Nghiên cứu thích ứng chủng virut cúm mùa trên các dòng tế bào khác nhau

Nghiên cứu thích ứng chủng virut cúm mùa trên các dòng tế bào khác nhau

đ-có nguy cơ cao , nh ngời cao tuổi và ngời ốm mạn tính Mặc dù khó đ-có thể đánh giá

đầy đủ, nhng các số liệu thống kê cho thấy những dịch Cúm này gây ra từ 3 đến 5 triệu ca bệnh và khoảng 250.000 đến 500.000 ca tử vong mỗi năm trên toàn cầu Nguy cơ mắc bệnh nặng và tử vong cao nhất trong số các bệnh nhân lớn hơn 65 tuổi, trẻ nhỏ dới 2 tuổi, và những ngời có nguy cơ mắc thêm các biến chứng từ Cúm Theo số liệu của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và dự phòng (The Center for Disease Control and Prevention - CDC, Atlanta, Mỹ) mỗi năm ở Mỹ có hơn 200.000 ca nhập viện vì biến chứng của Cúm và 36.000 trờng hợp chết Bệnh Cúm lan rộng nhanh chóng trên toàn thế giới trong những mùa dịch và gây ra gánh nặng đáng kể cho kinh tế và y học

Biện pháp phòng chống hữu hiệu nhất đối với dịch Cúm là tiêm phòng vắc xin Vắc xin Cúm có hiệu quả bảo vệ 70-90% trên ngời trẻ tuổi mạnh khỏe nếu kháng nguyên vắc xin phù hợp với chủng virút Cúm đang lu hành

Dựa trên thông tin thu thập đợc từ mạng lới giám sát bệnh Cúm toàn cầu của WHO, hàng năm WHO đa ra khuyến cáo thành phần kháng nguyên của vắc xin tập trung vào 3 chủng phổ biến nhất đang lu hành Hiện tại các virút Cúm đang lu hành gây bệnh cho ngời đợc phân chia thành hai nhóm A và B Cúm A có 2 phân týp quan trọng nhất đối với ngời là A/H3N2 và A/H1N1, liên quan đến những đại dịch có số ngời tử vong nhiều nhất

Hiện nay, tất cả các nhà sản xuất vắc xin Cúm trên thế giới đã và đang sử dụng công nghệ truyền thống là sản xuất trên trứng gà có phôi không mang các tác nhân gây bệnh đặc hiệu Tuy nhiên, đây là một hệ thống cồng kềnh với nhiều điểm bất lợi

nh: chi phí cao, có thể lẫn các tạp chất gây dị ứng Virút Cúm ngời sinh trởng trên trứng có thể dẫn đến sự chọn lọc những biến đổi trong các kháng nguyên đặc hiệu từ chủng virút gốc (14) và nguồn cung cấp trứng không đảm bảo đợc thời gian, ảnh h-ởng đến tính sẵn sàng cho việc đối phó với bệnh dịch (29).

Việc nuôi cấy virút Cúm trên tế bào là rất khả thi trong việc sản xuất vắc xin với những lợi thế so với trên trứng gà có phôi nh: cho năng suất cao và sạch do không lẫn những tạp chất nh trên trứng, virút nhân lên trên tế bào vẫn giữ đặc tính kháng nguyên nh ở chủng virút gốc

Xuất phát từ thực tế đó, nhằm nghiên cứu sản xuất vắc xin Cúm mùa bất hoạt có hiệu lực cao với giá thành hạ, chúng tôi tiến hành đề tài:

"Nghiên cứu thích ứng chủng virút Cúm mùa trên các dòng tế bào khác nhau"

Đề tài đợc thực hiện nhằm 2 mục tiêu:

1 Đánh giá khả năng thích ứng của 3 chủng virút Cúm mùa H1N1, H3N2 và B trên các dòng tế bào thận khỉ tiên phát (PMKc), thận khỉ xanh châu Phi thờng trực (Vero) và thận chó Madin-Darby thờng trực (MDCK)

2 Nghiên cứu cấy truyền các chủng virút Cúm mùa trên dòng tế bào thích hợp nhằm nâng cao hiệu giá

Chơng 1 TổNG QUAN

1.1 Virút Cúm

Năm 1931, Shope và cộng sự đã lần đầu tiên phân lập đợc virút Cúm từ lợn bị nhiễm bệnh

Hình 1 Hình ảnh virút Cúm A dới kính hiển vi điện tử truyền qua Nguồn: Public

Health Image Library (CDC), ID: #8160 Độ phóng đại 100.000 lần

1.1.1 Lịch sử

Năm 1918, dịch Cúm Tây Ban Nha đã làm tử vong 50 triệu ngời, do virút phân nhóm H1N1 gây ra, thờng đợc coi là chủng gây Cúm lợn nhng có khả năng truyền nhiễm.

Năm 1957 và 1958, H2N2 gây nên dịch Cúm châu á vào đã làm chết khoảng 1 triệu ngời trên thế giới

Năm 1968, 1969 H3N2 phát triển từ chủng H2N2 do biến đổi di truyền và gây nên dịch Cúm Hồng Kông đã gây tử vong 750,000 ngời Đây là đại dịch gây tử vong lớn nhất thế kỷ 20

Năm 2002, với sự bùng phát phân nhóm H7N2 trong gia cầm, 44 ngời đã đợc phát hiện là bị nhiễm virút tại bang Virginia, Mỹ

Tháng 2 năm 2004, ở Bắc Mỹ, ngời ta đã phát hiện chủng virút Cúm gà H7N3 tại một số trang trại gia cầm tại British Columbia

Năm 2003 ở Hà Lan, 89 ngời đã đợc chẩn đoán là nhiễm virút Cúm H7N7 sau một đợt dịch Cúm gia cầm từ một số trang trại lân cận Một trờng hợp đã tử vong.Năm 2005, có 3 trờng hợp phát hiện nhiễm H9N2 ở Trung Quốc và Hồng Kông cho thấy bị nhiễm virút và tất cả đều đã qua khỏi Loại virút này đã đợc nghiên cứu cho thấy chỉ là dạng "gây nhiễm thấp"

Từ năm 1997, sự bùng phát của virút H5N1 đã làm nhiễm bệnh và chết hàng chục triệu gia cầm H5N1 đợc coi là tâm điểm của sự chú ý và cảnh báo rằng một biến chủng từ phân nhóm H5N1 có thể tự biến đổi (hoặc tái tổ hợp) để tạo thành một chủng virút có khả năng gây đại dịch Cúm toàn cầu

1.1.2 Tình hình hiện nay

Từ tháng 2 đến tháng 9 - 2008, hoạt động của virút Cúm đợc báo cáo ở châu Phi, châu Mỹ, châu á, châu Âu và châu Đại Dơng Nhìn chung, virút Cúm hoạt động ở mức vừa phải (42)

