1.3.2.1. Sinh tổng hợp Polyamine
Các PA như Put, Spd, Spm và tiền chất của chúng gồm Arg và Orn đều là các amine có mặt trong tất cả các tế bào. Sự tổng hợp các PA từ các amino acid thông qua quá trình loại CO2. Các amino acid cơ bản như Arginine và Ornithine có vai trò cung cấp khung carbon chính để tạo nên Put, nhờ hoạt động của ODC và ADC, trong khi có sự đóng góp của Methinonine với nhóm propylamine để Put chuyển thành Spd và từ Spd chuyển thành Spm đã được thực hiện bởi SAMDC [Kakkar et
al., 2000].
Ở động vật có vú và nấm, Put được hình thành từ Orn trong một phản ứng được xúc tác bởi ODC. Tuy nhiên ở thực vật, tồn tại thêm một con đường thay thế cho sự hình thành Put bắt đầu từ Arg trong phản ứng được xúc tác bởi Agmatine iminohydrolase và N-carbamonylputrescine amidohydrolase (CPA) [Slocum et al.,
1984]. Trong hai con đường ODC và ADC, con đường ODC có phổ biến ở tất cả các sinh vật sống. Hoạt động của con đường này đã được phát hiện có trong hầu hết
các loài và gene mã hóa cho ODC cũng đã được mô tả [Michael et al., 1996,
Imanishi et al., 1998].
Hình 1.4. Trao đổi chất PA và tương tác với các con đường trao đổi chất khác [Alcázar et al., 2010]
Con đường sinh tổng hợp cho PA và các chất chuyển hóa có liên quan được mô tả bởi các đường liên tục. Đường đứt nét cho thấy sự hình thành của alkaloid putrescine có nguồn gốc từ PA liên hợp và các quá trình dị hóa. Các số tương ứng với các enzyme sau: 1 nitrate reductase, 2 reductase nitrit, 3 nitrogenase, 4 glutamine synthetase, 5 glutamate synthase, 6 glutamate N-acetyltransferase, 7 acetylglutamate kinase, 8 N-acetyl - reductase phosphate, 9 acetylornithine transaminase, 10 acetylornithine deacetylase, 11 ornithine- carbamoyl transferase, 12 synthase arginosuccinate, 13 arginosuccinate lyase, 14 decarboxylase arginine, 15 agmatine iminohydrolase, 16 N-carbamoylputrescine amidohydrolase, 17 decarboxylase ornithine, 18 SAM synthetase, 19 SAM decarboxylase, 20 spermidine synthase, 21 spermine synthase , 22 thermospermine synthase, 23 glutamate decarboxylase, 24 diamine oxidase, 25 putrescine hydroxycinnamoyl transferase, 26 polyamine oxidase, 27 aminotransferase -aminobutyrate, 28 succinic dehydrogenase semialdehyde, 29 arginase, 30 aminotransferase ornithine, 31 nitric oxide synthase, 32 ACC synthase, 33 ACC oxidase, 34 reductase nitrat, 35 lysine decarboxylase. Chứng minh gần đây cho thấy rằng polyamine oxidase (26) không chỉ tham gia vào quá trình dị hóa sản phẩm đầu cuối của PA mà còn ở phía sau chuyển đổi từ spermine ra spermidine và từ spermidine tạo ra putrescine.
Đầu tiên, L-Arginine được biến đổi thành agmatine (Agm) nhờ enzyme ADC; sau đó Agmatine được biến đổi thành N-carbamoylputrescine nhờ enzyme agmitine iminohydrolase và cuối cùng biến đổi thành Put bởi enzyme N-carbamoylputrescine
amidohydrolase. Có vai trò cho methyl, SAM là một tiền chất cho cả PA và ethylene thông qua 1-aminocyclopropane 1-carboxylic acid (Hình 1.4) và SAM dùng để điều hòa con đường sinh tổng hợp [Evans và Malmberg, 1989]. Hơn thế nữa, ở một vài loài thực vật, một nửa aminopropyl của SAM có thể chuyển thành Put thông qua Put-N-methyl-transferase để hình thành N-methyl-Put [Hibi et al.,
1994; Tiburcio et al., 1990].
