ỨNG DỤNG VIRUS SẢN XUẤT VACCINE

BỘ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CHƯƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC KC04/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ VECTOR ADENOVIRUS ĐỂ SẢN XUẤT VẮC-XIN CHO ĐỘNG VẬT TRÊN MƠ HÌNH GEN KHÁNG NGUN VP2 (VIRUS PROTEIN 2) PHÒNG BỆNH GUMBORO Mà SỐ: KC04.24/06-10 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Cơng nghệ sinh học Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Lê Thanh Hòa 8571 Hà Nội - 2010 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA DANH MỤC CÁC HÌNH CĨ TRONG BÁO CÁO DANH MỤC CÁC BẢNG CÓ TRONG BÁO CÁO 2.1 2.2 2.3 2.4 3.1 Phần thứ ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TĨM TẮT Q TRÌNH THỰC HIỆN Phần thứ hai TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI TỔ HỢPVÀ SỰ CẦN THIẾT NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Đánh giá công nghệ adenovirus tái tổ hợp 2.1.1 Adenovirus nghiên cứu phát triển làm vector tái tổ hợp 2.1.2 Tình hình nghiên cứu công nghệ adenovirus tái tổ hợp 2.1.3 Đánh giá công nghệ thiết kế adenovirus làm khung vector cho phát triển vacxin tái tổ hợp Nguyên liệu cho công nghệ thiết kế để tạo adenovirus tái tổ hợp làm vacxin 2.2.1 Plasmid chứa DNA hệ gen adenovirus vector 2.2.2 Plasmid thoi (shuttle plasmid) hay plasmid trung gian 2.2.3 Hệ thống tế bào vi khuẩn E coli để đồng nhiễm 2.2.4 Hệ thống tế bào động vật trợ giúp kiến tạo adenovirus tái tổ hợp Mô tả công nghệ adenovirus tái tổ hợp mà đề tài nghiên cứu 2.3.1 Đặt vấn đề 2.3.2 Đối với hệ thống Had5 2.3.3 Đối với hệ thống Fad9 Tình hình nghiên cứu vacxin phịng bệnh Gumboro ý nghĩa phát triển vacxin hệ adenovirus làm vector 2.4.1 Giới thiệu virus gây bệnh Gumboro 2.4.2 Vacxin truyền thống phòng bệnh Gumboro 2.4.3 Vacxin hệ phòng bệnh Gumboro 2.4.4 Gen kháng nguyên VP2 ứng dụng chiến lược tạo vacxin hệ phòng bệnh Gumboro 2.4.5 Ý nghĩa phát triển vacxin Gumboro hệ adenovirus làm vector Phần thứ ba NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ỨNG DỤNG THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGUYÊN LIỆU 3.1.1 Nguyên liệu gen VP2 3.1.2 Hệ thống plasmid adenovirus FAd9 plasmid trung gian 3.1.3 Hệ thống plasmid adenovirus HAd5 plasmid thoi 3.1.4 Hệ thống tế bào vi khuẩn E coli BJ5183 đặc biệt để gây đồng nhiễm ii Tr i v vii x 7 13 15 17 17 18 19 20 21 21 22 25 25 25 28 30 30 32 34 34 34 34 36 40 3.1.5 Hệ thống tế bào vi khuẩn E coli thông dụng khác để tách dịng 3.1.6 Các loại hóa chất, sinh phẩm, trang thiết bị phụ trợ khác 3.1.7 Giống virus tái tổ hợp nguyên gốc FAd9-VP2-L FAd9-VP2R 3.1.8 Virus vacxin sản xuất môi trường tế bào gan