ở phía Bắc bán cầu, virút Cúm tiếp tục lu hành và gây ra những vụ bùng phát dịch ở châu á, châu Âu và Bắc Mỹ Hoạt động của virút Cúm giảm xuống trong

tháng 3 ở châu Âu và tháng 4 ở châu á và Bắc Mỹ Virút Cúm A/H1N1 lu hành rộng rãi và chiếm u thế ở nhiều quốc gia Virút Cúm A/H3N2 chiếm u thế ở Mỹ và

lu hành ít hơn ở châu á và Đông Âu Virút Cúm B lu hành đồng thời và có những vụ bùng phát ở một vài nớc

ở phía Nam bán cầu, hoạt động của virút Cúm bắt đầu vào tháng 3 và tăng lên trong tháng 4 ở Bắc Mỹ, trong khi ở châu Phi và châu Đại Dơng, hoạt động bắt đầu trong tháng 5 và tăng lên ở tháng 6 Nhìn chung, hoạt động giảm xuống trong tháng

8 ngoại trừ ở Australia, Braxin và New Zealand ở châu Phi, virút Cúm A/H1N1 chiếm u thế và gây ra những vụ bùng phát ở Nam Mỹ, virút Cúm A/H1N1 và virút Cúm B cùng lu hành và liên quan đến những vụ dịch ở châu Đại Dơng, có báo cáo

về những vụ bùng phát do virút Cúm A/H3N2 và Cúm B cùng lu hành gây ra

Sau 3 năm nghiên cứu về dịch tễ bệnh Cúm tại Hà Nội, từ năm 2001 đến 2003, các nhà khoa học đã thu thập tổng cộng 4078 mẫu dịch tụy hầu (nasopharyngeal swab) từ bệnh nhân ốm giống Cúm (ILI) trớc khi dịch Cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát (10) Bằng cách phân lập virút Cúm, đã phát hiện 119 mẫu (2,5%) dơng tính Virút Cúm đợc phát hiện thấy ở hầu hết các tháng trong năm với đỉnh là vào tháng 6

đến tháng 8 trong suốt mùa ma, một đỉnh khác rơi vào tháng 12 đến tháng 1 trong suốt mùa đông ở Hà Nội Virút Cúm B chiếm u thế trong năm 2001, tiếp theo là Cúm A/H3N2 trong năm 2002, và trong năm 2003, cả 3 phân nhóm Cúm A/H3N2, A/H1N1 và B cùng lu hành Không có trờng hợp nào nhiễm virút Cúm A/H5N1 trong các mẫu bệnh phẩm này

Theo kết quả của sự giám sát các bệnh truyền nhiễm quốc gia thực hiện bởi Bộ Y

tế Việt Nam, trong giai đoạn 2001-2003, trung bình số trờng hợp mắc bệnh mỗi năm trên toàn quốc là 2054,2/100.000 dân và là bệnh đợc xếp hạng cao nhất trong 24 bệnh truyền nhiễm Mỗi vùng có tính mùa và số ca ILI khác nhau Miền Bắc có 2725,8 ca/100.000 dân mỗi năm, và thể hiện tính mùa với đỉnh cao từ tháng 5 đến tháng 9 Trung bình số ca ILI cao nhất ở vùng núi Tây Bắc với 3670,6 ca/100.000 dân với mức đỉnh ở tháng 8 và tháng 9 Miền Trung và miền Nam không thể hiện tính mùa rõ ràng, và các ca ILI cũng thấp hơn các vùng khác

Cũng nh những báo cáo trớc đây ở quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới ở châu á

nh Thái Lan, Indonesia, Myanma, Singapo và một phần miền nam của Trung Quốc gồm cả Đài Loan (9, 19), những kết quả này chỉ ra rằng virút Cúm lu hành trong cả năm ở Hà Nội với 2 đỉnh cao, một trong mùa ma và một trong mùa đông lạnh

Tuy nhiên, thông tin từ những khu vực này vẫn còn hạn chế, có thể do thiếu những mạng lới giám sát Cúm quốc gia, phơng tiện và nhân viên có đủ kỹ năng trong các phòng thí nghiệm và nguồn tài chính cần thiết (31)

Theo các báo cáo của WHO và các trung tâm hợp tác về sự hoạt động của virút Cúm, những týp/phân týp chiếm u thế ở Đông Nam á và châu Đại Dơng là sự trộn lẫn của A/H1N1, H3N2 và B trong suốt năm 2001 và 2002, đến năm 2003 thì Cúm A/H3N2 chiếm u thế (38-40) Trong nghiên cứu này, những týp/phân týp virút Cúm

lu hành ở Hà Nội qua thời gian 3 năm có sự khác nhau ít hơn so với ở các khu vực xung quanh ở châu á, song những đặc tính kháng nguyên là tơng tự (38-41) Kết quả thu thập đợc cho phép nhóm tác giả kết luận rằng những chủng virút ở Hà Nội khá phù hợp với những chủng vắc xin toàn cầu

1.1.3 Phân loại

Các virút Cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, là những chủng virút có hệ gen dạng

sợi đơn ARN (-) gồm 8 phân đoạn lần lợt mã hóa cho 8 loại protein khác nhau của virút (Cúm A, B) Họ Orthomyxoviridae gồm 4 giống: Virút Cúm A, virút Cúm B,

virút Cúm C và Thogovirút Virút Cúm B và C thờng chỉ gây nhiễm cho ngời trong khi phần lớn virút Cúm A gây nhiễm trên gia cầm và chỉ có một vài phân týp gây nhiễm cho ngời và các động vật khác nh lợn, ngựa Virút Cúm A, B và C khác nhau

về tính kháng nguyên của nucleocapsit và neuramidaza glycoprotein

Virút Cúm A đợc chia các phân týp dựa trên tính kháng nguyên của các phân tử

HA và NA của chúng Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra 16 loại HA (H1-H16)

và 9 loại NA (N1-N9) Gia cầm thủy sinh là ổ chứa tự nhiên của tất cả các loại virút Cúm

Chủng virút Cúm đợc đặt tên theo nguồn gốc phân lập, vùng địa lý phân lập, số chủng, năm phân lập Từ năm 1983 đến nay, không có thêm phân týp mới nào đợc phát hiện, điều này cho thấy có một số giới hạn về sự biến chủng của virút Cúm A.

1.1.4 Hình thái và cấu trúc của virút Cúm

Virút Cúm A và B có cấu trúc giống nhau trong khi virút Cúm C có cấu trúc khác biệt với các gai glycoprotein sắp xếp theo hình 6 cạnh Virút Cúm A và B nuôi cấy trên tế bào hoặc trứng có hình dạng thông thờng đờng kính 80-120nm Ngợc lại, virút Cúm phân lập từ ngời và động vật sau đó đợc cấy truyền một lần trên tế bào th-ờng có hình thái khác biệt và đa dạng Hình thái virút Cúm A là một kiểu gen riêng biệt nhng phụ thuộc rất nhiều vào loại tế bào chủ khi virút nhân lên

Đặc điểm hình thái nổi bật của virút Cúm A là lớp bao gồm 500 gai (10-14nm) xòe ra phía ngoài lớp lipit Có 2 loại gai khác nhau: gai hình gậy là kháng nguyên

HA và gai hình nấm là kháng nguyên NA Tỷ lệ HA:NA thờng dao động nhng thông thờng từ 4:1 đến 5:1 Protein matrix M1 đợc cho là nằm dới lớp lipit kép và liên kết với Ribonucleoprotein (RNP) lõi của virút M1 là protein có nhiều nhất trong virion

Hình 2 Virion của virút Cúm A và các protein Nguồn: www.influenzareport.com

Bằng phơng pháp cắt lớp mỏng tiêu bản có các hạt virút hoặc phá vỡ hạt, cấu trúc RNP có thể đợc chia thành nhiều lớp có kích thớc khác nhau và chứa 8 đoạn gen của ARN đơn.