Sự tổng hợp Put bởi hai con đường xen kẽ ACD/ODC có thể được giải thích là do sự tạo ngăn tế bào khác biệt của 2 enzyme trong sự điều hòa các quá trình thực vật riêng biệt đặc hiệu [Borrell et al., 1995]. Điều này cũng chỉ ra rằng hoạt động của ADC thật sự được tìm thấy ở động vật. Nhưng sự biểu hiện nói chung cho thấy ADC có thể chỉ là con đường thứ yếu cho sự tổng hợp Put trong mô động vật có vú đặc hiệu. PA được giới hạn trong không bào, ti thể và lục lạp [Slocum, 1991]. Borrell và cộng sự (1995) tìm thấy PA trong màng thylakoid của loài spinach, kết hợp với phức hợp tiếp nhận ánh sáng (LHC) và quang hệ thống II. Những kháng thể tăng ADC của lúa yến mạch đã tiết lộ rằng enzyme này có mặt trong màng thylakoid của lục lạp và bởi sự định vị của ADC trong diệp lục, ông kết luận rằng vai trò của sự tổng hợp PA có thể duy trì hoạt động của quá trình quang hợp, ngăn cản stress thẩm thấu được cảm ứng. Nói chung, SAMDC và Spd synthase định vị trong tế bào chất, trong khi ODC được phân bố trong nhân tế bào; đồng thời, vòng tuần hoàn của ODC khá nhanh với bán chu kì sống thường ít hơn 1 giờ và thỉnh thoảng nhanh hơn một vài phút [Slocum, 1991]. SAMDC của cây thuốc lá có bán chu kì sống ức chế việc tổng hợp SAMDC bởi những PA (Spd và Spm) có thể mô tả cơ chế điều hòa quan trọng của việc tổng hợp PA ở thực vật [Slocum, 1991]. Tuy nhiên, ở lúa yến mạch, ADC được tổng hợp như là một tiền chất được tách ra để sản xuất các enzyme hoạt động trong một phản ứng mà chúng bị ức chế bởi Spm [Borrell et al., 1996].
Sự đa dạng của những hợp chất sơ cấp khác được tìm thấy ở thực vật, gồm có udecarboxylase (LDC). Hoạt động của nó tương quan chặt chẽ với sự tích lũy của alkaloid quinolizidine mà Cad là một tiền chất. Hoạt động của LDC được phân bố
trong stroma của lục lạp [Slocum, 1991]. Một vài mạch chính PA dị thường (caidine, thermine, caldopentamine) mà chúng khác biệt từ PA tổng quát trong số lượng một nửa methylenic giữa những chức năng amine mà nó được thăm dò trong sự phát triển của thực vật ở môi trường tối ưu. Có một bằng chứng tiêu biểu chống lại những giả thuyết rằng những mạch chính PA có thể đáp ứng các chất bảo vệ stress khô hạn hay stress nhiệt từ những điều kiện trong thực vật.
