường độ 40 - 45 µmol.m-2.s-1.
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ
mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu (mg); đặc điểm hình thái, cấu trúc phôi.
2.3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của một số tiền chất sinh tổng hợp Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh
Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng và hiệu quả của các tiền chất của PA lên khả
năng hình thành và tần suất phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh.
Cách tiến hành: Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường tạo phôi ở thí nghiệm
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ
mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu; đặc điểm hình thái, cấu trúc phôi.
2.3.7. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của một số Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh
Mục đích: Đánh giá hiệu quả Put, Spd, Spm và tìm ra loại PA gây tác dụng tốt
nhất lên sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh.
Cách tiến hành: Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường tạo phôi ở thí nghiệm
3 có bổ sung Put, Spd và Spm riêng rẽ ở các nồng độ khác nhau (0, 10, 50, 100, 150, 200 μM).
Chỉ tiêu theo dõi: Sau 12 tuần nuôi cấy, tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu: Tỉ lệ
mẫu tạo phôi (%); số lượng phôi/mẫu; khối lượng tươi của mẫu; đặc điểm hình thái, cấu trúc phôi.
2.4. Xử lý số liệu
Mẫu được cấy vào 10 bình thủy tinh 250 ml chứa 40 ml môi trường. Với thí nghiệm khảo sát nguồn mẫu cấy 5 mẫu/bình, 5 lần lặp lại; đối với các thí nghiệm khảo sát mô sẹo xốp: 3 mẫu/bình, 3 lần lặp lại.
Số liệu và biểu đồ được xử lý bằng phần mềm phần mềm SPSS 16.0 với
Chương 3
KẾT QUẢ &
3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN MẪU LÊN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO CÓ KHẢ NĂNG PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH SÂM NGỌC LINH
Trong thí nghiệm này, các mẫu cấy cuống lá, lá và củ của cây sâm Ngọc Linh in vitro 3 tháng tuổi được cắt thành các mẩu nhỏ có kích thước là 1 cm; 0,5 × 0,5 cm; 0,5 × 0,5 × 0,1 cm; tương ứng và cấy vào môi trường SH có bổ sung 1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 8,5 g/l agar. Sau 8 tuần nuôi cấy khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu thì khác nhau và được thể hiện trên Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khả năng hình thành mô sẹo xốp từ các nguồn mẫu khác nhau của cây sâm Ngọc Linh
Ghi chú: Các chữ cái a, b, ... trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt với =0,05 theo
Duncan’s test.
Mô sẹo phát sinh mạnh nhất đối với mẫu lá và củ (Hình 3.1b, c), đạt tỉ lệ 100%. Mô sẹo phát sinh đầu tiên trên mẫu cấy củ, có dạng xốp, hình thành xung quanh viền củ. Mẫu củ cảm ứng mô sẹo sớm nhất, chỉ sau 2 tuần nuôi cấy. Các mô sẹo này tập trung viền xung quanh củ, nơi có các tế bào nhu mô vỏ. Ở giữa củ, nơi tế bào dự trữ nhiều hạt tinh bột đã không hình thành mô sẹo xốp. Mặc dù khối lượng tươi và khối lượng khô của củ đạt cao nhất nhưng chủ yếu là do lượng tinh bột dự trữ bên trong (Hình 3.1c1). Mô sẹo xốp, trong, mọng nước cũng được tạo thành từ các mẫu cấy lá và cuống lá. Với các mẫu lá, mô sẹo hình thành từ các vết cắt và sau đó tăng sinh, lan dần vào phía trong các mẫu lá làm cho toàn bộ mặt lá dày lên (Hình 3.1b1). Cuống lá cảm ứng tạo sẹo xốp chậm nhất. Mô sẹo bắt đầu từ hai đầu cuống và đi dọc dần vào trong cuống. Một số mẫu cuống trở nên xanh hơn và cứng hơn; đồng thời không phát sinh sẹo xốp cũng được ghi nhận.
Trong thời gian từ tuần thứ 6 và thứ 7 sự tăng sinh của sẹo xốp từ mẫu lá trở nên rất nhanh. Tuy nhiên tiếp tục theo dõi thí nghiệm tới tuần thứ 12 và 16 nhận thấy rằng mẫu mô sẹo từ cuống lá tăng sinh mạnh nhất trong 3 nguồn mẫu được khảo sát (dữ liệu không thể hiện). Ngoài ra, thí nghiệm này cũng ghi nhận sự xuất
Nguồn mẫu
Cảm ứng tạo
mô sẹo (%) Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) Hình thái mô sẹo
Cuống lá 92 288,33b 17,00b Màu trắng trong, mọng nước
Lá 100 320,67b 24,67b Màu trắng trong, mọng nước
hiện phôi trên các mẫu cấy củ và lá. Phôi màu trắng sáng với các trạng thái hình cầu và hình tim là chủ yếu. Tuy nhiên, mẫu cuống lá chưa có hiện tượng này. Hiện tượng rễ bất định xuất hiện ở cả 3 nguồn mẫu cũng được quan sát từ các khối cầu nhỏ màu tím li ti trên đám sẹo xốp.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy lên khả năng hình thành mô sẹo xốp của cây sâm Ngọc Linh. a, b, c: mô sẹo trên các mẫu cấy cuống lá, lá và củ sâm Ngọc Linh; a1, b1, c1:
hình dưới kính hiển vi soi nổi, tương ứng.