Các RNP có chứa 4 loại protein và ARN NP là protein tiểu đơn vị nổi trội của nucleocapsit và bao quanh ARN, có khoảng 20 nucleotit trong 1 tiểu đơn vị NP Liên kết với RNP là phức hợp ARN polymeraza phụ thuộc - ARN bao gồm 3 polymeraza protein PB1, PB2, PA và chỉ có mặt từ 20-30 bản sao trong một virion.Thành phần của các virút trong họ Orthomyxoviridae bao gồm 1% ARN, 70%

protein, 20% lipit và 5 đến 8% carbonhydrat

Axit nucleic và protein

Virút Cúm chứa 7 đến 8 đoạn ARN sợi đơn, âm Tổng chiều dài genom là 12000-15000 nucleotit, đoạn lớn nhất dài 2300-2500 nucleotit, nhỏ nhất là 800-900 nucleotit Trình tự genome có các trình tự lặp tận cùng, ở cả hai đầu Các trình tự lặp

ở đầu 5’ dài 12-13 nucleotit Trình tự nucleotit của đầu 3’ giống hệt đầu 5’ ở hầu hết các đoạn ARN và nh nhau trong cùng một giống của cùng một họ Những trình tự lặp lại dài 9-11 nucleotit

Othomyxoviridae đợc xem là rất dễ bị ảnh hởng bởi độ pH trong acid Độ pH

thấp tạo ra sự thích nghi và sự thay đổi kháng nguyên trong protein HA, cho phép liên kết với màng của các tế bào ký sinh

ở pH 2, nhiệt độ 56OC và trong dung dịch 70% etanol hoặc một chất tẩy đặc hiệu, hoạt tính của virút Cúm bị bất hoạt trong thời gian dới 30 phút (20)

1.1.6 Các loại kháng nguyên

1.1.6.1 HA

Tên gọi của protein HA (hemagglutinin) xuất phát từ khả năng ngng kết hồng cầu của virút bằng cách gắn với các thụ thể đặc biệt có chứa axit sialic HA có vai trò quan trọng trong quá trình sao chép virút Đầu tiên HA gắn với thụ thể có chứa axit sialic trên bề mặt tế bào và tạo thành sự gắn kết giữa virút và tế bào Tiếp đó

HA chịu trách nhiệm cho sự xâm nhập của virút vào tế bào bằng cách gián tiếp tạo nên sự hòa màng endocytosed của virút và màng nội bào làm cho nucleocapsit virút giải phóng vào trong bào tơng

HA là kháng nguyên chính của virút Cúm, bao gồm các vị trí kháng nguyên là

A, B (mang vị trí gắn thụ thể), C, D và E Các vị trí này nằm ở phần đầu phân tử HA, trong khi phần cuối đợc gắn vào trong lớp lipid

Khi bị nhiễm virút Cúm, cơ thể đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên HA bằng cách sinh ra các kháng thể trung hòa Những thay đổi ở các vị trí kháng nguyên làm giảm hay ức chế sự gắn kết của các kháng thể trung hòa, do đó cho phép một phân týp mới lan rộng trong quần thể không có khả năng miễn dịch Hiện tợng này gọi là

đột biến kháng nguyên chậm (antigenic drift) Đột biến kháng nguyên nhanh (antigenic shift) xuất hiện khi HA bị thay đổi trong một virút, chẳng hạn H1 thay thế bởi H5 dẫn tới sự hình thành một chủng virút Cúm mới Điều này có thể xảy ra khi một tế bào nhiễm bởi 2 chủng virút Cúm khác nhau và trao đổi các đoạn genome của chúng trong quá trình nhân lên

Nh vậy HA là kháng nguyên chính tạo nên kháng thể trung hòa và các vụ dịch Cúm đều liên quan đến thay đổi cấu trúc kháng nguyên

1.1.6.2 NP

NP là protein cấu trúc chính phối hợp với các đoạn ARN tạo thành RNP NP còn

là kháng nguyên đặc hiệu týp, khác nhau giữa virút Cúm A, B và C

Mặc dù là một protein đặc hiệu týp nhng NP của virút Cúm A vẫn biểu hiện sự biến đổi kháng nguyên NP có ít nhất 3 vùng liên kết kháng thể không chồng lên nhau, một trong số này có tính bảo thủ cao Kháng thể đơn dòng gắn vào vị trí này gây ức chế phiên mã ARN virút trong phòng thí nghiệm NP có một vài quyết định kháng nguyên đặc hiệu tế bào T đợc bảo tồn trong số các virút Cúm A ở ngời

1.1.6.3 NA

NA là glycoprotein thứ hai đặc hiệu cho phân týp của virút Cúm A, B NA do

đoạn gen ARN thứ 6 mã hóa và là một homotetramer NA quan trọng do hoạt tính sinh học loại bỏ axit sialic từ glycoprotein NA có thể cho phép vận chuyển virút qua màng mucin ở trên đờng hô hấp, giúp hỗ trợ virút tấn công tế bào biểu mô đích

NA của virút Cúm A có 4 vị trí kháng nguyên, mỗi vị trí bao gồm nhiều quyết

định kháng nguyên (epitop) Những cấu trúc kháng nguyên của N9 NA đợc nghiên cứu nhiều nhất Phân tích cấu trúc của phức hợp N9 NA từ chủng A/tern/Australia/G75 với mảnh Fab của kháng thể đơn dòng NC41 (34) cho thấy rằng kháng thể tiếp xúc NA qua một bề mặt có diện tích 900Ǻ2, bao gồm 19 axit amin nằm trên 5 vòng polypeptit bao quanh vị trí hoạt động của enzym Trong số này, chỉ có một vài axit amin cung cấp những điểm tiếp xúc quyết định cần cho sự nhận diện của kháng thể (24) Trong sự lây nhiễm tự nhiên, miễn dịch đối với NA chỉ có vai trò không đáng kể bảo vệ con ngời khỏi nhiễm Cúm Có thể lấy ví dụ minh họa từ đại dịch 1968, khi đó tác nhân gây bệnh có NA từ một virút Cúm ngời

lu hành trớc đó, sự miễn dịch đối với NA đã không thể ngăn con ngời khỏi đại dịch Cúm

Ngoài các kháng nguyên chủ yếu trên, virút Cúm còn có các kháng nguyên protein polymeraza (PB1, PB2, PA), M1, M2, NS1 và NS2 đợc nhận diện bởi các tế bào T trong cơ thể ngời nhiễm virút Cúm