1.3.2.2. Sự vận chuyển Polyamine
Thông thường, những tế bào có thể tổng hợp PA mà chúng cần. Thật vậy, những tế bào này được trang bị với hệ thống vận chuyển đặc hiệu để hấp thu PA ngoại sinh. Nó được biết đến như là những hệ thống vận chuyển riêng cho các PA khác nhau, hay chỉ một hệ thống vận chuyển riêng biệt có khả năng vận chuyển tất cả các phân tử PA. Ở thực vật bậc cao hơn, PA hấp thu ở cấp độ tế bào rất nhanh, đạt trạng thái bão hòa sau 1-2 phút và biểu lộ 2 pha hệ thống với 2 thành phần bão hòa cho Put. Sự vận chuyển PA là một cơ chế hoạt động mạnh được kích thích bởi auxin và PA hấp thu được bảo quản chủ yếu là trong nội bào [Bagni và Pistocchi, 1991]. Sự vận chuyển PA đến các cơ quan tế bào, sự vận chuyển gián tiếp dọc theo tonoplast được tìm thấy trong không bào, trong khi hoạt động vận chuyển đến khoảng matrix, phụ thuộc vào khả năng của màng được tìm thấy trong ti thể. Sự vận chuyển PA dọc theo plasma phụ thuộc vào năng lượng và canxi mà chúng cần trong cơ chế. Những xử lý hóa học mà nó đối kháng với phản ứng calmodulin hay ức chế hoạt động của protein kinase và phosphatase khử Ca2+- hấp thu Put hoạt động. Những kết quả này đề nghị những giả thuyết rằng canxi ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển trong suốt con đường truyền tín hiệu thứ cấp, gồm hoạt động protein kinasephophatase.
Vận chuyển đường dài có lẽ là một phần chức năng của hormone cần thiết. Do đó, xác định việc PA được chuyển chỗ trong thực vật là rất quan trọng. Những nghiên cứu trong sự vận chuyển PA đoạn đường dài không nhiều nhưng chúng có khả năng chứng tỏ sự tồn tại của sự chuyển chỗ không cực ở phạm vi thực vật. Kết
luận là có sự chuyển chỗ PA xuất hiện chính thông qua mạch xylem và nó phụ thuộc vào tỉ số thoát hơi nước [Bagni và Pistocchi, 1991].
1.3.2.3. Sự tiếp hợp Polyamine
Trong tự nhiên, PA xuất hiện như là phân tử tự do cơ bản nhưng thường được tiếp hợp thành những phân tử nhỏ như những acid phenolic và cũng thành những phân tử lớn khác nhau như protein [Tiburcio et al., 1997].
Những PA tiếp hợp nói chung kết nối đồng hóa trị thành acid hydroxycinnamic. PA được tiếp hợp bởi sự hình thành của liên kết amide, sử dụng este của CoA để cung cấp nhóm carboxyl hoạt động và sự liên kết này được xúc tác bởi một nhóm enzyme được biết đến như transferase. Những hợp chất này xuất hiện như là dạng cơ bản hay là dạng trung tính. Trong dạng cơ bản, nhóm amine tự do của amine aliphatic được liên kết với acid phenolic cinnamic. Trong dạng trung hòa, mỗi nhóm amine kết thúc của amine aliphatic được kết hợp thành acid cinnamic. Sự kết nối đồng hóa trị của PA thành protein sau quá trình phiên mã được xúc tác bởi một nhóm enzyme transglutaminase, chúng được định vị cả trong và ngoài tế bào. 1.3.2.4. Polyamine trong tương tác với các con đường sinh tổng hợp khác
Sự trao đổi chất PA được kết nối với một số đường nội tiết và trao đổi chất quan trọng có liên quan đến phát triển, phản ứng stress, đồng hóa nitơ và chuyển hóa hô hấp. Con đường trao đổi chất PA cũng được kết nối với các con đường trao đổi chất khác có liên quan đến sự hình thành các phân tử tín hiệu khác nhau và các chất chuyển hóa khác nhau trong đáp ứng stress ở thực vật. Theo đó, sự tổng hợp PA và ethylene thông qua một tiền chất chung là SAM – một tiền chất phổ biến cho sinh tổng hợp.PA và ethylene có hiệu quả đối kháng trong quá trình già lá và chín quả. Năm 2006, Yamasaki và Cohen cũng đã chứng minh sự sinh tổng hợp PA có ảnh hưởng tới sự hình thành NO. GABA – một sản phẩm của quá trình dị hóa PA được hình thành thông qua pyroline (xem sơ đồ Hình 1.4).
