tìm hiểu về nấm men và quá trình lên men trong công nghệ sản xuất bánh

Có rất nhiều ngành công nghiệp thay đổi để phù hợp vớinhu cầu cuộc sống của con người, trong đó bao gồm cả ngành công nghiệp thực phẩm.Một ngành không thể thiếu đối với cuộc sống của chú

Nguyễn Minh Hải Nguyễn Thị Nàng Chung Tấn Phong Nguyễn Thị Bảo Trân

TP HCM, 03/ 2011VIỆN CÔNG NGHỆ THƯC PHẨM VÀ SINH HỌC

Việt Nam chính thức gia nhập WTO, làm cho nền kinh tế nước ta ngày càng khôngngừng đổi mới và phát triển Có rất nhiều ngành công nghiệp thay đổi để phù hợp vớinhu cầu cuộc sống của con người, trong đó bao gồm cả ngành công nghiệp thực phẩm.Một ngành không thể thiếu đối với cuộc sống của chúng ta

Trong quá trình sản xuất thực phẩm, lên men cũng là một trong những quá trìnhkhông thể thiếu trong sản xuất rượu, bia, dưa chua, len men giấm Trong sản xuất một

số loại bánh quá trình lên men cũng đóng một vai trò rất quan trọng như bánh bao, bánhmì Nếu không có quá trình lên men thì sản phẩm tạo thành sẽ mất đi các tính chất đặctrưng Quá trình lên men trong sản xuất thực phẩm cũng là một vấn đề đang được cácnhà sản xuất đặc biệt quan tâm Đây cũng là đề tài tiểu luận của nhóm em, hôm naynhóm em sẽ tìm hiểu về quá trình lên men trong sản xuất bánh

Vì thời gian hoàn thành bái cáo không nhiều, cũng như kiến thức còn hạn chế nênkhông tránh khỏi những sai xót, kính mong được sự đóng góp của cô và các bạn để nhóm

em được tiến bộ hơn

Chương 1: Tìm hiểu chung về nấm men

Thuật ngữ nấm men (yeast, levure) là tên chung để chỉ nhóm vi nấm thường có cấu tạođơn bào và thường sinh sôi nảy nở bằng phương pháp nảy chồi (budding) Nấm men khôngthuộc về một phân loại nào nhất định, chúng có thể thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) hoặcngành Nấm đảm (Basidiomycota) Nấm men có kích thước lớn, cấu tạo hoàn chỉnh, không diđộng

Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong môi trường chứa đường, pH thấp(đất, nước, không khí, lương thực, thực phẩm, hoa quả,…), đất, có thể nói đất là môi trường tựnhiên để giữ giống nấm men đặc biệt là trên bề mặt của nhiều loại lá cây, lương thực, thực phẩmkhác

• Ứng dụng của nấm men:

Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng giàu protein, lipide,vitamin Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếmkhí, trong điều kiện hiếu khí thì chúng tạo thành sinh khối tế bào, vì vậy nấm men được ứngdụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu bia, nước giải khát, làm nở bột mì,tạo sinh khối giàu protein và vitamin, sản xuất enzym, sản xuất acid citric từ khí thiên nhiên, sảnxuất riboflavin (vitamin B2)…

Nấm men sinh sản nhanh, sinh khối của chúng giàu protein, vitamin vì vậy còn được sửdụng trong công nghiệp sản xuất thức ăn bổ sung cho người và gia súc

Nấm men được sử dụng làm bột nở bánh mì, gây hương nước chấm, một số dược phẩm vàgần đây còn được sử dụng để sản xuất lipid

Tuy nhiên cũng có những loại nấm men có hại gây bệnh cho người và gia súc, làm hỏnglương thực, thực phẩm,…

Candida albicans Cryptococcus neoformans

Hình 1 Một vài loài nấm men gây bệnh ở người

1.1 Hình thái, cấu tạo nấm men:

1.1.1 Hình dạng nấm men:

Nấm men thường có hình dạng khác nhau Thường chúng có hình cầu, hình elip, hình bầudục và cả hình dài Một số loài nấm men có tế bào hình dài nối với nhau thành những sợi gọi làkhuẩn ty (mycelium) hay khuẩn ty giả (pseudomycelium) Hiện tượng này thường thấy ở cácloài Endomyces, Endomycopsis, Candida, Trichoporon

Hình dạng của nấm men hầu như không ổn định Nó phụ thuộc vào tuổi của nấm men vàphụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy Ví dụ, Sach.cereviceae có hình bầu dục, nếu nó ở môi trườnggiàu chất dinh dưỡng Trong điều kiện yếm khí nấm men có hình tròn, ngược lại, trong điềukiện hiếu khí tế bào kéo dài hơn

Nếu chỉ quan sát một ống nghiệm nuôi trong môi trường lỏng, ta cũng thấy có sự khácnhau về hình thái Phần trên ống nghiệm nấm men có hình dài còn phần dưới có hình tròn

1.1.2 Kích thước tế bào nấm men:

Tế bào nấm men thường có kích thước lớn gấp từ 5÷10 lần tế bào vi khuẩn Kích thướctrung bình của tế bào nấm men như sau:

Chiều dài: 9÷10µ; chiều rộng: 2÷7µ

Kích thước của tế bào nấm men thay đổi theo điều kiện nuôi cấy, theo tuổi sinh lý

1.1.3 Cấu tạo tế bào nấm men:

Tế bào nấm men có cấu tạo gần giống tế bào vi khuẩn, tuy có cấu tạo đơn bào nhưng cũngmang đầy đủ tính chất của một cơ thể sống, chúng có cấu tạo từ màng, nguyên sinh chất và nhângồm các phần sau:

1.1.3.1 Thành tế bào:

Thành tế bào nấm men dầy 25nm (chiếm 25% trọng lượng khô của tế bào) Thành tế bào

có cấu trúc nhiều lớp như vỏ vi khuẩn nhưng thành phần hóa học chủ yếu là glucan (cấu tạo bởicác gốc D-glucose) và mannan (D-manose) Tỷ lệ Glucan và mannan chiếm 90% trọng lượng

vỏ trong đó mannan cao hay thấp hoặc không có Thành phần khác có protein 6-7%, hexozamin

và phần còn lại là lipide, poliphotphat, các chất chứa kitin

Manan: là hợp chất cao phân tử của D-manose, mỗi phân tử manan thường chứa từ200÷400 thành phần manose Thường manan liên kết với protid theo tỳ lệ 2:1 Manan thường cómối lien kết α-1,6; α-1,2; β-1,3, phân tử lượng của chúng khoảng 5.104KD

Glucan: là hợp chất cao phân tử của D-glucose Đó là một polysaccharide phân nhánh cóliên kết β-1,6 và β-1,3 Cả hai thành phần này phân bố đều trên bề mặt tế bào

Protit: protit thường được liên kết với các thành phần khác, ví dụ như manan Trong thànhphần của chúng chứa nhiều acid amin khác nhau như glyxin, alanin, tirozin, lơxin, izolơxin,asparagin, glutamine, phenilalanin, acfinin và một lượng nhỏ xerin, histidin, tryptophan Phứchợp protein- manan rất bền vững do đó tế bào nấm men rất khó bị phá vỡ Thường thì cácpolysaccharide nằm phía ngoài và protit nằm phía trong gần bào tương.

Kitin: thường nằm ở phần nảy chồi Chúng chiếm một số lượng rất nhỏ, khoảng 3% Đây

là chất rất bền vững, không bị enzyme phá hủy, vì thế chúng có tác dụng bảo vệ chồi trong khichồi còn non Khi tế bào con phát triển, tách khỏi tế bào mẹ, nơi tạo ra tế bào con này sẽ tạo ravết sẹo và không bao giờ ở vị trí này tạo ra được một chồi mới

1.1.3.2 Màng nguyên sinh chất:

Hình 2: Cấu tạo của màng nguyên sinh

Dưới thành tế bào là màng nguyên sinh chất Màng nguyên sinh chất thường dày50÷100Ao và chiếm khoảng 10÷15% trọng lượng khô của tế bào

Màng nguyên sinh chất tham gia những nhiệm vụ cơ bản sau:

Duy trì áp suất thẩm thấu của tế bào

Đảm bảo chủ động các chất dinh dưỡng trong tế bào và thải các sản phẩm trao đổi chất rangoài tế bào

Quá trình chuyển vận vật chất vào tế bào và ra khỏi tế bào qua màng nguyên sinh chất làquá trình thẩm thấu chọn lọc Không phải tất cả các chất có kích thước nhỏ hơn khe hở củamàng nguyên sinh chất đều có thể qua màng, Màng tế bào chỉ cho qua đó những chất mà tế bàocần.