1.1.7 Sự tái tổ hợp của virút Cúm

Virút Cúm A, B, C có thể tái tổ hợp trong tự nhiên giữa các thành viên cùng týp nhng không xảy ra giữa các týp khác nhau Sự xuất hiện của chủng đại dịch là hậu quả của việc tái tổ hợp tạo ra chủng phân týp mới có NA hoặc HA khác hẳn với chủng lu hành trớc đó

Virút Cúm B khác với virút Cúm A là không có ổ chứa động vật Mặc dù virút Cúm B nguyên thủy thích ứng trên ngời dễ dàng hơn virút Cúm A nhng tỷ lệ đột biến và thay đổi chỉ bằng một nửa virút Cúm A (43)

Có nhiều bằng chúng cho rằng virút Cúm trong loài thủy cầm lây truyền cho lợn, ngựa, gia cầm và động vật có vú ở biển; gây nên những vụ dịch nghiêm trọng (36)

Virút Cúm gia cầm không lan truyền trên quần thể ngời và ngợc lại, virút của ngời không lây truyền sang quần thể chim, điều này cho thấy hàng rào giữa chim và ngời rất chặt chẽ Tuy nhiên, nhiều bằng chứng cho thấy loài lợn có thể cảm nhiễm

dễ dàng với cả hai loại virút Cúm ngời hoặc gia cầm (12) và hàng rào loài giữa lợn

và gia cầm hoặc giữa lợn và ngời lỏng lẻo hơn nhiều, vì vậy lợn có thể đóng vai trò

nh là vật chủ trung gian để tạo ra giống virút Cúm mới trên ngời (6) Virút Cúm H3N2 đã đợc phân lập trên lợn ở khắp thế giới Những virút này có đặc tính kháng nguyên và gen giống nh những chủng đã lu hành trên ngời trớc khi phân lập ở lợn (23) Sự tái tổ hợp của đoạn ARN virút trong khi nhiễm trùng kép với hai chủng Cúm ngời và gia cầm là cơ chế để tạo ra chủng mới Quần thể ngời không có kháng thể trung hòa với kháng nguyên bề mặt của virút mới tạo ra do đó không đợc bảo vệ Virút mới có thể lan truyền dễ dàng gây ra đại dịch

1.1.8 Đáp ứng miễn dịch với virút Cúm

Hình 3 Đáp ứng miễn dịch thể dịch và qua trung gian tế bào khi nhiễm virút Cúm

Nguồn: www.influenzareport.comNhánh thể dịch của hệ thống miễn dịch bao gồm các tế bào lympho B (trái), sau khi tơng tác với virút Cúm sẽ biệt hoá thành các tế bào plasma sản xuất kháng thể

Đáp ứng qua trung gian tế bào (phải) bắt đầu với trình diện KN thông qua các phân

tử MHC I (màu đen) và II (màu xanh) bởi các tế bào tua, là tế bào sau đó sẽ dẫn tới

sự hoạt hoá, tăng sinh và biệt hoá các tế bào T đặc hiệu kháng nguyên (CD4 hoặc

CD8) Những tế bào này có chức năng giúp tế bào xử lý (effector cell) qua phóng thích trực tiếp các cytokin hoặc trung gian tính độc tế bào sau khi đã nhận diện kháng nguyên.

1.1.8.1 Đáp ứng miễn dịch dịch thể

Các kháng thể đợc các tế bào plasma sản xuất, nằm trong giai đoạn cuối cùng của sự phát sinh tế bào B, đòi hỏi tế bào B phải nhận diện đợc kháng nguyên và đợc

tế bào T CD4 và các cytokin phát sinh từ tế bào T Không giống nh tế bào T, tế bào

B có thể nhận ra kháng nguyên dới dạng tự nhiên của chúng Tính đặc hiệu của kháng nguyên là do sự tái sắp xếp ngẫu nhiên các gen mã hoá cho vùng siêu biến của các Ig trong tế bào khi tế bào còn nằm trong tuỷ xơng Các tế bào B non (naive

B cell) sau đó đi vào hệ tuần hoàn rồi theo máu và hạch bạch huyết đến các mô và cơ quan lymphô Tại các hạch lymphô, tế bào B non sẽ nhận diện kháng nguyên, sau

đó tế bào B đợc hoạt hoá, chuyển sản xuất từ Ig M sang IgG, làm tăng tính đặc hiệu

và ái lực của globuline miễn dịch và biệt hoá thành các tế bào plasma hoặc tế bào B nhớ khi tế bào tiếp tục phân chia dới sự hiện diện của các cytokin Trong lúc Ig A đ-

ợc vận chuyển xuyên qua lớp biểu mô của đờng hô hấp trên, là nơi IgA sẽ trung hoà

và loại trừ virút gây nhiễm, thì IgG chủ yếu chỉ có vai trò bảo vệ đờng hô hấp dới.Khi nhiễm virút Cúm, cơ thể sẽ tạo ra các kháng thể đối với cả 2 glycoprotein

HA và NA, cũng nh protein M và NP Hiệu giá kháng thể cao nhất vào giữa tuần thứ 4-7 sau khi nhiễm, và sau đó giảm dần Kháng thể vẫn còn có thể phát hiện đợc nhiều năm sau đó dù không bị tái phơi nhiễm Các hiệu giá ức chế HA huyết thanh

từ 1/40 trở lên, hoặc hiệu giá trung hoà huyết thanh từ 1/8 trở lên đợc coi nh có khả năng bảo vệ ở ngời già, để đợc bảo vệ hoàn toàn, cần phải có mức kháng thể cao hơn

Ngợc lại với kháng thể kháng HA, kháng thể kháng NA không trung hoà đợc tính gây nhiễm của virút, nhng thay vào đó kháng thể này sẽ ngăn không cho các tế bào bị nhiễm phóng thích virút ra ngoài Đó là do tác dụng phân cắt acid sialic của

NA nằm trên thụ thể tế bào Kháng thể kháng NA có thể bảo vệ cơ thể khỏi tránh nhiễm bệnh và làm giảm sự thải tiết virút cũng nh mức độ trầm trọng của các triệu

chứng Đáp ứng miễn dịch màng niêm chống lại virút Cúm, căn cứ theo lợng dịch tiết ở mũi, có sự hiện diện của IgA và IgG1 chống lại HA Các nghiên cứu cho thấy rằng sự đề kháng tái nhiễm chủ yếu đợc trung gian qua IgA, mặc dù IgG cũng có phần liên quan Trong miễn dịch, kháng thể tác động chống lại virút Cúm bằng cách trung hoà virút hoặc ly giải tế bào bị nhiễm thông qua bổ thể hoặc tính độc tế bào phụ thuộc vào kháng thể.