phơi gà 3.1.9 Các loại hóa chất, sinh phẩm, dụng cụ nuôi cấy tế bào thông dụng 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Phương pháp tiếp truyền virus Gumboro 3.2.2 Phương pháp tách chiết tinh RNA hệ gen virus Gumboro 3.2.3 Phương pháp RT-PCR tách dòng để lưu gen kháng nguyên VP2 Gumboro 3.2.4 Phương pháp giải trình tự xác định chuỗi gen kiểm tra kết 3.2.5 Phương pháp thiết kế mồi chuyên biệt đặc hiệu VP2 để thu nhận “hộp gen kháng nguyên VP2“ 3.2.6 Phương pháp tách dòng E coli tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp 3.2.7 Phương pháp thiết kế gài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào plasmid thoi 3.2.8 Phương pháp lưu giữ DNA plasmid hệ thống HAd5 E Coli 3.2.9 Phương pháp gây đồng nhiễm tái tổ hợp vi khuẩn BJ5183 3.2.10 Phương pháp chuẩn bị DNA plasmid adenovirus tái tổ hợp để lây nhiễm 3.2.11 Phương pháp lây nhiễm (transfection) để tạo adenovirus tái tổ hợp tế bào đặc thù 3.2.12 Phương pháp kiểm tra hoạt lực chọn lọc adenovirus tái tổ hợp 3.2.13 Phương pháp nuôi cấy tế bào gan phôi gà lớp 3.2.14 Phương pháp kiểm tra sinh học phân tử với giống vacxin FAd9-VP2 (L/R) phản ứng PCR 3.2.15 Phương pháp kiểm tra an tồn, vơ trùng, với giống vacxin FAd9-VP2 (L/R) phân bố virus quan 3.2.16 Phương pháp kiểm nghiệm miễn dịch với kháng thể Gumboro phản ứng trung hòa tế bào gan phôi gà 3.2.17 Phương pháp kiểm tra miễn dịch vacxin ELISA Phần thứ tư KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI TỔ HỢP ĐỐI VỚI HỆ THỐNG FAD9 GIA CÂM TÓM LƯỢC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ 4.1 ADENOVIRUS FAD9 GIA CẦM 4.2 KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ CHUẨN BỊ NGUỒN GEN VP2 4.2.1 Kết tiếp truyền giống virus Gumboro để cung cấp nguồn gen VP2 4.2.2 Kết phân lập tách dòng lưu giữ gen VP2 iii 40 40 41 42 42 43 43 43 43 44 45 46 46 47 48 48 49 50 54 56 57 58 60 63 63 65 65 66 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 5.1 5.2 THIẾT KẾ VÀ GÀI “HỘP GEN KHÁNG NGUYÊN VP2” (CMVKOZAK-VP2-PolyA) VÀO PLASMID TRUNG GIAN p∆L2.4 4.3.1 Thiết kế thu nhận “hộp gen kháng nguyên VP2“ (CMVKOZAK-VP2-PolyA) 4.3.2 Gài “hộp gen kháng nguyên VP2“ (CMV-KOZAK-VP2PolyA) vào plasmid trung gian p∆L2.4 4.3.3 Chuyển nạp chọn lọc plasmid trung gian p∆L2.4-VP2 KẾT QUẢ TẠO PLASMID ADENOVIRUS TÁI TỔ HỢP MANG GEN VP2 (pPacFAdV9-VP2) 4.4.1 Thiết kế plasmid vector FAd9 làm khung 4.4.2 Thu nhận lưu giữ DNA plasmid FAd9 (pF∆TR2-EGFP) kiểm tra chất lượng 4.4.3 Gây đồng nhiễm tạo adenovirus FAd9 tái tổ hợp mang gen VP2 KIỂM TRA KIỂM NGHIỆM GIỐNG VIRUS FAD9-VP2-L/R 4.5.1 Yêu cầu kiểm tra kiểm nghiệm 4.5.2 Đánh giá hoạt lực virus thông