Là nơi xảy ra quá trình sinh tổng hợp một số thành phần của tế bào, nhất là thành tế bào

Là nơi chứa một số enzyme và cơ quan con (ribosome)

Dưới kính hiển vi điện tử, người ta thấy màng nguyên sinh chất được cấu tạo từ 3 lớp.Ngoài cùng và trong cùng là hai lớp protein và ở giữa là lớp phospholipide Lớp phospholipidegồm hai lớp Một lớp có gốc quay vào trong và một lớp có gốc quay ra ngoài

Nói chung màng nguyên sinh chất không có cấu tạo đồng bộ như vậy Có chỗ chứa nhiềuprotein hơn, lại có chỗ khác chứa nhiều lipide hơn Dưới tác dụng của điều kiện bên ngoài,protein có thể tạo thành lỗ hỏng do sự sắp xếp lại

Ngoài ra, trên màng tế bào còn có một loại protein đặc biệt, làm nhiệm vụ vận chuyển cácchất dinh dưỡng gọi là permease

Trong thời kỳ còn non, màng nguyên sinh chất bám sát lấy thành tế bào, làm cho khả năngtrao đổi chất của nấm men trở nên rất mạnh Ngược lại ở thời kỳ tế bào già, màng nguyên chất

co lại, tạo thành một khoảng trống giữa thành tế bào và chất nguyên sinh, vì thế mà khả năngtrao đổi chất của nấm men gặp khó khăn Hiện tượng màng co vào trong gọi là co nguyên sinhchất Hiện tượng màng áp sát vào thành gọi là trương nguyên sinh chất hay còn gọi là hiệntượng giữ nước trong tế bào Cả hai trường hợp này là trạng thái bệnh lý

1.1.3.3 Chất nguyên sinh:

Chất nguyên sinh thường có màu xám Khi tế bào còn non hầu như không nhận thấy, càng

về già ta càng thấy có sự thay đổi rõ rệt

Tế bào còn non chất nguyên sinh thường đồng nhất hơn, càng về già tế bào chất càngkhông đồng nhất là do xuất hiện nhiều không bào và hạt volutin, vì thế chất nguyên sinh thường

có dạng lổn nhổn Trong thành phần của chúng, cũng giống như của các vi sinh vật khác, chủyếu được cấu tạo từ nước, protit, gluxit, lipit, các muối khoáng, enzyme, và các cơ quan con

Tế bào chất luôn luôn chuyển động Chúng thường chuyển động theo một chiều xungquanh thành tế bào Ngoài ra nó còn phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của nấm men Ví dụ nấmmen trong trạng thái hô hấp tế bào chất thường đồng nhất và không chứa những chất lổn nhổn,trong khi đó ở trạng thái lên men thấy xuất hiện nhiều chất làm mất tính đồng nhất của khôngbào Độ nhớt của tế bào chất lớn hơn độ nhớt của nước 800 lần

1.1.3.4 Nhân tế bào:

Nhân của tế bào nấm men là nhân thật, nhân đã có sự phân hóa, có kết cấu hoàn chỉnh và

ổn định, có màng nhân Nhân có hình tròn hay hình bầu dục, bắt đầu có những biểu hiện của tếbào tiến hóa, đó là phân chia theo hình thức gián phân Màng nhân, gồm hai lớp có nhiều lỗthủng (ở tế bào nấm men già, trên mỗi tế bào có khoảng 200 lỗ chiếm 6-8% diện tích màng),trong có chất nhân, hạch nhân và các nhiễm sắc thể (Chromosome)

Như vậy tế bào nấm men thuộc sinh vật cao đẳng Thành phần hóa học quan trọng nhấtcủa nhân là nucleoprotein và các enzyme Nhân có vai trò chủ yếu là mang hệ thống thông tin ditruyền chứa trong AND, điều khiển việc tổng hợp các protein của mỗi loài, điều khiển việc tổnghợp các enzyme điều khiển hoạt động của enzyme và nhiều hoạt động sống khác của tế bào

Hình 3: cấu tạo của nhân tế bào 1.1.3.5 Ty thể (Mitochondria):

Hình 4: cấu tạo của ti thể

Khác với tế bào vi khuẩn nấm men đã có ty thễ Đây là những thể hình cầu, hình que, hìnhsợi nhưng hình dạng và số lượng có thể thay đổi khác nhau phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy vàtrạng thái sinh lý tế bào Là những thể hình cầu, hình que, hình sợi, kích thước 0,2-0,5 x 0,4-1µm luôn luôn di động và tiếp xúc với các cấu trúc khác của tế bào Hình dạng và số lượng tythể thay đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và trạng thái sinh lý của tế bào

Cấu tạo ty thể gồm 2 lớp màng: lớp màng trong có hình lượn song hay hình răng lược đểtăng diện tích tiếp xúc với cơ chất, trong có chứa dịch Giữa hai lớp có các hạt nhỏ bám trênmàng là những hạt cơ bản Bên trong ty thể là chất dịch hữu cơ

Chức năng của ty thể: nó được coi như là trạm năng lượng của tế bào nấm men

Tham gia vào việc thực hiện các phản ứng oxi hóa giải phóng năng lượng ra khỏi cơ chất,làm cho năng lượng được tích lũy dưới dạng ATP

Giải phóng năng lượng khỏi ATP và vận chuyển năng lượng đó thành dạng năng lượng cóích cho hoạt động sống của tế bào

Tham gia vào việc tổng hợp một số hợp chất protein, lipid, hydratcacbon, những hợp chấtnày tham gia vào cấu tạo màng tế bào.

Ngoài rat y thể còn chứa nhiều loại men khác nhau như: oxidase, cytocromoxidase,peroxidase, phosphatase,…

1.1.3.6 Ribosome:

Số lượng ribosome thường thay đổi tùy thuộc từng loài, từng giai đoạn phát triển và từngđiều kiện nuôi cấy Khác với vi khuẩn nấm men có hai loại ribosome trong nguyên sinh chất củanấm men:

Loại 70S (30S và 40S) tồn tại chủ yếu trong ty thể, loại 80S tồn tại chủ yếu trong mạnglưới nội chất và một số ít tồn tại ở trạng thái tự do Loại 80S có hoạt tính tổng hợp protein mạnhhơn

Hình 5: Ribosom 1.1.3.7 Không bào:

Mỗi tế bào nấm men có một không bào khá lớn và nhiều không bào nhỏ có tác dụng điều hòa áp suất thẩm thấu, tham gia vào quá trình trao đổi chất tế bào vì nó chứa nhiều hợp chất hữu

cơ ở trạng thái trung gian, nó được coi như những phần dự trữ quan trọng của tế bào, nó tham gia vào các quá trình điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm

Hình 6: Không bào

Hạt dự trữ: hạt lipid, hạt glycogen và một ít hạt tinh bột khác

1.1.3.8 Lưới nội chất:

Hình 7: Mang lưới nội chất

Mạng nội chất được phát hiện vào năm 1945 dưới kính hiển vi đối pha Kính hiển vi điện

tử cho thấy mạng nội chất nối liền với màng ngoài của nhân ở một số vị trí Mạng nội chấtgiống như một hệ thống ống và túi, tròn hay dẹp, thông thương với nhau và có màng bao quanh.Khoảng giữa hai màng của túi, ống được gọi là khoang Ở hầu hết tế bào, mặt ngoài của mạngnội chất có các ribosome gắn vào, khi đó nó được gọi là mạng nội chất nhám, nơi không có cácribosome được gọi là mạng nội chất trơn

Vùng ngoại vi của màng nhân liên tục với khoang của mạng nội chất Do đó, những kênhtrên mạng nội chất có thể là con đường để vận chuyển vật chất giữa nhân và những phần kháccủa tế bào chất, tạo ra một hệ thống thông tin giữa nhân là trung tâm điều khiển và phần còn lạicủa tế bào Hầu hết protein liên kết với màng hay được vận chuyển bởi mạng nội chất đượctổng hợp bởi ribosome của mạng nội chất nhám Protein tổng hợp từ các ribosome tự do trong tếbào chất sẽ thực hiện chức năng trong dịch tế bào chất.

Nhiệm vụ của mạng nội chất không đơn thuần là đường vận chuyển bên trong tế bào.Màng của mạng nội chất là nơi chứa các protein và các protein này có cả hai chức năng, vừa làthành phần cấu trúc vừa là enzyme xúc tác các phản ứng hóa học Hiện nay, có nhiều bằngchứng cho thấy rằng ít nhất là một số protein cấu tạo mạng nội chất hoạt động như enzyme; một

số của những enzyme này được gắn thêm một đường đa ngắn, giúp đưa protein đến đúng nơinhận trong tế bào

Mạng nội chất còn có nhiệm vụ như một xưởng chế tạo, các enzyme của chúng xúc tác sựtổng hợp các phospholipid và cholesterol được dùng để tạo ra màng mới hay các protein màngđược tổng hợp bởi ribosome trên mạng nội chất là thành phần của màng lipid mới

1.1.3.9 Bộ Golgi:

Hình 8: bộ Golgi

Bộ Golgi (do Camillo Golgi, người đầu tiên mô tả vào năm 1898) gồm một hệ thống túidẹp có màng bao và xếp gần như song song nhau Mặt phía gần nhân được gọi là mặt cis, phíađối diện là mặt trans Các túi chuyên chở chứa bên trong lipid và protein mới được tổng hợp,được tách ra từ màng của mạng nội chất hòa vào các túi dẹp của bộ Golgi ở mặt cis Các chất

này vào trong bộ Golgi được biến đổi, sắp xếp lại và sau đó các túi mới được tách ra từ mặttrans Các túi này vận chuyển các phần tử đến các bào quan khác và màng sinh chất, đôi khi cáctúi được chuyển đến glycocalyx.