1.1.8.2 Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Ngời ta đã chứng minh các tế bào tua đóng vai trò trung tâm trong việc khởi đầu

và thúc đẩy các đáp ứng tế bào T Đây là nhóm bạch cầu phát sinh từ tuỷ xơng, di

động, phân bố tha thớt, chuyên trách việc thu nhận, vận chuyển, xử lý và trình diện kháng nguyên cho tế bào T Khuôn mẫu cơ bản cho loại tế bào này là các tế bào tua nằm ở phổi bắt giữ kháng nguyên từ tác nhân gây bệnh bên ngoài xâm nhập vào, hoạt hoá và sau đó tập trung về các hạch lymphô Kháng nguyên sau đó đuợc xử lý

và gắn vào bề mặt tế bào tua dới dạng các peptit, các peptit này đợc các phân tử MHC Tại các hạch lymphô, các tế bào tua lúc này sẽ khởi động một đáp ứng miễn dịch bởi bất cứ tế bào T nào có thụ thể đặc hiệu cho phức hợp MHC nằm trên bề mặt

tế bào tua Các tế bào T vừa mới đợc kích hoạt sẽ di chuyển tới vị trí bị nhiễm virút nằm ở phổi, nơi mà các tế bào này sẽ làm trung gian cho các hoạt động chống virút

Đáp ứng tế bào T ở ngời đạt đến đỉnh vào khoảng ngày 14 sau khi nhiễm và ở ngời lớn, lợng tế bào T độc đặc trng cho virút Cúm tơng ứng với mức độ sao chép của virút giảm dần qua thời gian Các tế bào T nhớ CD8 nhớ có thể đóng vai trò làm giảm nhẹ mức độ trầm trọng của bệnh và làm cho sự hồi phục nhanh hơn khi bị nhiễm lại Điều quan trọng là, những tế bào này có khả năng đáp ứng lại các tín hiệu

đầu tiên khi bị nhiễm với lợng virút xâm nhập ở mức rất thấp Trong khi không thể tăng sinh để đáp ứng với tình trạng nhiễm trùng, các tế bào này có thể sản xuất ra các cytokin để làm kìm hãm không cho virút sao chép và lan rộng trên biểu mô Giai

đoạn 2 của đáp ứng qua trung gian tế bào T nhớ là các tế bào này tập trung nhanh chóng ở đờng hô hấp trong một vài ngày đầu tiên của đáp ứng Giai đoạn 3 là sự mở

rộng các tế bào T nhớ dới tác động của kháng nguyên xảy ra ở các cơ quan lymphô thứ cấp

đặc hiệu của HA là một trong những yếu tố quyết định đến quá trình xâm nhập vào vật chủ của virút (16, 18) Để virút có thể xâm nhập đợc vào tế bào, HAO phải đợc phân cắt bởi một serine proteinaza nh trypsin ở một vị trị đặc hiệu, đợc mã hóa bởi một axit amin đơn cơ bản (thờng là arginin), tạo thành hai tiểu đơn vị HA1 (khối l-ợng phân tử 36 kDa) và HA2 (khối lợng phân tử 27 kDa) gắn với nhau bằng liên kết cộng hóa trị bởi cầu disulfide Sự phân cắt HA là điều kiện cần thiết cho sự lây nhiễm của virút nhằm để lộ ra đầu amin kỵ nớc của HA2 làm trung gian cho sự hòa màng của vỏ ngoài virút và màng nội bào (37) Virút đi vào tế bào bằng cơ chế nhập bào Trong thể nội bào có tính axit, một phần protein HA hòa tan màng virút với màng không bào, giải phóng các phân tử vARN, các protein phụ và enzym phiên mã ARN phụ thuộc ARN vào tế bào chất (bớc 2) Những protein này và vARN tạo thành một phức hợp đợc vận chuyển vào nhân tế bào, nơi enzym phiên mã ARN phụ thuộc ARN bắt đầu phiên mã sợi vARN dơng bổ sung (bớc 3a và 3b) vARN hoặc

đợc vận chuyển vào trong tế bào chất và dịch mã (bớc 4), hoặc vẫn ở lại trong nhân Các protein virút mới đợc tổng hợp hoặc đợc đa ra bề mặt tế bào thông qua bộ máy Golgi (trong trờng hợp của HA và NA, bớc 5b) hoặc vận chuyển trở lại vào trong nhân để gắn với vARN và tạo thành những hạt genome của virút mới Các protein khác của virút thực hiện nhiều công việc trong tế bào chủ, bao gồm phân hủy mARN của tế bào và sử dụng các nucleotit đợc giải phóng để tổng hợp vARN và ức chế dịch mã mARN của tế bào chủ

vARN âm tạo nên genome của virút tơng lai, cùng với enzym phiên mã ARN phụ thuộc ARN và các protein khác của virút đợc lắp ráp vào trong một virion Các phân tử HA và NA tập hợp lại thành một chỗ lồi ra trong màng tế bào vARN và các protein virút chủ yếu rời nhân và đi vào trong phần nhô lên này của màng (bớc 6) Virút trởng thành nảy chồi ra khỏi tế bào trong một khối cầu của màng photpholipit,

có các phân tử HA và NA trên lớp áo màng này (bớc 7) Sau khi giải phóng virút Cúm mới, tế bào chủ sẽ chết đi

Hình 4 Chu trình nhân lên của virút Cúm Nguồn: en.wikipedia.org

1.1.10.Sự phát triển của virút trên tế bào

Virút cúm đầu tiên đợc nuôi trên trứng gà có phôi Sau này, các virút cúm có thể

đợc nuôi cấy trên trứng gà có phôi hoặc trong một số hệ nuôi cấy tế bào tiên phát Việc nuôi cấy virút trên trứng gà có phôi vẫn đợc lựa chọn làm quy trình sản xuất vắc xin cúm trên thế giới Hiện nay, các hệ nuôi cấy tế bào nh thận khỉ tiên phát hay thận chó thờng dùng để phân lập virút cúm từ mẫu bệnh phẩm của ngời

Sự phát triển của virút trên nuôi cấy tế bào gây ra sự hủy hoại tế bào và tạo ra các đám hoại tử trong một số dòng tế bào nh tế bào thận khỉ, thận bê, thận chuột

đồng, thận gà Ngoài ra nếu sử dụng các dòng tế bào thờng trực thì trypsin phải đợc

bổ sung để hoạt hóa các phân tử protein HA trong quá trình xâm nhập vào tế bào chủ của virút

1.1.11.Sinh bệnh học

Các nghiên cứu đã đa ra những bằng chứng chứng minh rằng sinh bệnh học của virút Cúm là tính trạng đa gen Điều này có nghĩa là sản phẩm của tất cả các gen của virút đều tham gia vào quá trình nhận dạng tế bào vật chủ và gây độc tính trong quá trình xâm nhập phá vỡ tế bào Trong đó gen HA đóng vai trò trung tâm về tính độc của virút gồm 2 phân týp H5, H7, có độc tính mạnh nên gây tỷ lệ chết cao Protein

HA của các virút này khác các HA của các phân nhóm khác là có một trình tự nhiều axit amin ở đầu carboxyl của HA1 Điều này cho phép các enzyme proteaza của tế bào nhận biết trình tự đó để cắt HA thành HA1 và HA2, là giai đoạn cần thiết cho virút xâm nhập tế bào và phát triển lan ra Đây cũng là cơ sở giải thích tính gây độc của virút Cúm ở ngời