qua hủy hoại tế bào 4.5.3 Kết xác định PFU giống FAd9-VP2 (FAd9-VP2-L FAd9-VP2-R) 4.5.4 Kiểm nghiệm miễn dịch với kháng thể Gumboro phản ứng trung hòa 4.5.5 Kết kiểm tra giống FAd9-VP2-L FAd9-VP2-R sinh học phân tử 4.5.6 Kết kiểm tra phản ứng HA phát virus Newcastle NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GAN PHÔI GÀ SẢN XUẤT VÀ KIỂM TRA GIỐNG VÀ VACXIN FAd9-VP2-L VÀ FAd9-VP2-R 4.6.1 Kết thực công nghệ tế bào để sản xuất virus làm vacxin 4.6.2 Kết kiểm tra khả nuôi cấy virus giống FAd9-VP2 tế bào gan phôi gà 4.6.3 Kết sản xuất ~5.000 liều adenovirus tái tổ hợp tế bào gan phôi gà 4.6.4 Kết kiểm tra an tồn vơ trùng, hiệu lực phân bố virus quan gà đưa vacxin KIỂM TRA MIỄN DỊCH CỦA VACXIN FAD9-VP2-L VÀ FAD9VP2-R BẰNG ELISA 4.7.1 Bố trí thí nghiệm 4.7.2 Kết thử nghiệm adenovirus vacxin vào thể gà đường tiêu hóa (uống), hơ hấp (nhỏ mũi) tiêm (dưới da) 4.7.3 Tổng hợp đánh giá kết kiểm tra ELISA hai loại vacxin FAd9-VP2-R (vacxin R) FAd9-VP2-L (vacxin L) thử nghiệm Phần thứ năm KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI TỔ HỢP ĐỐI VỚI HỆ THỐNG HAD5 NGƯỜI BỐ TRÍ CÁC NỘI DUNG THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU VỚI HỆ THỐNG ADENOVIRUS HAD5 NGƯỜI KẾT QUẢ SẢN XUẤT LƯU GIỮ DNA PLASMID CHỨA HỆ iv 68 68 70 73 74 74 75 77 78 78 79 80 82 86 87 88 88 90 93 98 102 102 104 109 111 111 113 GEN ADENOVIRUS (HAD5) VÀ PLASMID CON THOI THIẾT KẾ VÀ GÀI “HỘP GEN KHÁNG NGUYÊN VP2” 5.3 (KOZAK-VP2) VÀO PLASMID CON THOI PSHUTTLE-CMV 5.3.1 Thiêt kế thu nhận “hộp gen VP2“ (KOZAK-VP2) 5.3.2 Gài „hộp gen kháng nguyên VP2“ vào plasmid pShuttle-CMV 5.3.3 Kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp pShuttle-CMV-VP2 KẾT QUẢ TẠO PLASMID ADENOVIRUS TÁI TỔ HỢP MANG 5.4 GEN VP2 (pAd-Shuttle-VP2) 5.4.1 Đặt vấn đề công đoạn gây đồng nhiễm 5.4.2 Kết thực “đồng nhiễm trực tiếp“ E coli BJ5183 5.4.3 Kết xây dựng phương pháp “đồng nhiễm kế tiếp” vào tế bào BJ5183 chứa sẵn pAdEasy1 5.4.4 Kết thực “đồng nhiễm kế tiếp“ DNA pShuttle-CMVVP2 vào tế bào khả biến BJ5183 mang sẵn vector pAdEasy1 5.4.5 Kiểm tra plasmid đồng nhiễm tái tổ hợp pAd-Shuttle-VP2 phương pháp cắt enzyme giới hạn (EcoRI; PmeI EcoRI; PacI) 5.4.6 Kết kiểm tra pAd-Shuttle-VP2 phương pháp sinh học phân tử giải trình tự 5.4.7 Kết luận chung kết tạo plasmid adenovirus HAd5-VP2 Phần thứ sáu KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Đánh giá chung đề tài Đề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO v 115 115 119 121 124 124 127 130 133 138 142 145 146 146 147 148 150 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA Ký hiệu Thuật từ/Cách dùng nghĩa tiếng Việt Tiếng Anh AGP