Các túi được tách ra từ bộ Golgi có vai trò quan trọng làm tăng bề mặt của màng tế bào.Khi túi được chuyển đến bề mặt của màng sinh chất, chúng sẽ được gắn vào màng này, sau đó

vỡ ra và phóng thích nội dung ra bên ngoài tế bào trong quá trình ngoại xuất bào, một phần haytất cả màng của túi được hòa vào màng sinh chất hay trở về bộ Golgi

1.1.3.10 Lysosome:

Lysosome là những khối hình cầu đường kính từ 0,2-0,4m, có khi lớn đến 1-2m.Lysosome được bao bởi một màng lipoproteide Lysosome chứa những enzyme thủy phân cóvai trò tiêu hóa nội bào

Hình 9: Lysosome 1.1.3.11 Plasmid:

Có một loạiplamid được phát hiệnnăm 1976 ở nấm menSaccharomyces

cerevisiae được gọi là

“2µm plasmid” có vaitrò quan trọng trongthao tác chuyển gencủa kỹ thuật di truyền.Loại plasmid này làmột AND vòng chứa

6300 đôi base

Trong một số tế bào nấm men còn có các vi thể Đó là các thể hình cầu hay hình trứng,đường kính 3µm, chúng phủ một lớp màng dày khoảng 7nm và thường có vai trò nhất địnhtrong quá trình oxy hóa methanol

1.2 Sinh sản của nấm men:

1.2.1 Sinh sản vô tính:

1.2.1.1 Sinh sản bằng phương pháp nảy chồi:

Khác với các loại nấm khác, nảy chồi là phương pháp sinh sản phổ biến nhất ở nấm men.Khi tế bào nấm men trưởng thành bắt đầu nảy ra một chồi nhỏ, chồi lớn dần lên, một phần nhân

tế bào mẹ được chuyển sang chồi sau đó tách hẳn ra thành một nhân mới Đến một lúc nào đó tếbào mới sinh ra sẽ tạo đủ vách ngăn cách hẳn với tế bào mẹ Trên mỗi tế bào mẹ có thể sinh ramột vài chồi nhỏ ở những vị trí khác nhau Tế bào con sau khi tạo thành sẽ tách khỏi tế bào mẹhoặc dính trên tế bào mẹ và tiếp tục nảy sinh các chồi mới Nhiều thế hệ nấm men có thể dínhvới nhau tạo thành một đám phân nhánh như xương rồng Muốn quan sát quá trình nảy chồi của

tế bào nấm men, người ta dùng phương pháp “giọt treo”, dùng phiến kính có hốc lõm và lá kínhmang một giọt dịch nuôi cấy nấm men

Ở điều kiện thuận lợi nấm men sinh sôi nảy nở nhanh, quan sát dưới kính hiển vi thấy hầuhết tế bào nấm men đều có chồi Khi một chồi xuất hiện, các enzyme thủy phân sẽ làm phân giảiphần polysacharide của thành tế bào làm cho chồi chui ra khỏi tế bào, vật chất mới được tổnghợp sẽ được huy động đến chồi và làm chồi phình to dần lên, khi đó sẽ xuất hiện một vách ngăngiữa chồi và tế bào mẹ, thành phần của vách ngăn cũng giống như thành tế bào Khi tế bào chồitách khỏi tế bào mẹ, ở chỗ tách ra còn giữ lại một sẹo của chồi, trên tế bào mẹ mang một vếtsẹo, các vết sẹo này có thể thấy rõ khi nhuộm màu calcaflour hoặc primulin rồi quan sát dướikính hiển vi huỳnh quang

1.2.1.2 Sinh sản bằng phương pháp phân cắt:

Ngoài nảy chồi, một số nấm men còn sinh sản vô tính bằng cách phân cắt nhờ vách ngănngang giống như vi khuẩn, tế bào dài ra sau đó sinh ra những vách ngăn đặc biệt và phân cắtthành nhiều tế bào

1.2.1.3 Sinh sản bằng bào tử đơn tính:

Bào tử được hình thành từ một tế bào riêng rẽ không thông qua kết hợp Sự hình thành bào

tử loại này có nét giống như sự hình thành nội bào tử của một số vi khuẩn có sinh bào tử nhưngkhác ở chỗ, trong túi nấm hình thành nhiều bào tử hơn

Bào tử đốt: ở chi Geotrichum

Bào tử bắn: ở chi Sporobolomyces, Sporidiobolus, Bullera Loại bào tử này có hình thậnđược sinh ra trên một cuống nhỏ mọc ở các tế bào dinh dưỡng hình trứng Sau khi bào tử chínnhờ một cơ chế đặc biệt bào tử sẽ được bắn ra phía đối diện Khi cấy nấm men trên thạchnghiêng theo một đường cấy ziczắc, ít hôm sau sẽ thấy trên thành ống nghiệm phía đối diện vớithạch nghiêng có một đường ziczắc khác do bào tử bắn ra

Bào tử áo hay bào tử màng dày: thường được sinh ra từ các khuẩn ty giả ở nấm Candidaalbicans

1.2.2 Sinh sản hữu tính: Sinh sản bằng bào tử túi

Bào tử túi được sinh ra trong các túi Hai tế bào khác giới (mang dấu + và -) đứng gầnnhau sẽ mọc ra hai mấu lồi Chúng tiến lại với nhau và tiếp nối với nhau Chỗ tiếp nối sẽ tạo ramột lỗ thông và qua đó chất nguyên sinh có thể đi qua để phối chất, nhân cũng đi qua để tiếnhành phối nhân, sau đó nhân phân cắt thành 2, 4, 8 Mỗi nhân được bao bọc bởi chất nguyênsinh rồi tạo thành màng dày chung quanh và hình thành các bào tử túi Tế bào dinh dưỡng biếnthành túi

Túi có thể được hình thành theo hai phương thức:

Tiếp hợp đẳng giao: do hai tế bào nấm men có hình thái, kích thước giống nhau tiếp hợpvới nhau mà tạo thành Ví dụ: Schizosacchoromyces, Debarymyces

Tiếp hợp dị giao: hai tế bào nấm nem có hình thái, kích thước không giống nhau tiếp hợpvới nhau mà thành Ví dụ: Nadsonia

Bào tử túi sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành các tế bào nấmmen mới

Bào tử bắn Phân cắt tế bào

Nảy chồi

Bào tử túi Bào tử màng dày Bào tử đốt

Hình 10: Một số hình thức sinh sản ở nấm men

1.3 Phân loại

Để phân loại nấm men người ta phải tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sau đây:

*Đặc điểm hình thái: tế bào, khuẩn lạc, kiểu nẩy chồi, các dạng bào tử vô tính vàhữu tính, khuẩn ty và khuẩn ty giả

*Đặc điểm sinh lý và sinh hoá:

- Lên men 13 loại đường

- Đồng hóa 46 nguồn carbon Có thể dùng bộ kít chẩn đoán nhanh ID 32C (Bio Mérieux

- Sản sinh acid từ glucoz

- Thủy phân Urê

- Phân giải Arbutin

- Phân giải lipid

- Năng lực sản sinh sắc tố

- Sinh trưởng trên môi trường chứa 50% và 60% glucoza

- Hóa lỏng gelatine

- Phản ứng với Diazonium Blue B

- Phát triển trên môi trường chứa acid acetic 1%

Để xác định loài mới còn cần phân tích thành phần acid béo của tế bào, thành phần đườngtrong tế bào, phân tích hệ coenzyme Q, tỷ lệ G+C, đặc tính huyết thanh miễn dịch, giải trình tựADN và lai ADN

1.3.1 Các phương pháp thực nghiệm dùng để định tên nấm men

1.3.1.1 Quan sát hình thái tế bào nấm men và đo kích thước

Khi xác định hình thái và kích thước tế bào nấm men người ta thường nuôi cấy nấm mentrong môi trường thạch - mạch nha và môi trường mạch nha dịch thể Nếu sử dụng các môitrường khác thì hình thái và kích thước tế bào nấm men có thể thay đổi, không phù hợp với hìnhthái và kích thước tiêu chuẩn đã được ghi trong bảng phân loại

- Môi trường mạch nha: Lấy lúa đại mạch đã ủ cho nảy mầm (loại nhập khẩu dùng để làm

bia), đem phơi khô rồi xay nhỏ thành bột Cân 1kg bột này, thêm 3 lít nước, giữ ở 600C đểđường hoá cho đến khi hết tinh bột (thử với dịch Lugol không thấy có màu xanh lam) Lọc lấydịch trong có thể thêm 3 lòng trắng trứng rồi trộn đều, đun sôi rồi lọc lấy dịch trong Điều chỉnhbằng nước để có nồng độ đường đạt 6o Baume

Phân vào các dụng cụ thuỷ tinh đã khử trùng Nếu làm môi trường đặc thì thêm 2% thạch.Tốt nhất là dùng mầm đại mạch, nếu không thì có thể dùng mầm lúa Nồng độ thích hợp để nuôicấy nấm men dùng khi phân loại là 5,7o Baume Có tài liệu lại sử dụng nồng độ 5-80 Baume.Nấm men được nuôi cấy trong các ống nghiệm thạch nghiêng hoặc các ống nghiệm đựng 3 mlmôi trường dịch thể Nuôi cấy ở 25-300C trong 3 ngày, sau đó lấy ra làm tiêu bản và quan sát.Muốn đo kích thước tế bào nấm men người ta thường sử dụng trắc vi thị kính) Số tế bào nấmmen được đo không ít hơn 20 Chú ý là phải đo các tế bào trưởng thành chứ không đo các chồimới nảy sinh Tế bào nấm men có hình thái và kích thước khác nhau tuỳ loài, tuỳ chi Chúng cóthể có hình cầu, hình bầu dục, hình trứng, hình quả chanh châu Âu, hình ống v.v Khi quan sát

tế bào nấm men dưới kính hiển vi có thể phân biệt được thành tế bào, tế bào chất, không bào(vacuole) và các hạt dị nhiễm (metachromatic granules) Thành tế bào nấm men thẫm hơn sovới nguyên sinh chất, còn không bào thường có hình tròn, màu nhạt hơn Các hạt dị nhiễmthường bắt ánh sáng mạnh hơn, chúng lắc lư trong nguyên sinh chất theo chuyển động Brown.Kích thước của tế bào nấm men khác nhau rất nhiều tuỳ loài thuỳ chi, tuỳ điều kiện sinh trưởng

và có thể thay đổi trong khoảng 1-5 x 5-30àm hay có khi dài hơn nữa Kích thước tế bào của cácloại nấm men thông thường vào khoảng 4-5àm.