1.1.12.Dịch tễ học

1.1.12.1 Sự lây truyền và sự thay đổi theo mùa

Bệnh Cúm chủ yếu đợc lây truyền từ ngời sang ngời qua những hạt nhỏ (đờng kính > 5 àm) từ mũi và họng khi ngời bị nhiễm khi ho và hắt hơi Các sol khí này không lơ lửng trong không khí và cần phải có tiếp xúc gần để có thể lan truyền đợc (từ 1-2 mét) Sự lây truyền cũng có thể xảy ra qua tiếp xúc ngoài da trực tiếp hoặc tiếp xúc gián tiếp với dịch tiết hô hấp (tay chạm vào các bề mặt bị nhiễm sau đó sờ lên mắt, mũi hoặc miệng) Ngời nhiễm Cúm có thể phát tán virút từ 2 ngày trớc đến

5 ngày sau khi có triệu chứng Trẻ em có thể lây lan virút đến 10 ngày hoặc lâu hơn.Bệnh Cúm lây lan mạnh nhất vào mùa đông và bởi phía Bắc và Nam bán cầu có mùa đông ở những thời điểm khác nhau trong năm nên trong thực tế có hai mùa Cúm khác nhau mỗi năm Điều này giải thích tại sao WHO đa ra những khuyến cáo

đối với sản xuất hai loại vắc xin khác nhau mỗi năm, một cho phía Bắc, và một cho phía Nam bán cầu.

Có nhiều lý do để giải thích tại sao bệnh Cúm thờng bùng phát vào mùa đông

nh độ ẩm và nhiệt độ tơng đối thấp giúp virút Cúm có thể sống lâu hơn, mọi ngời ờng xuyên ở trong nhà dẫn đến sự tiếp xúc gần gũi hơn tạo điều kiện virút lây lan Một giả thiết khác là do lợng vitamin D trong cơ thể xuống thấp trong mùa lạnh cũng làm cho con ngời dễ mắc Cúm hơn Tuy nhiên, những thay đổi theo mùa trong cờng độ lây nhiễm virút Cúm cũng xảy ra ở những vùng nhiệt đới, sự lây lan cao nhất chủ yếu diễn ra trong suốt mùa ma

th-1.1.12.2 Dịch và đại dịch

Mỗi năm, các vụ dịch Cúm gây ra 3-5 triệu ca bệnh và từ 300.000-500.000 tử vong trên toàn cầu Nguy cơ mắc bệnh nặng và tử vong cao nhất trong số các bệnh nhân lớn hơn 65 tuổi, trẻ nhỏ dới 2 tuổi, và những ngời có nguy cơ mắc thêm các biến chứng từ Cúm

Những virút Cúm mới luôn luôn đợc sinh ra do đột biến hay tái sắp xếp vật liệu

di truyền Những đột biến có thể gây ra những thay đổi nhỏ trong các kháng nguyên

HA và NA trên bề mặt virút Đó là đột biến kháng nguyên chậm, tạo ra nhiều chủng Cúm qua thời gian cho tới khi một trong những biến thể đạt tới sự thích ứng cao hơn

và lây lan nhanh chóng trong cộng đồng, gây ra bệnh dịch Ngợc lại, khi các virút Cúm đợc sinh ra có những kháng nguyên mới hoàn toàn, chẳng hạn sự tái sắp xếp vật liệu di truyền giữa các chủng Cúm gia cầm và các chủng Cúm ngời; đó là đột biến kháng nguyên nhanh Nếu một chủng virút Cúm ngời có các kháng nguyên mới hoàn toàn xuất hiện, tất cả mọi ngời sẽ bị cảm nhiễm và virút Cúm mới sẽ lan tràn không thể kiểm soát, gây ra đại dịch

Ngợc lại với vụ dịch, đại dịch là những biến cố ít gặp, xảy ra cứ mỗi 10 hoặc 50 năm Những đại dịch đã đợc ghi nhận từ thế kỷ thứ 16, và trong vòng 400 năm trở lại đây, đã có 3 đại dịch Cúm xảy ra (bảng1) Thiệt hại về ngời của các đại dịch này thay đổi từ mức tàn phá sang vừa hoặc nhẹ

Bảng 1 Đột biến kháng nguyên nhanh và các đại dịch (11, 25)

1918 H1N1 ("Spanish") Nghiêm trọng 40 - 100 triệu

1957 H2N2 ("Asian") Vừa phải 1 - 1,5 triệu

1968 H3N2("Hong kong") Nhẹ 0,75 - 1 triệu

?

Các đại dịch Cúm luân chuyển trên toàn cầu theo nhiều đợt kế tiếp nhau, và không có cách nào để ngăn ngừa sự lan rộng của một virút gây đại dịch Cúm mới Một đặc điểm của Cúm trong đại dịch là số tử vong chuyển sang nhóm tuổi trẻ hơn Một nửa số tử vong có liên quan đến Cúm trong đại dịch 1968 và phần lớn những ca

tử vong liên quan đến Cúm trong các đại dịch 1957 và 1918, đều xảy ra ở ng ời

< 65 tuổi

Kinh nghiệm trong quá khứ chỉ ra rằng không có quy tắc chung cho các đại dịch

và cũng không có cơ sở tin cậy nào để dự đoán thời gian và nơi đại dịch có thể xuất hiện Trong suốt thế kỷ 20, các đại dịch xảy ra ở những khoảng thời gian tơng đối dài và không thể dự đoán trớc đợc, từ 9 đến 39 năm trong suốt các đại dịch 1918 (H1N1), 1957 (H2H2), 1968 (H3N2) và 1977 với quy mô nhỏ hơn Trong năm

1957, virút H2N2 đã thay thế hoàn toàn virút H1N1 trớc đó, và trong năm 1968, H3N2 thay thế H2N2 Sự tái xuất hiện của H1N1 năm 1977 không gây ra một đại dịch thật sự, bởi nhiều ngời sinh trớc năm 1957 đã đợc miễn nhiễm một phần Hơn thế nữa, virút H1N1 không thay thế H3N2 Từ năm 1968, cả hai phân týp H1N1 và H3N2 lu hành đồng thời với virút Cúm B gây ra những vụ dịch bùng phát trên ngời trong giai đoạn tiền đại dịch

1.1.13.Dự phòng và kiểm soát

Biện pháp phòng chống hữu hiệu nhất đối với dịch Cúm là tiêm phòng vắc xin Vắc xin Cúm có hiệu quả bảo vệ 70-90% trên ngời trẻ tuổi mạnh khỏe nếu kháng nguyên vắc xin phù hợp với chủng virút Cúm đang lu hành Tuy nhiên, hiệu quả phòng bệnh của vắc xin không cao đối với trẻ em và ngời già Với những giới hạn của vắc xin hiện có, đã có nhiều nghiên cứu phát triển những tá chất tốt hơn để tăng cờng đáp ứng miễn dịch của vắc xin Cúm cũng nh phát triển vắc xin sống giảm độc lực Một trong những bớc tiến hứa hẹn là phát triển vắc xin sống giảm độc lực bằng thích ứng nhiệt độ lạnh Tuy nhiên, mặc dù vắc xin này có hiệu quả ở trẻ em và ngời trẻ tuổi thì lại quá giảm độc lực để kích thích sinh kháng thể bảo vệ ở ngời già (8)