1.3.2.5. Các chất ức chế sinh tổng hợp Polyamine
Các chất ức chế sinh tổng hợp PA là các chất làm bất hoạt các enzyme sinh tổng hợp PA gồm: DL--diflouromethylarginine (DFMA) ức chế enzyme ADC; -
diflouromethylornithine (DFMO) ức chế ODC; methylglyoxal-bis- (guanylhydrazone) (MGBG) ức chế SAM; Dicyclohexylammonium sulphate (DCHA) hoặc Cyclohexylammonium phosphate (CHAP): ức chế enzyme spermidine synthase.
Khi bổ sung các chất trên vào môi trường nuôi cấy làm giảm hiệu quả của PA, gây ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát sinh hình thái thông qua tăng cường hoặc giảm bớt tác dụng của các chất khác. Ví dụ, xử lý với DFMA và DFMO làm tăng cường sản xuất ethylene ở một số thực vật; DFMO ức chế sự thành lập rễ từ đoạn cắt dưới lá mầm cây Euphorbia esula nhưng bổ sung IAA và 2,4-D có thể khắc phục điều này; DFMO ức chế sự tạo phôi trực tiếp từ lá mầm Solanum melongena cao hơn so với DFMA song điều này được khắc phục khi thêm Put vào môi trường nuôi cấy; MGBG ngăn chặn sự tạo rễ nhưng thúc đẩy sự tạo củ ở cây Solanum tuberosum (Bais và Ravishankar, 2002).
1.3.3. Polyamine đóng vai trò là chất điều hòa sinh trưởng
Các PA đã được quan tâm như là một lớp mới trong các chất điều hòa sinh trưởng và là tín hiệu hormone sơ cấp trong quá trình nhân lên và biệt hóa tế bào ở nhiều quá trình sinh lý thực vật [Kakkar et al., 2000; Bais và Ravishankar, 2002;
Jiménez, 2005]. Trong những năm đầu tiên sau khi nghiên cứu PA trong tế bào thực vật, một điều đáng chú ý về khả năng của chúng mang những hoạt động sinh trưởng cao ở những giai đoạn phát triển. Những tác động của PA ngoại sinh và nội sinh được nhận thấy rõ ở cấp độ thực vật tương đồng không làm ảnh hưởng đến tác động của phytohormone. Điều đáng chú ý là nó tác động gián tiếp và trực tiếp giữa PA và các phytohormone cảm ứng phát triển. Vì vậy, trong một vài thực vật, auxin, gibberellin và cytokinin kích thích sinh tổng hợp và gia tăng hàm lượng PA, ở đó PA ngoại sinh tác động đến các phytohormone nội sinh. Đối với Arabidopsis, IAA cảm ứng gene ACL5 ghi mã tổng hợp Spm nhưng ABA hay acid gibberelic có thể không cảm ứng gene này. Sự không hoạt động của gene này làm chậm trễ sự kéo dài thân và ức chế sự phân chia tế bào.
Theo sự hoạt động sinh hóa của chúng, PA có thể phân chia thành 2 nhóm: Put và Cad kích thích sự phân chia tế bào và hình thành rễ như những auxin và gibberellin, trong khi đó Spd và Spm điều hòa sự phân chia tế bào, hình thành các cơ quan và nhiễm sắc thể như những cytokinin. Nồng độ PA cao thường có mặt trong các mô sinh trưởng mạnh và trong giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi sinh dưỡng. Trong nuôi cấy tế bào cà rốt, PA được biến nạp với gene ODC cDNA và nồng độ Put được gia tăng trong không bào. Điều này cho phép PA được đưa vào sử dụng như auxin ở giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi trong tế bào sinh dưỡng cà rốt.