1.3.1.2 Nhuộm màu tế bào nấm men:

Muốn quan sát tế bào nấm men một cách tỷ mỷ hơn người ta thường sử dụng các loạithuốc nhuộm để nhuộm cả tế bào hoặc một số phần tế bào nấm men Có thể dùng một trongnhững loại dung dịch thuốc nhuộm sau đây:

- Dung dịch Lugol:

Iot 2g

Iodua Kali 4g

Nước cất 100ml

(Nghiền nhỏ I và KI trong cối sứ rồi sau đó dùng nước hoà tan dần)

- Dung dịch xanh methylen (methylene blue)

- Dung dịch fuchsin cacbolic:

Có thể dùng que cấy, phết dịch nuôi cấy nấm men thành một lớp mỏng trên phiến kính sau

đó làm khô, cố định và nhuộm đơn bằng xanh methylen hay fuchsin cacbolic như khi nhuộmtiêu bản vi khuẩn Thường người ta dùng lamelle (lá kính mỏng) để quan sát tế bào nấm men.Lấy một phiến kính sạch nhỏ lên đó một giọt thuốc nhuộm (xanh methylen chẳng hạn) Giọtthuốc nhuộm không nên to quá (về sau sẽ tràn khỏi lamelle), cũng không nên nhỏ quá (tạo thànhnhiều bọt khí khi đậy lamelle) Lấy một ít nấm men đã nuôi cấy 2-3 ngày hoà vào giọt thuốcnhuộm Đặt một cạnh của lamelle sát vào phía ngoài giọt mẫu rồi hạ từ từ lamelle xuống chogiọt mẫu tràn đều khắp lamelle Nếu tràn ra ngoài thì dùng giấy lọc thấm bớt Soi ở vật kính nhỏtrước, sau đó chuyển sang vật kính lớn Có thể căn cứ vào mức độ bắt màu đậm nhạt để phânbiệt được tế bào sống và tế bào chết Muốn quan sát các hạt glycogen trong tế bào nấm men thìnhuộm bằng dung dịch Lugol Tế bào sẽ có màu vàng nhạt còn các hạt glicogen có màu đỏ nâu.Muốn quan sát các giọt mỡ trong tế bào nấm men có thể làm tiêu bản như sau:

Rỏ một giọt formalin lên phiến kính, dùng que cấy lấy một ít nấm men đã nuôi cấy 48-72giờ hoà vào giọt formalin Để yên 5 phút sau đó thêm một giọt dung dịch thuốc nhuộm xanhmethylen, lại thêm một giọt thuốc nhuộm soudan III Đặt lamelle dưới kính hiển vi rồi quan sát

ta sẽ thấy nguyên sinh chất của tế bào nấm men bắt màu lam nhạt, không bào không bắt màucòn các giọt mỡ có màu đỏ hồng

- Thuốc nhuộm soudan III:

Soudan III 0,05g

Cồn 90% 100ml

Cũng có thể nhuộm các giọt mỡ bằng phương pháp sau đây: Lấy thuốc nhuộm đen Soudan

B (Soudan black B) cho vào ống nghiệm Dùng que cấy lấy một ít nấm men hoà vào dịch thuốcnhuộm này Giữ 20 phút Lấy khoảng 2 vòng que cấy dịch thuốc nhuộm có nấm men phết lênphiến kính Làm khô tự nhiên Nhuộm tiêu bản trong 30 giây bằng dịch thuốc nhuộm safranin.Rửa nước, đợi khô rồi soi kính Nguyên sinh chất của tế bào nấm men sẽ có màu đỏ nhạt còncác giọt mỡ có màu đen lam

Muốn nhuộm nhân của tế bào nấm men có thể sử dụng phương pháp sau đây:

Lấy một giọt nước đặt lên 1 phiến kính Dùng que cấy lấy một ít nấm men hoà vào giọtnước đó rồi dàn thành vết mỏng Làm khô tự nhiên Thêm vài giọt dung dịch picroformol, giữvài phút sau đó rửa bằng cồn 70% Ngâm tiêu bản vào trong dung dịch FeNH4(SO4).12H2O 3%trong 4-7 giờ Lấy tiêu bản ra dùng nước rửa sạch sau đó lại ngâm vào dịch thuốc nhuộmhematoxilin 10% trong 24 giờ Lấy ra rửa nước rồi lại ngâm vào dịch FeNH4(SO4).12H2O chođến khi vừa mất màu thì lấy ra rửa sạch bằng nước, làm khô rồi soi kính Nguyên sinh chất của

tế bào nấm men có màu tro còn nhân tế bào có màu đen

Để quan sát tế bào nấm men có thể dùng dung dịch nigrozin 5% Khi đó tế bào sẽ khôngbắt màu, có thể phân biệt rõ trên một nền màu lam đen

1.3.1.3 Quan sát quá trình nảy chồi của tế bào nấm men

(sử dụng cho tế bào nấm men dinh dưỡng không có dạng sợi - non filamelletous vegetativecells)

Cấy một vòng que cấy tế bào nấm men một ngày tuổi vào bình nón loại 100ml chứa 30mlmôi trường dịch thể (môi trường nước chiết mạch nha, môi trường cao nấm men-pepton-glucozahay môi trường mạch nha - cao nấm men - glucoza - pepton)

Nuôi cấy trong bình nón ở 25-280C sau hai đến ba ngày tiến hành lấy mẫu quan sát Khiquan sát dưới kính hiển vi cần phân biệt được là nấm men sinh sản theo cách nảy chồi hay phâncắt hoặc cả hai

- Nếu nảy chồi thì chồi xuất hiện ở đâu? ở cả hai đầu (hai cực) hay ở vị trí bất kỳ nào trên

tế bào? Số lượng chồi trên tế bào mẹ?

- Chồi con sau khi phát triển có rời khỏi tế bào mẹ hay không?

- Dạng và kích thước của tế bào? Chú ý: phương pháp này phải dùng với các môi trườngxác định và ở pha sinh trưởng logarit của tế bào

1.3.1.4 Quan sát khuẩn ty giả:

Có một số nấm men khi phát triển trong những môi trường nuôi cấy lâu hay trong nhữngđiều kiện thiếu oxy có thể tạo thành những tế bào dài, xếp nối tiếp nhau, được gọi là khuẩn ty(mycelium) Người ta phân biệt hai loại khuẩn ty: khuẩn ty giả và khuẩn ty thật Khuẩn ty thật làcác tế bào dạng sợi có vách ngăn, khuẩn ty giả là các tế bào dạng sợi không có vách ngăn Việctạo thành khuẩn ty là một đặc điểm quan trọng trong phân loại nấm men Cũng có một ít loạinấm men khi phát triển bình thường cũng tạo thành khuẩn ty giả (pseudomycelium)

Muốn kiểm tra việc tạo thành khuẩn ty người ta thường nuôi cấy nấm men trên môi trườngpepton - glucoza, môi trường khoai tây - glucoza hay môi trường ngô

Đổ môi trường vào hộp Petri Dùng que cấy, cấy nấm men thành 3 cặp đường song songngắn, ở 3 chỗ Dùng panh lấy lá kính mỏng (thường xuyên ngâm trong còn 70%) đốt nhẹ hếtcồn, để nguội một chút rồi cẩn thận đặt nhẹ nhàng lên vết cấy Phải cấy thế nào để hai đườngcấy song song ở mỗi chỗ có chiều ngang nằm gọn giữa lá kính mỏng, hai đầu dài hơn lá kínhmỏng một chút (để sau này dễ quan sát) Cần chú ý là bề mặt thạch phải thật khô, khi đậy lákính mỏng, phải tránh bọt khí, đậy xong phải tránh di chuyển làm xô lệch lá kính mỏng

Cũng có thể tiến hành theo phương pháp sau đây: đổ môi trường vào một hộp Petri, đợinguội 600C, dùng panh lấy các phiến kính (lamelle) đặt nhẹ vào để sao cho có một lớp môitrường bám vào tạo thành lớp mỏng trên một mặt của phiến kính Lấp ba phiến kính đã phủ môitrường như vậy đặt vào hộp Petri khác Trong hộp Petri này có đựng một ít nước vô trùng vàmột giá thuỷ tinh hình chữ U (các phiến kính đặt thẳng góc so với giá thuỷ tinh) Cấy nấm menthành ba vết trên mỗi phiến kính Phải cấy ba vết này cách nhau như thế nào để trên mỗi vết cóthể đặt vừa một lá kính mỏng (các vết cấy song song với chiều rộng của phiến kính) Sau khi đặt

lá kính một cách nhẹ nhàng và cẩn thận ta đậy hộp Petri lại và nuôi cấy ở 25-300C trong 4-5ngày Lấy ra và quan sát các vết cấy dưới kính hiển vi

Một vài phòng thí nghiệm làm theo cách sau: nhỏ một ít môi trường thạch nóng lên trên

bề mặt phiến kính, láng đều để tạo thành một lớp thật mỏng Sau khi khô bề mặt, cấy một hoặc

2 đường dọc theo lam Lấy lá kính mỏng đặt lên trên mỗi đường cấy Đặt phiến kính vào đĩaPetri và cho một ít nước vô trùng để tránh khô môi trường Quan sát trên kính hiển vi trong vàingày