Sự phát triển của kỹ thuật di truyền ngợc sử dụng hệ thống chuyển nhiễm ribonucleoprotein (RNP) cho phép thay thế các gen của virút Cúm và tạo thành phân

tử ARN tái tổ hợp in vitro Một số tá chất khác nhau cũng đã đợc sử dụng để tăng ờng khả năng đáp ứng miễn dịch của vắc xin Cúm

c-Vắc xin Cúm bất hoạt bằng formaldehyt hoặc vắc xin chứa glycoprotein bề mặt tinh khiết đợc sản xuất trên trứng gà có phôi phải thay đổi chủng sản xuất hàng năm

để đáp ứng với tính đa dạng của virút Chủng virút là một trong những thành phần quan trọng nhất của sản xuất vắc xin Cúm Chủng virút phải không có các yếu tố ngoại lai, có chứa thành phần HA và NA phù hợp với chủng gây dịch trong năm và phải có khả năng nhân lên tốt Dựa trên thông tin từ mạng lới giám sát Cúm toàn cầu, hàng năm vào tháng Hai, Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) đã xem xét 2 lần trong một năm tình hình dịch tễ về Cúm trên toàn thế giới, khuyến cáo sử dụng các chủng virút Cúm mới Theo khuyến cáo của WHO thì thờng xuyên cần thiết phải phát triển các chủng virút vắc xin chuẩn có các tính chất kháng nguyên của loài chủng mà WHO khuyến cáo, và có khả năng nhân lên tốt để việc sản xuất vắc xin có hiệu quả Hiện tại, đối với Cúm mùa, vắc xin đợc cấp phép trên toàn thế giới phải chứa 2 phân týp Cúm A đang lu hành là H3N2, H1N1 và một chủng Cúm B (42)

Hiện nay trên thế giới cũng đã rất nhiều nớc nh Mỹ, Pháp, Nhật Bản, Trung Quốc, Hungaria với các hớng công nghệ đang đợc các nhà sản xuất lựa chọn hiện

nay bao gồm: 1/ Từ trứng gà có phôi SPF (Specific Pathogen Free); 2/ Trên các dòng

tế bào động vật (MDCK); 3/ Sống giảm độc lực và 4/ Trên tế bào Vero (dùng chủng

Trớc đây, chỉ có dòng tế bào tiên phát và tế bào lỡng bội đợc sử dụng sản xuất các loại vắc xin cho ngời là đợc cấp phép Dòng tế bào thờng trực không đợc sử dụng bởi những lo ngại liên quan đến khả năng làm xuất hiện các khối u và sự lây nhiễm virút của những dòng tế bào này Tế bào Vero, dòng tế bào thận khỉ xanh châu Phi thờng trực, đã đợc kiểm nghiệm trong khía cạnh này và ngời ta cũng đã xây dựng một ngân hàng tế bào Vero đợc chấp thuận bởi WHO (21) Điều này chứng minh không có tác nhân của virút và không có khả năng gây khối u ở những

đời cấy truyền trên dòng tế bào này (4, 13, 35) Tế bào Vero mẫn cảm với một phổ virút rộng nhng ở những lần thử nghiệm đầu tiên, virút Cúm không phát triển thành công trên tế bào này (17, 22)

Tuy nhiên, những nghiên cứu sau đó đã chứng minh rằng thêm trypsin nhiều lân vào môi trờng nuôi cấy của tế bào Vero đã nhiễm virút Cúm phục hồi kiểu nhân lên nhiều lần của virút Cúm A và B (7, 15)

Nghiên cứu của Govorkova và cộng sự cho thấy dòng tế bào Vero là một hệ thống vật chủ thích hợp để phân lập và nuôi cấy các virút Cúm A (7) Hiệu quả phân lập những chủng đang lu hành hiện nay A/H3N2 là tơng tự ở tế bào Vero và MDCK Trong 72 chủng thích ứng trên trứng, 90,3% đợc phát hiện có hiệu giá HA trên tế bào Vero sau lần cấy truyền đầu tiên và 51,4% sau lần thứ hai Những trình tự axit amin của vùng HA1 của các virút Cúm A đợc phân lập và cấy truyền trên tế bào

Vero giống hệt nh các virút sinh trởng trên tế bào MDCK ở nồng độ gây nhiễm thấp, ngời ta thu đợc sản lợng virút cao bằng cách thêm nhiều lần trypsin vào môi tr-ờng Sau 20 lần cấy truyền chủng A/H1N1, ngời ta thu đợc lợng protein của virút cao nh trên tế bào MDCK Những nghiên cứu ban đầu với một số lợng chủng giới hạn đã cho thấy tế bào Vero hỗ trợ tốt cho sự phân lập và nhân lên của các chủng virút Cúm A

Nhóm tác giả này cũng đã chỉ ra Vero là một tế bào chủ thích hợp để phân lập

và nuôi cấy các chủng virút Cúm B và xác định những đặc điểm sinh học và di truyền học của cả virút Cúm A và B trên tế bào Vero Đồng thời mô tả đặc điểm các thụ thể trên tế bào Vero so với những thụ thể này trên tế bào MDCK Phân tích trình

tự đã khẳng định HA của virút Cúm B trên tế bào Vero giống hệt với HA trên tế bào MDCK, nhng khác với virút sinh trởng trên trứng ở các vị trí axit amin 196 đến 198

1.2.2 Tế bào MDCK

Tế bào thận chó Madin Darby đợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1958 và đã

đ-ợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất vắc xin thú y Chúng có thể sản sinh ra khối lợng lớn virút Cúm (33) Cũng nh tế bào Vero, MDCK là dòng tế bào bám dính và có thể nuôi cấy trong môi trờng không có serum

MDCK là dòng tế bào đợc WHO khuyến cáo sử dụng để phân lập virút Cúm A

từ mẫu bệnh phẩm của các trờng nghi ngờ mắc Cúm

Reina và cộng sự báo cáo một bản nghiên cứu so sánh của các dòng tế bào MDCK, Vero và MRC-5 trong sự phân lập virút Cúm A Trong 746 mẫu nghiên cứu mẫu có 60 virút Cúm A đợc phân lập Dòng tế bào MDCK thể hiện sự nhạy cảm với virút Cúm là 100%, dòng tế bào Vero là 71,4% và dòng tế bào MRC-5 là 57,1% (26) Qua thống kê, tế bào MDCK đã tỏ rõ sự khác nhau đáng kể đối với Vero và MRC-5 Phân tích định lợng chỉ ra dòng tế bào MDCK nhạy cảm hơn hẳn những dòng tế bào khác Có vẻ nh dòng tế bào MDCK vẫn là một trong những dòng tế bào tốt nhất đợc khuyến cáo để phân lập virút Cúm A từ các mẫu bệnh phẩm đờng hô hấp