ATCC Agar Gel Precipitation American Type Culture Collection bp CAR base pair coxsackie/adenovirus receptor CED CEF CEK CEL cDNA CMV CPE Da/kDa DMEM Chicken embryo dermal cells Chicken Embryo Fibroblast Cells Chicken Embryo Kidney Cells Chicken Embryo Liver Cells complementary DNA Cytomegalovirus Cytopathic Effect Dalton /Kilodalton Dulbecco's Modified Eagle's Medium Deoxyribonucleic acid Enhanced Green Fluorescent Protein Enzym Linked Immunosorbent Assay Fowl adenovirus type fetal bovine serum Human adenovirus type Human embryonic kidney cell Infectious Bursal Disease Infectious Bursal Disease Virus DNA EGFP ELISA FAd9 FBS HAd5 HEK293 IBD IBDV kb LB L-ITR LMH MTA OIE ORF PCR PFU Kilobase Luria-Bertani medium Light inverted tandem repeat Leghorn male hepatoma (avian hepatocellular carcinoma cell line) Material Transfer Agreement Office International des Epizooties (since 25 Jan, 1924); World Organisation for Animal Health (from May, 2003) Open Reading Frame Polymerase chain reaction plaque forming unit Phản ứng kết tủa khuếch tán thạch Tổ chức tế bào quốc tế (tạm dịch sử dụng) Cặp bazơ Thụ thể adenovirus với coxsackie virus Tế bào biểu bì phơi gà Tế bào xơ phôi gà Tế bào thận phôi gà Tế bào gan phơi gà DNA bổ sung Virus cytomegalo Bệnh tích tế bào Đơn vị tính trọng lượng phân tử protein Mơi trường nuôi cấy tế bào Axit Deoxyribonucleic Protein phát huỳnh quang xanh Phản ứng hấp phụ miễn dịch liên kết với enzyme Adenovirus type loài chim Huyết bê Adenovirus type người Tế bào thận bào thai người Bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm Virus gây viêm túi Fabricius truyền nhiễm 1000 cặp bazơ (1 kb = 1000 bp) Môi trường LB Cấu trúc lặp ngắn phía bên trái Dịng tế bào u gan gà phát triển từ gan gà trống Lơgo (Kawaguchi et al., 1987) Thỏa thuận chuyển giao vật tư sinh học Tổ chức Thú y quốc tế (hình thành 25/01/1924) ; từ ngày giữ tên lịch sử Khung đọc mở Phản ứng nhân gen/DNA Đơn vị khuẩn lạc hình thành áp dụng vi R-ITR RNA RT-PCR SPF TCID50 TR2 VN VP vvIBDV VP phương pháp ‘úp mặt thạch” Cấu trúc lặp ngắn phía bên phải Axit ribonucleic Phản ứng PCR ngược Siêu mầm bệnh Liều gây nhiễm 50% tế bào Cấu trúc lặp số (ở hệ gen FAd9) Phản ứng trung hòa virus Protein virus Virus gây viêm túi Fabricius truyền nhiễm thể độc lực cao Protein virus Right inverted tandem repeat Ribonucleic Acid Reverse transcription-PCR Special Pathogen Free tissue culture infectious dose Tandem repeats Virus Neutralization Viral protein Very virulent Infectious Bursal Disease Virus Viral protein vii DANH MỤC CÁC HÌNH CĨ TRONG BÁO CÁO Hình Nội dung Hình 1.1 Sơ đồ tóm tắt giai đoạn thực đề tài