Với các phương pháp trên rất dễ dàng quan sát thấy việc tạo thành khuẩn ty ở một số loạinấm men

1.3.1.5 Quan sát bào tử bắn (Ballistoconidium, Ballistospore):

Lấy 10-15ml môi trường nước chiết mạch nha, môi trường khoai tây - glucoza hay môitrường bột ngô đưa vào một đĩa Petri khi thạch đông (nhớ làm khô vô trùng mặt thạch) lấy quecấy để cấy nấm men theo hai đường vuông góc ở giữa sau đó úp ngược lên một đĩa Petri khác

chứa cùng môi trường nhưng không cấy nấm men Trong đĩa Petri này chứa 1 lamelle vô trùng,

để ở 200C sau 3 tuần bào tử bắn sẽ tạo thành các khuẩn lạc trên đĩa Petri chứa môi trường ở phíadưới và lấy phần lamelle mang các bào tử bắn để đưa đi quan sát dưới kính hiển vi

Cũng có thể phát hiện bào tử bắn theo các cách khác như sau:

Cấy các loại nấm men nghi ngờ có hình thành bào tử bắn lên môi trường thạch - mạch nha(trên đĩa Petri hay ống nghiệm thạch nghiêng) Sau mấy ngày nuôi cấy trên mặt thủy tinh đốidiện với vết cấy sẽ có một hình ảnh mờ giống hệt với hình dáng vết cấy Đó là các bào tử bắn đãbắn ra lưu lại trên phía đối diện vết cấy

Hoặc cấy nấm men theo đường thẳng hoặc zich zăc vào đĩa Petri chứa môi trường bột ngô,

để ở 200C sau từng thời điểm 3, 5,7,10, 15 ngày Úp ngược đĩa Petri lên một phiến kính sạch, đểqua đêm Quan sát bào tử bắn trên phiến kính trên kính hiển vi

1.3.1.6 Quan sát bào tử túi (ascospore):

Một số nấm men có khả năng hình thành bào tử hữu tính gọi là bào tử túi (ascospore hay

asconidium) Bào tử túi có khả năng bảo vệ nấm men chống lại với nhiều ảnh hưởng có hại của

điều kiện ngoại cảnh Thường quan sát thấy bào tử túi của nấm men trong những môi trườngnuụi c?y lõu Có thể là do việc tích luỹ một số sản phẩm trao đổi chất đã kích thích quá trình tạothành bào tử túi Trong tế bào của mỗi loại nấm men sinh bào tử túi thường tạo thành một sốlượng bào tử túi nhất định Khi chứa bào tử túi thì tế bào được gọi là túi (asci, số ít - ascus).Thường mỗi túi có 4 bào tử, một số loài chỉ có 1-2 bào tử, một số rất ít loài lại có tới 8 bào

tử Bào tử túi ở nấm men có hình dạng rất khác nhau, đây cũng là một đặc điểm thường dùng

khi phân loại nấm men Saccharomyces cerevisiae và rất nhiều loài nấm men khác có bào tử túi hình cầu hay hình trứng Hansenula anommala, Hanseniaspora có bào tử túi hình bán cầu, phía dưới có mép như vành mũ, Pichia membranaefaciens có bào tử túi vô quy tắc (có thể có hình trứng, dài, tam giác, bầu dục, bán cầu ), Hansenula saturnus có hình bào tử túi hình quả xoài, ở giữa có một vành đai nhỏ Bào tử túi Schawanniomyces occidentalis cũng có hình dạng tương tự

như vậy nhưng bề mặt có gai Một số loại nấm men lại có bào tử túi dài, có khi hình xoắn.Thường thường nấm men tạo thành bào tử túi sau 5-10 ngày nuôi cấy trên môi trường thạchmạch nha Muốn quan sát chỉ việc lấy một ít nấm men làm tiêu bản soi tươi không cần nhuộmmàu Mục đích việc quan sát bào tử túi phải trả lời ba câu hỏi sau đây:

• Nấm men có hình thành bào tử túi hay không

• Bào tử túi hình thành từ các tế bào dinh dưỡng không xảy ra sự tiếp hợp trước đóhay là sau khi có sự tiếp hợp giữa hai tế bào dinh dưỡng; cũng có thể là xảy rasau khi có sự tiếp hợp giữa tế bào mẹ và tế bào con (tế bào nảy chồi) của nó

• Nghiên cứu hình dạng bào tử và số lượng của bào tử túi

Cách tiến hành:

Nấm men ‘trẻ’ sau khi nuôi cấy qua đêm được đưa vào môi trường malt cao nấm men glucoza - pepton và để 2-3 ngày sau đó đưa chuyển vào môi trường sinh bào tử Giữ ở 250Ctrong 3 ngày và quan sát dưới kính hiển vi Nếu không quan sát thấy bào tử thì lại tiếp tục giữ

-và quan sát từng tuần cho đến 6 tuần liền Các môi trường hình thành bào tử có thể được sửdụng là môi trường: V-8-agar, Gorodkowa-aga, acetat-agar, malt-yeast-glucoza, pepton-agar,malt-acetat-agar Tuy nhiên thường sử dụng các môi trường sau:

Chú ý: Quan sát bào tử túi là đặc điểm quan trọng trong phân loại, tuy nhiên trong một sốtrường hợp khó có thể phát hiện thấy bào tử túi Điều này có thể do các nguyên nhân sau:

- Môi trường sinh bào tử túi là không thích hợp

- Chủng nghiên cứu là dị tản (heterothalic) hay đồng tản (homothalic)

- Bào tử túi khó phát hiện và do người làm phân loại còn thiếu kinh nghiệm

- Nấm men nghiên cứu thuộc loại không sinh bào tử túi (anascoporogenous)

1.3.1.7 Quan sát đặc tính nuôi cấy

Để quan sát các đặc tính nuôi cấy của nấm men người ta thường cấy nấm men lên môitrường dịch thể, môi thường thạch nghiêng và môi trường thạch đĩa (hoặc dùng chai Roux) Cấynấm men vào các ống nghiệm đựng 3ml môi trường mạch nha 10-150 Baling (xem phần “Quansát hình thái tế bào nấm men và đo kích thước”) Nuôi cấy ở 250C rồi sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ

và 198 giờ lấy ra quan sát Cần quan sát xem nấm men có phát triển ở bề mặt dịch thể haykhông Nếu có thì chúng tạo thành váng phủ kín, váng phủ không kín hay tạo thành một vòngquanh thành ống nghiệm Nấm men có lắng xuống thì quan sát xem cặn có dạng xốp, dạng nhàyhay dạng rắn chắc Quan sát xem chất dịch vẫn trong hay đã trở nên đục Dùng tay đập khẽ vàođáy ống xem cặn có nổi lên hay không (nếu cặn xốp thì dễ nổi lên, nếu cặn rắn chắc thì khó nổilên) Dùng que cấy khều cặn, nếu cặn nhày thì dễ khều lên cả tảng, nếu không thì khó khều Nếu

có váng thì cần quan sát xem bề mặt váng như thế nào, khô hay ướt, phẳng mịn hay nhăn nheo

và cũng cần quan sát xem váng dày hay mỏng Để quan sát sự phát triển của nấm men trên môitrường thạch nghiêng ta cấy nấm men lên trường thạch - mạch nha 12-150 Baling sau đó để ở tủ

ấm 25-300C Quan sát ở ngày nuôi cấy thứ 3 và thứ 14 Chú ý quan sát xem bề mặt của vết cấy

là trơn nhẵn hay xù xì, ướt bóng hay khô, có nếp nhăn hay không, màu sắc thế nào, mép thẳnghay mép răng cưa v.v Để quan sát khuẩn lạc ta đem môi trường thạch - mạch nha hoặc môitrường gelatin - mạch nha phân vào các hộp Petri hay bình Roux, bình Kolle Dùng que cấy cóđầu nhọn cấy nấm men thành một chấm ở chính giữa Trước khi cấy cần làm khô bề mặt (lớpthạch nên đổ dầy khoảng 5mm) Nuôi cấy ở 250C trong 14 đến 30 ngày Lấy ra quan sát khuẩnlạc lớn Cần chú ý miêu tả:

- Kích thước khuẩn lạc (vẽ hình)

- Chiều dày khuẩn lạc (phải vẽ hình cắt ngang khuẩn lạc).

- Có tạo thành những vòng đồng tâm hay không?

- Có những hình tia phóng xạ hay không? (từ tâm đến giữa hay từ giữa đến mép?)

- Giữa khuẩn lạc lồi lên, lõm xuống hay phẳng?

- Bề mặt trơn, nhẵn, bóng, ướt hay xù xì, ráp, có cấu tạo nhung hay gai, có nếp nhăn haykhông?