Sự thay đổi trong trao đổi PA ở giai đoạn phát sinh phôi sinh dưỡng được nghiên cứu trong nhiều hệ thống khác nhau ở thực vật. Đây là một hướng đi quan trọng trong sự tái sinh cây trồng và là hệ thống hiện đại, tiềm năng để nghiên cứu các sự kiện sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái in vitro [Yadav và Rajam, 1998]. Vì vậy những nghiên cứu gần đây, sự phân tích toàn diện hàm lượng của PA, hoạt động của những enzyme tổng hợp nên chúng, sự biểu hiện của gene điều hòa phiên mã được biểu diễn ở những giai đoạn khác nhau của sự phát sinh phôi sinh dưỡng ở Vitis vinifera: hình tim, hình cá đuối, phôi trưởng thành và tái sinh cây.
Hoạt động của ODC vượt quá ADC. Sự biểu hiện của gene ODC và SAMDC có liên quan đến hoạt động của những enzyme tương ứng với những cấp độ của Put và Spd ở giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi. Mối quan hệ không có mặt giữa hàm lượng PA tự do, hoạt động của enzyme để sinh tổng hợp và cấp độ biểu hiện gene ở giai đoạn sau của sự phát sinh phôi và tái sinh cây có thể mang lại kết quả hệ thống điều hòa tế bào.
Nghiên cứu gần đây chỉ ra vai trò quan trọng của PA ngoại sinh trong quá trình phát triển in vitro như quá trình phát sinh phôi vô tính. Tần xuất phát sinh phôi vô tính cũng có thể được điều chỉnh bởi nồng độ các PA đã được Kever và cộng sự (2000) chứng minh trên cây Panax ginseng. Đối với cây Araucaria angustifolia, sự thay đổi hàm lượng các PA cũng đã được tìm thấy trong các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi và ở mô hạt trong suốt quá trình phát triển của hạt [Astarita và
cộng sự 2003]. Trục phôi là cơ quan xuất hiện hàm lượng PA cao nhất gồm Put và Spm trong giai đoạn phôi sớm; trong khi nồng độ Spd cao và nồng độ Put giảm xuống khi lá mầm mọc ra.
1.4. SƠ LƯỢC VỀ CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA
ET GRUSHV.)
1.4.1. Phân loại và đặc điểm hình thái 1.4.1.1. Phân loại 1.4.1.1. Phân loại Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Apiales Họ : Araliaceae Chi : Panax
Loài : Panax vietnamensis Ha et Grushv.
Hình 1.5. Cây sâm Ngọc Linh(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) [Nguồn: http://samngoclinhtkh.com/]
1.4.1.2. Đặc điểm hình thái
Sâm Ngọc Linh trưởng thành có dạng thân khí sinh thẳng đứng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ với đường kính thân khoảng 4-8 cm, thường tàn lụi hàng năm. Phần thân rễ có đường kính 1-2 cm, mọc bò ngang như củ hoàng tinh trên hoặc dưới mặt đất khoảng 1-3 cm, mang nhiều rễ nhánh và củ. Các thân mang lá và tương ứng với mỗi thân mang lá là một đốt dài khoảng 0,5-0,7 cm. Cây chỉ có một lá duy nhất trong suốt từ năm thứ 1 đến năm thứ 3 và chỉ từ năm thứ 4 trở đi mới mọc thêm 2 đến 3 lá. Trên đỉnh của thân mang lá kép hình chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá. Cuống lá kép dài 6-12 mm, mang 5 lá chét, lá chét ở chính giữa lớn hơn cả với độ dài 12-15 cm, rộng 3-4 cm. Lá chét có phiến hình bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, lá có lông ở cả hai mặt. Cây 4-5 năm tuổi có hoa hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân, cuống tán hoa dài 10-20 cm có thể kèm 1-4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính. Mỗi tán có 60-100 hoa, cuống hoa ngắn 1-1,5 cm, lá đài, cánh hoa màu vàng nhạt, nhị, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy. Quả mọc tập trung ở