Trong việc tạo mô sẹo sâm Ngọc Linh, nồng độ 1 mg/l 2,4-D kết hợp với 0,2 mg/l TDZ đã được thực hiện trên lát cắt củ bởi Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2010). Song mô sẹo được tạo thành là loại mô sẹo cứng. Đây là các mô sẹo có khả năng phát sinh cơ quan (chồi, rễ). Còn muốn phát sinh phôi thì phải thông qua một giai đoạn tạo mô sẹo xốp trung gian. Điều này sẽ khiến quá trình nhân giống in vitro loài sâm Ngọc Linh bị kéo dài ít nhất là 2 tháng.
Các nguồn mẫu lá, thân, lóng, lá mầm... cũng được dùng để tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi ở nhiều đối tượng khác nhau. Mẫu lá cũng được chứng minh là cảm ứng mô sẹo tốt hơn mẫu thân ở cây Citrus jambhiri [Savita et al., 2010], Cannabis
sativa L. [Aurelia et al., 2005; Feeney và Punija, 2003]. Tuy nhiên mẫu thân lại
(thuộc họ Bầu bí) [Shasthree et al., 2012]. Ngược lại mẫu rễ cây Cannabis sativa L. và mẫu lóng cây Acacia mangium cảm ứng mô sẹo kém [Fisse et al., 1981; Xie và Hong, 2001].
Trong nghiên cứu này, mặc dù mẫu củ là tốt nhất về các chỉ tiêu theo dõi, song một cây con in vitro cho thông thường 3 - 4 mảnh cấy củ; 5 - 6 mảnh cấy
cuống và 8 - 10 mảnh cấy lá. Cho nên tổng số mô sẹo được tạo ra từ lá nhiều hơn hẳn so sánh với cuống và củ. Vì vậy, chúng tôi sử dụng nguồn mô sẹo từ lá cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC MÔI TRƯỜNG KHOÁNG LÊN SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO XỐP SÂM NGỌC LINH
Trong nuôi cấy mô, thành phần môi trường khoáng là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự cảm ứng và tăng sinh tế bào. Tùy loài thực vật và cơ quan nuôi cấy mà môi trường khoáng được sử dụng khác nhau [Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002]. Trong thí nghiệm này, các mẫu lá sâm Ngọc Linh in vitro được cắt và cấy trên 6 loại môi trường khoáng khác nhau gồm MS, ½MS,
MS½ , SH, ½SH, SH½. Trong đó, cố định vitamin của môi trường MS cho tất cả các thí nghiệm. Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả được thể hiện trên Bảng 3.2.
Kết quả cho thấy trên cả 6 môi trường đều có sự hình thành mô sẹo với tỉ lệ và khả năng tăng sinh khác nhau. Trong đó môi trường SH½ cho hiệu quả tốt nhất đạt khối lượng tươi 724,67 mg và khối lượng khô 39 mg; tiếp theo là môi trường SH; các môi trường MS, ½MS và ½SH cho kết quả tương tự nhau; thấp nhất là môi trường MS½ (Bảng 3.2). Mô sẹo được tạo ra trên môi trường SH và SH cải biên có màu trắng trong, sáng, xốp, mọc thành đám dày, xung quanh mặt cắt lá và dễ vỡ vụn. Trong khi trên môi trường MS và MS cải biên, mô sẹo được tạo ra có màu hơi nâu, xốp, dễ vỡ vụn nhưng kích thước mô sẹo nhỏ hơn (Hình 3.2); đồng thời, chúng tôi cũng ghi nhận hiện tượng phôi xuất hiện trên bề mặt đám mô sẹo ở trạng thái cầu, tim với số lượng từ 4 - 10 phôi. Không có phôi xuất hiện trên môi trường SH và SH cải biên trong thời gian khảo sát.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên khả năng phát sinh mô sẹo xốp từ lá sâm Ngọc Linh Môi trường khoáng Cảm ứng tạo mô sẹo (%) Khối lượng tươi (mg) Khối lượng
khô (mg) Hình thái mô sẹo