- Màu sắc khuẩn lạc

1.3.1.8 Thí nghiệm xác định khả năng lên men các loại đường

Khả năng lên men các loại đường là một trong những chỉ tiêu quan trọng được sử dụng đểphân loại nấm men Trong thí nghiệm này người ta thường sử dụng môi trường nước chiết giáđậu hay môi trường chiết nấm men 0,5%

- Cách làm môi trường nước chiết giá đậu: cân 200g giá đậu thêm 1000ml nước Đun sôi

30 phút Lọc lấy dịch trong rồi thêm nước cho đủ 1000ml

- Cách làm môi trường nước chiết nấm men: cân 200g men bia ép (hay 100g men bia khô)thêm 1000ml nước Hấp bằng nồi hấp áp lực trong 15 phút ở nhiệt độ 1200C Lọc nóng quanhiều lớp giấy lọc Lại lọc nguội tới trong Thêm nước cho đủ 1000ml Cũng có thể dùng caonấm men với nồng độ sử dụng là 0,5%

- Quan sát việc tạo CO2 ở đáy ống Durham để biết nấm men có hay không có khả năng lênmen từng nguồn đường Có nấm men chỉ có thể phát triển ở bề mặt dịch huyền phù và chúng cókhả năng đồng hoá các nguồn đường này

- Chú ý: Theo phương pháp này một số trường hợp CO2 tạo ra thấp phải xác định bằngđiện cực CO2 hay dùng áp kế Warburg Trong điều kiện có quá ít lượng đường dùng làm thínghiệm còn có thể hút môi trường chứa đường (và cấy nấm men) vào những micropipet (hútđến 1/10ml) Đầu pipet sau đó được gắn bằng vaselin (đã trộn thêm với một ít parafin) Nuôicấy ở 25-300C và hằng ngày quan sát xem có bọt khí sinh ra hay không, mức môi trường bị đẩy

ra xa nhiều hay ít Các thí nghiệm được tiến hành đầu tiên bằng glucoza Nếu nấm men có khả

năng lên men glucoza thì hãy làm tiếp thí nghiệm với các loại đường khác Mỗi ngày quan sátkết quả lên men một lần, quan sát trong 10 ngày liền.

1.3.1.9 Thí nghiệm xác định khả năng đồng hoá các hợp chất carbon khác nhau:

Đây là đặc điểm sinh lý quan trọng dùng trong phân loại Có 2 phương pháp chủ yếu đượcdùng là phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường dịch thể và môi trườngđặc Tuy nhiên còn có thể sử dụng phương pháp dùng con dấu trên môi trường đặc

1.3.1.9.1 Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường dịch thể:

- Sử dụng ống nghiệm có kích thước 100x15mm Các ống nghiệm chứa 1,8 ml môi trườngnitơ cơ sở (Nitrogen base) không có carbon và 0,2 ml nguồn carbon 10X Các ống thí nghiệmchứa 1% nguồn carbon nghiên cứu khác nhau (tương đương 50mM), đồng thời làm một ốngnghiệm kiểm tra âm (không có nguồn carbon nào) và một ống kiểm tra dương dùng nguồncarbon là D-glucoza

- 46 nguồn carbon gồm: glucoza, galactoza, L-sorboza, sucroza, maltoza, xenlobioza,trelaloza, lactoza, melibioza, raffinoza, melezitoza, inulin, tinh bột tan, D-xyloza, L-arabinoza,D- arabinoza, D-riboza, L-rhamnoza, D-glucosamin, N-acetyl-D-glucosamin, methanol, ethanol,glycerol, erythritol, ribitol, galactitol, D-mannitol, D-glucitol, a- metyl-D-glucosid, salicin,glucono-d-lacton, D-gluconat, 2-ketogluconat, 5-ketogluconat, DL-lactat, succinat, citrat,inositol, hexandecan, saccharat, xylitol, L-arabinitol, propan 1,2 diol, butan 2,3 diol, D-glucuronic acid, D-galacturonic acid

- Giống gốc được chuẩn bị trên môi trường thạch - pepton - glucoza - cao men - malt đểqua đêm Sau đó tế bào được lấy ra và pha trong môi trường nitơ cơ sở đạt tới mật độ tế bào là25x106/ml (hay mật độ A640 = 1,0)

- Sau đó lấy ra 100ml

cấy vào các ống môi trường đã chuẩn bị sẵn, sau đó để tĩnh hay lắc tay từng lúc (hàngngày) Cũng có thể lắc nghiêng bằng máy lắc ngang (góc lệch 15-400) hay lắc tròn với các nấmmen có độ lắng cao

Đánh giá sự sinh trưởng thường là dùng mắt so với hai ống dương và âm bằng cách đặtmột miếng bìa trắng vạch một đường đen và đặt đằng sau các ống nghiệm để so sánh Tuy nhiên

có thể dùng phương pháp so màu để so sánh với các đường chuẩn được vẽ từ sinh khối khô(cách này thường ít được dùng với các tế bào nấm men có các tế bào kết dính với nhau) Thínghiệm có thể kéo dài trong một tuần hoặc có thể đến 4 tuần

1.3.1.9.2 Sinh trưởng trên môi trường thạch

ống nghiệm có chứa 15ml môi trường thạch nitơ cơ sở ở 450C sau đó thêm 0,5 ml dịchhuyền phù tế bào nấm men được chuẩn bị như đã mô tả ở trên và lắc cho đều (tránh tạo bọt)

Các bước phải thao tác nhanh để thạch không bị đông và nấm men không bị chết Sau đó đổtoàn bộ ra đĩa Petri vô trùng để 370C sau 30 phút cho đông thạch Có thể sau đó úp ngược để

370C trong 90 phút để khô mặt thạch Sau đó đặt từ 2-5mg từng loại đường (nguồn carbon)nghiên cứu lên trên bề mặt thạch gần mép đĩa Petri Thông thường trong một đĩa dùng 3 loạiđường khác nhau như: Đĩa thạch được chia làm 4 góc, 1 góc không cho nguồn carbon nào (tuynhiên phải làm thí nghiệm kiểm tra cả với D-glucoza) Theo dõi kết quả sau 48 giờ đến 1 tuần

1.3.1.9.3 Phương pháp dùng con dấu

Đĩa Petri gốc chứa môi trường malt - cao men - glucoza - pepton - thạch chứa khoảng 25khuẩn lạc nấm men nghiên cứu khác nhau Sau đó dùng con dấu nhung vô trùng in lên các đĩathạch có nguồn carbon khác nhau (0,5% = 25 mM) (chú ý đánh dấu vị trí của các đĩa để khỏi bịnhầm lẫn) Một lần in từ đĩa gốc có thể in lên 10 đĩa khác nhau bắt đầu là đĩa đối chứng âm(không chứa nguồn carbon nào) và cuối cùng là đĩa đối chứng dương (chứa D-glucoza)

Chú ý thạch sử dụng phải là loại thạch tốt không chứa một thành phần carbon dễ bị đồnghoá nào Theo dõi thí nghiệm từ 48 giờ đến 1 tuần

1.3.1.10 Thí nghiệm xác định khả năng đồng hoá các nguồn nitơ

Có khoảng 1/4 các chủng nấm men có khả năng sử dụng nitrat vì vậy đây là đặc điểm cầncho phân loại Tuy nhiên các thành phần khác nhau như nitrite, ethylamine, L-lysine, sunfatamôn, cadaverine cũng cần cho các thí nghiệm phân loại Phương pháp tiến hành thí nghiệm ởđây tương tự như các nghiên cứu với việc sử dụng các hợp chất carbon ở trên với cả môi trườngdịch thể và môi trường đặc nhưng ở đây dùng môi trường carbon cơ sở (carbon base) và phảinuôi nấm men trên môi trường carbon cơ sở trong 2 ngày trước khi cấy vào các nguồn nitơ

Do nitrit độc cho nấm men và nó dễ được hình thành trong môi trường acid do đó pH môitrường phải được điều chỉnh đến 6,5 Dùng phương pháp đánh giá sự sinh trưởng là phù hợpcho việc nghiên cứu khả năng sử dụng nitrit và ethylamin Trong đó lượng nitrogen được dùngnên là 2-5mM (0,05-0,1%) Tuy nhiên có thể quan sát thấy sự sinh trưởng ở mức độ thấp ở cácống kiểm tra (không có nitơ) do lượng NH3 ở khí quyển hoà tan vào môi trường

1.3.1.11 Thí nghiệm xác định khả năng hình thành hợp chất loại tinh bột:

Lodder và Kreger - van Rij đã sử dụng thí nghiệm này để phân biệt hai giống nấm men

Torulopsis (không hình thành hợp chất loại tinh bột) và Cryptococcus (hình thành hợp chất loại

tinh bột)

1.3.1.12 Thí nghiệm xác định nhu cầu vitamin cho sinh trưởng của nấm men:

Các nấm men khác nhau có nhu cầu khác nhau về vitamin để sinh trưởng Các thí nghiệm

ở đây nhằm kiểm tra sự sinh trưởng của chủng nấm men vắng mặt tất cả hay từng loại vitaminkhác nhau

Cách tiến hành như sau:

Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường dịch thể Môi trường có đầy đủ các thành phầndinh dưỡng trừ vitamin (môi trường không chứa nguồn vitamin nào) Toàn bộ ống nghiệm thínghiệm được chia thành hai lô Một lô không có mặt bất kỳ một loại vitamin nào và một lô thiếutừng vitamin lần lượt theo thứ tự dưới đây (lượng vitamin cho 1 lít môi trường)

1.3.1.13 Đánh giá sự sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường cao

Một số nấm men có khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường cao so vớicác chủng khác

Thí nghiệm được tiến hành như sau: ống thạch nghiêng được chuẩn bị với cao nấm men vàthạch có lượng đường D-glucoza đạt 50% (W/W) Sau đó giống nấm men được cấy vào vàkiểm tra sự sinh trưởng ở 250C trong 4 tuần Chú ý tránh cho môi trường bị khô bằng cách bọcbằng giấy nến (wax-paper)

1.3.1.14 Đánh giá sự phát triển khi có mặt Cycloheximit

Thí nghiệm tiến hành trong môi trường có cao nấm men, nguồn nitơ và D-glucoza nhằmđánh giá khả năng sử dụng D-glucoza khi bổ sung xycloheximit (đã được lọc vô trùng) với nồng