nghiên cứu cơng nghệ adenovirus vector tái tổ hợp mơ hình gen kháng nguyên VP2 hệ thống adenovirus FAd9 gia cầm hệ thống adenovirus HAd5 người Hình thái cấu tạo adenovirus A Ảnh kính hiển vi điện tử mơ tả hạt adenovirus có dạng hình khối xếp với tạo thành tập hợp B Mơ hình cấu trúc khơng gian hạt virion adenovirus Mơ hình cấu tạo hạt virion adenovirus (cắt phẳng) với DNA hệ gen 13 loại protein biết Xâm nhiễm adenovirus vào tế bào thông qua thụ thể CAR αintegrin (mũi tên dẫn), dẫn vào endosome chuyển vận đến nhân để thực chu trình tái tạo virus Công nghệ tạo vector adenovirus tái tổ hợp chứa gen kháng nguyên VP2, sử dụng hệ thống AdEasy™ Adenoviral Vector System (Stratagene Inc.) Sơ đồ minh họa phân đoạn A B hệ gen virus Gumboro Hệ thống gen FAdV-9 (FAd9) thiết kế tạo thành plasmid pPacFAdV-9, nhiễm tế bào Hepatoma (CH-SAH) để tạo nên virus FAdV-9 (virus tự nhiên, hoang dã, wildtype) Hệ thống gen FAdV-9 (FAd9) thiết kế tạo thành plasmid pPacFAdV-9, cài “hộp gen EGFP” vào vị trí TR2 để tạo thành plasmid pF∆TR2-EGFP làm “vector mở” (open vector) Kiểm tra cách lây nhiễm vào tế bào Hepatoma để tạo virus FAdV-9 thị huỳnh quang, dễ phát Sơ đồ cấu trúc plasmid khung pAdEasy-1 mua hãng Stratagene (Stratagene Inc.) Sơ đồ cấu trúc plasmid thoi pShuttle-CMV vùng đa nối MCS tiếp nhận DNA ngoại lai (Stratagene) Tế bào HEK293 (A): Nuôi cấy thành lớp sau 72 h (đạt >90% phủ đáy); (B): nhuộm huỳnh quang (Nguồn: http://hek293.com/); (C): Nuôi cấy mọc thành lớp sau 48 h, (Đề tài KC04.24/06-10), thực Sơ đồ minh họa giai đoạn thực đề tài (I - VIII), nội dung nghiên cứu công nghệ adenovirus FAd9 gia cầm Bệnh tích điển hình túi Fabricius (sưng to) (xuất huyết) gà tiếp truyền Kết điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen kháng nguyên VP2 chủng đại diện (A) kiểm tra kết cắt DNA plasmid tái tổ hợp enzyme EcoRI (B) Trình bày chuỗi nucleotide amino acid suy diễn gen VP2 thu nhận từ chủng GKN-T1ST Sơ đồ minh họa trình lắp ghép gen VP2 thành phần phụ trợ khác (hộp gen CMV-Kozak-VP2-PolyA) vào plasmid trung gian p∆L2.4 hệ thống FAd9 adenovirus gia cầm Sơ đồ bố trí vị trí cài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào vùng cấu trúc lặp TR2, mà trước TR2 thiết kế thay EGFP (Enhanced Green Fluorecence Protein) bắt màu huỳnh quang Kết sàng lọc DNA VP2 cài vào plasmid p∆L2.4 (A) kiểm Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 2.4 Hình 2.5 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 4.1 Hình 4.2 Hình 4.3 Hình 4.4 Hình 4.5 Hình 4.6 Hình 4.7 viii Tr 10 10 11 23 26 35 36 37 38 39 64 66 67 67 71 72 tra clone tái tổ hợp phản ứng PCR với cặp mồi CMV-up Primer PolyA-dn