Một nghiên cứu khác về trình tự axit amin và những đặc điểm sinh học của HA của ba biến thể của chủng virút Cúm X-31 (H3N2) khi nuôi cấy trên tế bào MDCK Trong hai biến thể, có 2 vị trí axit amin thay đổi ở HA1 là các axit amin ở vị trí thứ 8

và 144 lần lợt tơng ứng với mất vị trí glycosin hóa và những thay đổi đặc biệt trong tính kháng nguyên Nh các virút thích ứng trên trứng khác của phân týp H3, virút Cúm X-31 cũng nhân lên kém trên tế bào Khi không có trypsin, các đám hoại tử hầu nh không thể nhìn thấy và rất khó có thể đếm đợc Khi có trypsin, các đám hoại

tử thấy đợc rõ ràng có đờng kính từ 1 đến 2 mm Trong điều kiện này, số lợng đám hoại tử đã tăng lên ít nhất 100 lần (27)

1.2.3 Tế bào PMKc

Việc sử dụng tế bào thận khỉ tiên phát để trong sản xuất vắc xin phòng virút Cúm là một công nghệ mới với cả thế giới, Việt Nam cũng không phải ngoại lệ Hiện nay, thế giới chủ yếu đang sử dụng công nghệ vắc xin truyền thống là sản xuất trên trứng gà có phôi Tuy nhiên các nhà khoa học của Công ty Vắc xin và Sinh phẩm só 1 đã sản xuất vắc xin Cúm A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát Quá trình thích ứng chủng rgH5N1 có hiệu quả trên tế bào PMKc và nghiên cứu phát triển vắc xin Cúm A/H5N1 trên dòng tế bào này đã có những thành công nhất định (1)

Kết quả này cũng đồng thời cũng hứa hẹn khả năng thích ứng tốt những chủng virút Cúm mùa trên dòng tế bào này

Chơng 2 VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU

2.1 VậT LIệU CHUNG

- Phiến 24 giếng (Nunc - Đan Mạch)

- Chai 25cm2 và 75cm2 (Nunc - Đan Mạch)

- Tế bào thận khỉ tiên phát một lớp (Do Trung tâm khoa học sản xuất vắc xin

và sinh phẩm y tế cung cấp Tế bào này đợc chuẩn bị từ nguồn khỉ sạch đã

đ-ợc kiểm tra không có các tác nhân ngoại lai nh: SV40, SFV, SIV, virút B, M tuberculosis)

- Tế bào MDCK (Do Ngân hàng tế bào Châu âu cung cấp)

- Tế bào Vero (Do Ngân hàng tế bào Châu âu cung cấp)

- Chủng virút Cúm B B/Malaysia/ 2506/2004 (Do Viện Quốc gia sinh phẩm chuẩn, UK cung cấp)

2.4 Môi trờng và hóa chất

2.5.1 Lấy tế bào từ nitơ lỏng

- Chuẩn bị chai nuôi tế bào 75 cm2 hoặc 25 cm2 (tuỳ mục đích sử dụng) đã có sẵn môi trờng nuôi (ví dụ: MEM 10% FBS) ở 37oC hoặc ở nhiệt độ phòng

- Tiến hành lấy ống tế bào khỏi nitơ lỏng, làm đông tan

- Vô trùng ống tế bào trớc khi mở nắp ống

- Hút dịch tế bào từ ống (còn lạnh) chuyển sang chai nuôi đã có sẵn môi trờng

- Láng nhẹ để tế bào phân bố đều trong dịch môi trờng

- Nuôi tế bào trong 37oC trong 6-8h hoặc qua đêm để tế bào bám vào bề mặt chai

- Thay môi trờng cho tế bào bằng môi trờng nuôi sau 24h (tuỳ thuộc dòng tế bào và mục đích thí nghiệm, ví dụ: MEM 5% FBS cho tế bào MDCK )

2.5.2 Tách tế bào

- Nuôi tế bào kín một lớp

- Hút bỏ môi trờng trong chai nuôi tế bào

- Rửa tế bào bằng 5ml PBS (-)

- Cho 0,3ml Trypsin-EDTA vào chai, láng đều

- Để chai tế bào ở 370C khoảng 20-30 phút đến khi tế bào bong khỏi thành chai

- Cho MEM 5% FBS vào chai, hút lên hút xuống vài lần

- Phân chia ra các chai mới tùy thuộc tỷ lệ tách

- Thêm vào mỗi chai cho đủ lợng môi trờng MEM 10% FBS

- ủ ở 370C cho đến khi tế bào kín một lớp

2.6 Phơng pháp gây nhiễm virút Cúm

- Pha loãng virút bằng Hank’s đến nồng độ cần gây nhiễm (ví dụ 0,01PFU/tế bào)

- Hút bỏ môi trờng trong chai nuôi tế bào

- Rửa tế bào bằng Hank’s

- Gây nhiễm hỗn dịch virút đã pha loãng vào chai nuôi tế bào, chai còn lại làm chứng (-) cho Hank’s Láng nhẹ cho hỗn dịch dàn đều trên bề mặt tế bào

- Hấp phụ virút ở nhiệt độ phòng trong 1h, cứ 20 phút láng 1 lần

- Chuẩn bị môi trờng nuôi cấy virút: pha TPCK-trypsin trong môi trờng MEM

- Nuôi virút ở 37oC trong 72-96h

- Theo dõi mức độ hủy hoại của virút hàng ngày

2.7 Phơng pháp gặt virút

- Sau 72-96h gây nhiễm, thu lấy hỗn dịch virút trong ống eppendorf vô trùng

- Ly tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút, 4oC để loại bỏ xác tế bào, thu nớc nổi

- Bảo quản virút ở -80oC

2.8 PHảN ứNG NGƯNG KếT HồNG CầU

2.8.1 Chuẩn bị hồng cầu

- Lấy 1ml máu gà vào ống falcon chứa dung dịch bảo quản Alsever

- Ly tâm 2500 vòng/phút trong 5 phút ở 250C

- Hút nớc nổi, thêm 5ml PBS (-) vào ống

- Tiếp tục ly tâm 2500 vòng/phút trong 5 phút ở 250C, lặp đi lặp lại 4 lần

- Pha dung dịch 0,5% hồng cầu gà trong PBS (-)

2.8.2 Tiến hành

- Hiệu giá virút sau khi gặt sẽ đợc đánh giá bằng phản ứng ngng kết hồng cầu (HA)

- Lấy phiến thử, viết tên mẫu theo thứ tự: (-), (+) và các mẫu thử

- Cho vào mỗi giếng 50àl PBS (-)

- Hút 50àl mẫu vào các giếng đầu tiên, giếng (-) cho 50àl PBS (-)

- Pha loãng mẫu bằng cách hút 50àl mẫu từ giếng đầu tiên chuyển sang giếng tiếp theo, đến giếng cuối cùng cũng hút bỏ 50àl và bỏ đầu côn Mỗi giếng hút lên hút xuống 5 lần

- Thêm vào mỗi giếng 50àl dung dịch 0,5% hồng cầu gà

- Vỗ nhẹ vào phiến và đậy nắp

- Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và đọc kết quả

- Căn cứ vào chứng (-) và (+) để đánh giá thử nghiệm

2.9 QUY TRìNH CHUẩN Độ HIệU GIá Virút Cúm

- M«i trêng nu«i cÊy MEM (Gibco)

- M«i trêng MEM 2X

Sodium bicarbonate (Gibco - Mü) 20 ml

- Thuèc nhuém Crystal violet

Crystal violet (Merck - §øc) 0,325 g