độ 0,1% hay 0,01%

Xycloheximit ức chế sự sinh trưởng của Eukaryota bằng các ức chế quá trình sinh tổnghợp protein ở riboxom loại 80S Các nấm men có khả năng chống lại được xycloheximit có thể

đã có thay đổi về loại riboxom này

1.3.1.15 Xác định hoạt tính phân giải Urea (hay hoạt tính Ureaza)

Đun tan môi trường Christensen, thêm 6ml dung dịch đỏ phenol (phenol red) có nồng độ0,2% trong cồn Khử trùng môi trường ở nồi hấp (1150C/15 phút) Đợi nguội đến 500C thêm100ml dung dịch urea (dung dịch 20% khử trùng riêng qua màng lọc) Phân vào ống nghiệmthủy tinh vô trùng, làm thạch nghiêng Sau đó cấy nấm men và giữ ở 260C trong 7 ngày Nếunấm men có khả năng sinh ureaza để phân giải urea thì môi trường sẽ chuyển màu đỏ xẫm.Cũng có thể tiến hành thí nghiệm với môi trường dịch thể

1.3.1.16 Thí nghiệm làm đổi màu Diazonium blue B (DBB test)

Một ống giống được cấy trên môi trường pép ton - cao men - glucoza - malt - thạch 10ngày tuổi và giữ ở 50C trong vòng vài giờ Sau khi đổ dung dịch DBB lạnh (ice - cold) lên trên

Nếu môi trường chuyển sang màu đỏ sẫm trong 2 phút ở nhiệt độ phòng, kết quả được coi làdương tính.

Dung dịch DBB được giữ trong lạnh băng (ice - cold) và được dùng trong ít phút trước khi

nó mất màu Chuẩn bị dung dịch này bằng cách hoà tan muối DBB (Brentamine Blue B củahãng ICI Ltd., hay Hoechst AG) trong đệm Tris HCl 0,1M, trong lạnh, pH = 7,0; nồng độ1mg/ml

Chương 2: Giới thiệu về nấm men sử dụng trong bánh mì 2.1 Tên gọi:

Saccharomyces là một chi nấm men được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như

làm bánh mì, sản xuất cồn Saccharomyces có nghĩa là nấm đường và là loại vi sinh vật duy

nhất đuợc sản xuất với quy mô rất lớn trên thế giới

Đặc điểm sinh lý: Lên men : +

Đồng hoá nitrat :

Màng trên môi trường dịch thể :

Cơ chất giống tinh bột :

Đồng hóa inositol :

Hoạt hoá Ureaza :

Hóa lỏng gelatin :

Phản ứng DBB : -

2.2 Vài nét lịch sử về nấm men trong sản xuất bánh mì [1]

Nấm men sử dụng trong sản xuất bánh mì là nấm men Saccharomyces cerevisiae Loài

người sử dụng nấm men để làm nở bánh mì từ trước khi biết được hình thái, cấu tạo và đặctính sinh lý, sinh hóa của chúng

Lúc đầu, người Châu Âu để bột mì lên men tự nhiên và làm bánh Người ta thấy nếu đểbột mì lên men tự nhiên thì khối lượng bột sẽ nhiều hơn và khi nướng bánh sẽ có mùi thơm và

vị chua hấp dẫn, nhưng người ta không biết tại sao lại thế

Sau đó, vào thế kỷ 17 người Châu Âu không cho bột mì lên men tự nhiên nữa mà sử

dụng nấm men bia để nhào bột Kết quả của việc làm này là khối bột nở đều hơn, bánh thơmhơn, đặc biệt là không chua như cho ủ tự nhiên.

Năm 1850 bắt đầu giai đoạn rất quan trọng trong sự phát triển của công nghệ sảnxuất nấm men bánh mì Người Châu Âu đã biết sản xuẩt sinh khối nấm men bánh mì dạngnhão (dạng paste) Lúc đầu họ lấy cặn nấm men từ quá trình sản xuất rượu, chuyển cặn nấmmen này sang thùng đựng nấm men, rửa sạch nấm men bằng nước lạnh và đưa vào máy ép vít.Năm 1878, L Pasteur nghiên cứu ảnh hưởng của oxy đến sự phát triển của nấm men.Kết quả cho thấy khi có mặt oxy hiệu suất thu nhận nấm men rất cao Khó khăn nhất trongviệc cung cấp oxy cho quá trình lên men ở giai đoạn này là người Châu Âu sử dụng môitrường nhão, do đó oxy rất khó phân tán đều vào khối nhão này

Năm 1886, người Châu Âu bắt đầu thay đổi môi trường Người ta không dùng môitrường nhão nữa mà sử dụng dung dịch nước đường Bột lúa mì hay đại mạch được thủy phânthành đường, sau đó người ta dùng nước đường này để sản xuất nấm men Năm 1900, người

ta sử dụng máy ly tâm tốc độ cao để tách nước ra khỏi nấm men và phương pháp nuối cấy nấmmen được hoàn thiện dần

Sau đó, người ta thay bột thủy phân bằng mật rỉ hoặc phế liệu nhà máy đường, nhà máybánh kẹo Lượng đường dùng để lên men cũng giảm dần, lưu lượng khí được tăng lên đểtăng khả năng hô hấp của nấm men

Năm 1916, xuất hiện nhà máy đầu tiên thực hiện những cải tiến này Năm 1940 nhà máymen bánh mì lớn nhất Châu Âu với công suất 16500 tấn / năm được xây dựng ở Moscow Từ đóđến nay, hầu như nước Châu Âu nào cũng có hàng chục nhà máy lớn, nhỏ sản xuất nấm men bánh mì

2.3 Phân loại:

Giống [Chi] Saccharomyces có khoảng 40 loài (van der Walt, 1970) và các loài

trong giống này được biết nhiều do chúng được ứng dụng trong làm nổi bánh, bia, rượu,

… chúng hiện diện nhiều trong sản phẩm có đ ường, đất, trái cây chín, phấn hoa,…

Một số loài đại diện:

 Saccharomyces bayanus

 Saccharomyces boulardii

 Saccharomyces bulderi

 Saccharomyces cariocanus

Trong đó, loại được con người sử dụng phổ biến nhất là Saccharomyces

cerevisiae, nó được dùng để sản xuất rượu vang, bánh mì và bia từ hàng nghìn năm trước.

2.4 Đặc điểm hình thái và kích thước.

Nấm men saccharomyces có hình bầu dục, gần tròn, kích thước khoảng 6 - 8 µm x 5 - 6µm

Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, từ

Sự khác nhau giữa nấm men nổi và nấm men chìm: là khả năng lên men các loại đườngtrisaccharide, ví dụ raffinose Trong nấm men chìm có enzyme có thể sử dụng hoàn toàn đườngraffinose, trong khi đó nấm men nổi chỉ sử dụng được 1/3 đường saccharose

Ngoài ra chúng còn khác nhau về khả năng hô hấp, khả năng trao đổi chất khi lên men vàkhả năng hình thành bào tử Quá trình trao đổi chất của nấm men chìm chủ yếu xảy ra trong quátrình lên men, còn của nấm men nổi xảy ra mạnh trong quá trình hô hấp, vì vậy sinh khối nấmmen nổi thu được nhiều hơn nấm men chìm Nấm men chìm có nồng độ enzyme thấp hơn nấmmen nổi Khả năng tạo bào tử của nấm men chìm lâu hơn và hạn chế hơn nấm men nổi.

Hình 11: Cấu tạo nấm men 2.6 Thành phần hóa học:

Thành phần hoá học của tế bào nấm men Saccharomyces khác nhau tuỳ thuộc vào điều

kiện môi trường nuôi cấy, thành phần các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và tìnhtrạng sinh lý của tế bào.

Nấm men ép có chứa 70-75% nước, 25-30% còn lại là chất khô

Nước: bao gồm phần nước nằm bên ngoài tế bào và phần nước nằm trong tế bào.Lượng nước khác nhau tuỳ thuộc vào chủng nấm men, kỹ thuật nuôi và phương pháp thu tếbào Ví dụ: khi nuôi trong môi trường NaCl thì lượng nước trong tế bào giảm

Thành phần chất khô của tế bào nấm men bao gồm protein và các chất có nitơ khácchiếm 50% , chất béo 1,6%, hydratcacbon 33,2%, mô tế bào 7,6%, tro 7,6% Thành phầncủa những chất này không cố định, nó có thể thay đổi trong quá trình nuôi cấy cũng như quátrình lên men

Hydratcacbon gồm: polysaccharide, glycogen, trehalose (12 -12,5%), mannan 24,9%), glucan (9,47-10,96%) và chitin Những nghiên cứu động học về sự biến đổihydrat cacbon trong quá trình bảo quản nấm men cho thấy là glucan, mannan và dạngglycogen tan trong kiềm và axit clohydric là yếu tố cấu trúc của tế bào, trong khitrehalose và glycogen tan trong axit acetic, là chất tạo năng lượng chính cho tế bào Hàmlượng trehalose trong nấm men có liên quan đến tính bền vững của nó: lượng trehalose càngcao nấm men càng bền

(18,7-Chất mỡ của nấm men là mỡ trung tính glycerol, photpho lipide, sterol tự do và nhiều sterol, este

Tro chiếm 6,5-12% lượng chất khô trong nấm men và dao động tùy theo môi trườngnuôi cấy

2.7 Các chất dinh dưỡng cho nấm men.

Trong công nghiệp vi sinh, môi trường nuôi cấy tốt nhất là môi trường cho hiệu suất thuhồi sản phẩm cao nhất, trong thời gian ngắn nhất với giá thành thấp nhất đối với mỗi chủng visinh vật

Nguồn thức ăn chủ yếu cho nấm men là các chất hữu cơ ở dạng dễ hấp thu và các chất vô

cơ Ngoài ra, để nấm men phát triển bình thường cần một lượng nhỏ các yếu tố vi lượng và cácchất kích thích Nguồn thức ăn cho nấm men rất đa dạng, do đó cần nghiên cứu riêng từngnguồn

Đường disaccharide quan trọng cần quan tâm tới là saccharose, lactose, melibiose Nấmmen đồng hóa lên men rất tốt maltose và saccharose, đồng hóa một phần hoặc hoàn toànđường lactose Riêng melibiose chỉ lên men được khi có enzyme melibiozase.