Primer (B) Hình 4.8 Hệ gen FAdV-9 (FAd9) thiết kế tạo thành plasmid pPacFAdV-9, cài “hộp gen VP2” vào vị trí TR2 tạo thành plasmid pF∆TR2-VP2 (quay trái) pF∆TR2-VP2inv (quay phải), lây nhiễm tế bào Hepatoma tạo giống nguyên gốc FAd9-VP2-L FAd9VP2-R (thực Canada); chuyển giao giống nguyên gốc cho Viện Công nghệ sinh học, lây nhiễm tế bào gan phôi gà (CEL) tiếp truyền giống gốc tạo giống cấp để sản xuất vacxin FAd9-VP2-L FAd9-VP2-R (thực Việt Nam) Hình 4.9 Tế bào lớp (monolayer): A Không gây nhiễm (đối chứng); B Gây nhiễm virus FAd9-VP2 (nồng độ 10-3) có CPE sau 72 Hình 4.10 Tế bào Hepatoma nhiễm nồng độ virus gây nhiễm 10-6 FAd9VP2-L có số lượng plaque nhiều (xem tươi, khơng nhuộm đỏ trung tính) Hình 4.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm trung hịa chai tế bào nuôi cấy gan phôi gà lớp Hình 4.12 Hình ảnh tế bào gan phơi gà lớp quan sát thí nghiệm trung hịa virus FAd9-VP2-L với kháng thể kháng VP2 virus Gumboro Kết điện di gen VP2 sử dụng cặp mồi E1F-E1R (~ 1,35kb) Hình 4.13: Kết kiểm tra hiệu giá HA Hình 4.14: Hình 4.15 Đánh giá kết ni cấy tế bào gan phôi gà sau 24 h 48 h; tế bào mọc thành lớp mịn mơi trường DMEM/FBS Hình 4.16 Đánh giá CPE kết nuôi cấy giống FAd9-VP2-L (FADVAC-L) FAd9-VP2-R (FADVAC-R) tế bào gan phôi gà sau 72 h để chọn giống Hình 4.17 Đánh giá CPE để xác định thời điểm thu hoạch virus FAd9-VP2-L (FADVAC-L) tế bào gan phôi gà sau 48 h, 72 h, 96 h 144 h; có bố trí đối chứng Hình 4.18 Tế bào gan phôi gà (CEL) lúc 48 h lớp (đều, mịn, môi trường DMEM/FBS) để chuẩn bị cấy giống virus vacxin FAd9-VP2L/R; tế bào đối chứng theo dõi lúc 72h tế bào đối chứng lúc 144h để so sánh với tế bào cấy giống sản xuất vacxin Hình 4.19 Kiểm tra thường xuyên hàng ngày chai tế bào gan phôi gà trước cấy giống virus chai ni cấy virus đối chứng Hình 4.20 Sự hủy hoại tế bào (CPE) chai (1, 2, 3) nuôi cấy giống virus vacxin FAd9-VP2-L tế bào gan phôi gà thời điểm 72h sau gây nhiễm, để thu hoạch vacxin Hình 4.21 Kết điện di kiểm tra vùng “siêu biến đổi” gen VP2 (474 bp) thu nhận từ mẫu Hình 4.22 Kết giải trình tự kiểm tra chuỗi gen vùng “siêu biến đổi” (474 bp) gen VP2 thu nhận từ mẫu lách tách dịng plasmid pCR2.1 Hình 5.1 Sơ đồ minh họa giai đoạn thực đề tài (I - IV), thuộc nội dung nghiên cứu công nghệ adenovirus HAd5 người Kiểm tra thạch agarose 1%, DNA plasmid vector thoi Hình 5.2 pShuttle-CMV sau cắt mở vòng EcoRI clone 1, 2, 3, có kích thước 7,5 kb Hình 5.3 Điện di sản phẩm PCR thu nhận “hộp gen kháng nguyên VP2” (độ dài khoảng 1,38 kb) cặp mồi GKPKZR-GV2R ix 73 76 79 80 83 84 86 88 90 93 93 94 95 96 101 101 112 115 117 Hình 5.4 Hình 5.5 Hình 5.6 Hình 5.7 Hình 5.8 Hình 5.9 Hình 5.10 Hình 5.11 Hình 5.12 Hình 5.13 Hình 5.14 Hình 5.15 Hình 5.16 Hình 5.17 Điện di kiểm tra DNA vector tái tổ hợp pShuttle-CMV-VP2 cắt EcoRI ĐC+: DNA pShuttle-CMV (độ dài 7,5 kb) làm đối chứng Điện di kiểm tra sản phẩm vector pShuttle-CMV-VP2 chủng GKN-T1ST, GKN-G202 GQG-52-70 Trình tự nucleotide đầu 5’ 3’ chromatogram giải trình tự clone đại diện plasmid thoi pShuttle-CMV-VP2 Minh họa trình gây đồng nhiễm E coli 5183 DNA plasmid thoi pShuttle-CMV-VP2 (cắt PmeI) (1) với DNA plasmid adenovirus vector pAdEasy-1 (2), để tạo nên plasmid adenovirus tái tổ hợp pAd-Shuttle-VP2 (3), chứa thành phần: vùng mầm ori plasmid thoi gen kháng kháng sinh kanamycin (mũi tên); hộp gen kháng nguyên VP2; khung adenovirus HAd5 Vùng mầm ori gen kháng kháng sinh ampicillin plasmid pAdEasy-1 bị loại bỏ trình đồng nhiễm Kiểm tra đoạn DNA pShuttle-CMV-VP2 sau cắt mở vòng enzyme PmeI Điện di kiểm tra khả hiệu đồng nhiễm tạo vector adenovirus tái tổ hợp Điện di kiểm tra sản phẩm DNA clone BJ5183 chuyển nạp DNA plasmid pAdEasy-1 Điện di kiểm tra DNA tách từ tế bào khả biến BJ5183 mang vector pAdEasy1 sau gây ”đồng nhiễm kế tiếp” với DNA pShuttleCMV-VP2 xác định clone dương tính Điện di kiểm tra chuyển nạp chọn lọc khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp pAd-Shuttle-VP2 sàng lọc phân lập với khuẩn lạc khác Kết điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp pAd-Shuttle-VP2 cắt enzyme EcoRI Kết điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp pAd-Shuttle-VP2 (clone 1/1; 4/2 5/1) cắt hai enzyme EcoRI PmeI Điện di kiểm tra kết DNA pAd-Shuttle-VP2(1/1) pAdShuttle-VP2(5/1) cắt PacI Kết điện di sản phẩm PCR thực để kiểm tra adenovirus tái tổ hợp pAd-Shuttle-VP2(1/1); pAd-Shuttle-VP2(4/2) pAd-ShuttleVP2(5/1), với cặp mồi đặc hiệu SHUTF-ADER (~2,6 kb) GKPKZF-GV2R (~1,35 kb) Kết giải trình tự kiểm tra sản phẩm PCR thu nhận vùng giao pShuttle-CMV pAdEasy1 pAd-Shuttle-VP2(1/1) chứa hộp gen VP2 x 120 122 123 126 128 130 132 136 137 139 140 141 143 144 ... gốc/giống cấp sản xuất vacxin; Giống virus HAd5-VP2 thực tế bào HEK293 để tạo giữ giống nguyên gốc, sử dụng dòng tế bào để sản xuất virus làm vacxin vii) Các công nghệ tế bào sản xuất kiểm tra... mang gen VP2 V (FAd9-VP2-L/R) Sản xuất adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2 VI (FAd9-VP2-L R) Công nghệ tế bào CEL sản xuất kiểm tra giống vacxin (HAd5-VP2) Sản xuất adenovirus tái tổ hợp mang gen... Kết thực công nghệ tế bào để sản xuất virus làm vacxin 4.6.2 Kết kiểm tra khả nuôi cấy virus giống FAd9-VP2 tế bào gan phôi gà 4.6.3 Kết sản xuất ~5.000 liều adenovirus tái tổ hợp tế bào gan phôi