Nấm men nổi ( lên men nổi ) chỉ lên men được 1/3 rafinose sau khi phân giải ra một phân

tử fructose và melibiose Nấm men chìm (lên men chìm ) có khả năng thủy phân hoàn toànrafinose do có enzyme invertase và melibiozase

Các polysaccharide cần được thủy phân hoàn toàn bằng axit hoặc enzyme thì nấm menmới có thể sử dụng được

2.7.3 Nguồn nitơ

Ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp cho tế bào nguyên liệu để hình thành cácnhóm amin (-NH2) và imin (-NH-) để tổng hợp nên protein và các hợp chất khác củanguyên chất Nấm men đồng hóa được các hợp chất axit amin và nitơ vô cơ Dễ đồng hóa hơn

cả là ion NH4+ và ammoniac NH3 với lượng sử dụng lớn nhất là 20 – 35 mg N2/109 tếbào Nguồn nitơ được coi là tốt nhất và được đồng hóa hoàn toàn là ure:

Nấm men có thể tự tổng hợp axit amin Tuy nhiên, nếu cho các axit amin vào môi trườngthì quá trình sinh sản và phát triển của tế bào sẽ nhanh hơn Nấm men đồng hoá các axit aminbằng cách amin hóa (tách NH3 ra khỏi các chất), do đó các nguồn nitơ khác nhau sẽ có ảnhhưởng rất ít tới hàm lượng axit amin trong tế bào nấm men

2.7.4 Các chất khoáng

Trong môi trường dinh dưỡng cần phải có một lượng nhất định các chất khoáng để đảmbảo cho tế bào phát triển Nếu trong môi trường tổng hợp thì các chất khoáng sau đây sẽ

cần thiết cho nấm men:

Bảng 1: Các chất khoáng cần thiết cho nấm men

Nếu nồng độ các chất này trong môi trường ít hơn nồng độ đã nói ở trên thì quá trìnhphát triển sẽ chậm lại, còn nếu nhiều hơn thì áp suất thẩm thấu tăng ức chế quá trình sinh sản.Phospho rất cần thiết cho quá trình tổng hợp các thành phần nguyên sinh chất và cótrong thành phần của coenzyme, dùng để phospho hóa các hydrocacbon trong quá trình oxyhóa Phospho còn tham gia vào các phản ứng năng lượng Nó được cung cấp dưới dạng muốinatri hoặc kali Nếu lượng phospho ít thì tổng hợp protein giảm và tổng hợp lipide tăng

Kali và natri chiếm 1/5 – 3/4 hàm lượng chất tro Nếu thiếu kali hoặc natri trong môitrường nuôi cấy thì quá trình phát triển sẽ bị chậm lại

Magie có khả năng thúc đẩy quá trình sinh sản và tổng hợp riboflavin Hàm lượng magie

có trong tế bào nấm men là 0.3 – 0.4%

Kẽm tuy có rất ít trong môi trường nhưng đóng vai trò cực kỳ quan trọng Nhờ có kẽm,các quá trình oxy hóa xảy ra hoàn toàn và khả năng đồng hóa glucose tăng

2.7.5 Các chất kích thích sinh trưởng

Thường là các vitamin và các axit amin Các loại vi sinh vật khác nhau có nhu cầu vềvitamin khác nhau Đa số các chủng nấm men đang ở giai đoạn nhân giống cần đến isositol,canxi pantothenat, thiamyl và đặc biệt là biotin

Tế bào sử dụng các chất này để tạo tế bào chất Nồng độ của vitamin có thể ảnh hưởng

dến quá trình sinh trưởng và phát triển là 0.01 – 1.10mg/l Các vitamin quan trọng như B1, B3,B6, B7.

2.7.6 Sự hấp phụ chất dinh dưỡng của tế bào nấm men

Hiện nay người ta nhận thấy quá trình dinh dưỡng của nấm men gồm 2 giai đoạn :

• Chất dinh dưỡng qua màng tế bào chất vào tế bào

Chuỗi các phản ứng hóa học, biến đổi chất dinh dưỡng để tổng hợp chất liệu cho tế bào.Môi trường dinh dưỡng chứa những thành phần có áp suất thẩm thấu khác nhau

Các chất không điện tích như đường saccharose, rượu axit hữu cơ, amino axit xâm nhậpqua màng tế bào bằng cách khuếch tán hay vận chuyển thụ động, do sự khác nhau về nồng độcác chất này giữa tế bào và môi trường Các chất điện tích trong dung dịch như muối KCl,magie, canxi và các kim loại khác có thể vào tế bào thụ động theo thang nồng độ hay vận độngngược lại thang nồng độ (vận chuyển hoạt động)

Ngoài nguồn hydratcacbon và nguồn nitơ hoặc vô cơ hoặc hữu cơ, nấm men còn sửdụng các nguyên tố vi lượng như K, Na, Ca, Mg có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng nấmmen Riêng natri có ý nghĩa quan trọng trong sự tăng trưởng của tế bào nấm men Ion natri làthành phần duy nhất di chuyển vào tế bào bằng cả

2 cơ chế: thụ động và hoạt động và khi nó thâm nhập vào tế bào nấm men, mang theo

cả saccharose, amino axit, ngay cả khi không có sự chênh lệch nồng độ các chất này giữa

tế bào và môi trường Kết quả thi nghiệm cho thấy: khi thêm NaCl vào môi trường từ 1,5%, dẫn đến qua trình tổng hợp hoạt động tăng, gia tăng hoạt tính sinh sản của nấm men vàhiệu suất thành phẩm cao hơn, phẩm chất thành phẩm được cải tiến, đồng thời hạn chế sự pháttriển của nấm men lạ

1-Bảng 2.: Ảnh hưởng trên thành phẩm men bánh mì

• Chuỗi các phản ứng hóa học, biến đổi chất dinh dưỡng để tổng hợp chất

Chất dinh dưỡng sau khi vào tế bào nấm men sẽ được biến đổi theo một trong hai conđường sau, tuy điều kiện môi trường và phương pháp nuôi cấy:

C6H12O6 2CH3 CO COOH + 2 H2

CH3CH2OH + 3CO2 [1] 6CO2 + 6 H2O [2]

Trong đó, con đường chủ yếu là tạo cồn Theo quan điểm năng lượng, qua trìnhnày ít kinh tế hơn vì còn nhiều năng lượng trong rượu, trong khi còn đường tạo ra các thànhphần chủ yếu của tế bào Từ những thành phần này khối lượng tế bao gia tăng đến một giớihạn nhất định, sau đó tế bào bắt đầu nảy chồi Vách tế bào mềm đi, chất nguyên sinh của tếbào chui qua vách này, và bắt đầu hình thành vách cho túi sinh chất con Chồi tăng dầnkích thước cho đến khi tách khỏi tế bào mẹ Tùy chủng và điều kiện nuôi, quá trình nàythường mất từ 1-1,5 giờ Cho đến nay chưa rõ là có bao nhiêu tế bào con có thể được sinh

ra từ tế bào mẹ Theo dữ kiện của A.Kyker mỗi tế bào nấm men có khả năng tạo đượctrung bình 25-40 tế bào mới

2.8 Sinh trưởng và sinh sản:

2.8.1 Sinh trưởng:

Quá trình sinh t rưởng của nấm men gồm các pha: pha tiềm sát, pha chỉ số,

pha cân bằng và pha suy vong.Trong tiềm phát nấm men hầu như không sinh s ản,

trong pha thứ hai nấm men bắt đầu nảy chồi mạnh và lên men Trong pha cân b ằng

sinh trưởng, nấm men ổn định v à lên men mạnh Ở pha cuối cùng, sự sinh sản hầu

nh ư ngừng lại và bắt đầu kết lắng

Khả năng kết lắng của nấ m men có vai trò r ất quan trọng Men chìm kết lắng

ở dạng bông dưới đáy các thùng lên men còn men nổi thì nổi lên bề mặt dịch

lên men Tốc độ lên men tuỳ thuộc vào nhiều yếu tố: khả năng l ên men của nấm

men, hoạt tính sinh lý v à số lượng tế bào của chúng trong môi tr ường, phụ

thuộc v ào nhiệt độ, pH, thành phần hoá học của dịch l ên men Ngoài ra còn ph ụ

thuộc vào hàm lượng các chất prôt êin trong tế bào nấm men

2.8.2 Sinh sản:

hình thành của nang bào tử Trong quá trình sinh s ản vô tính, chồi mới phát triển từ

men mẹ khi các điều kiện thích hợp v à sau đó, khi chồi đạt tới kích thước của men

trưởng thành thì nó tách ra kh ỏi men mẹ Khi các điều kiện dinh dưỡng kém các men

có khả năng sinh sản hữu tí nh sẽ tạo ra các nang bào tử

2.8.2.1.Sinh sản vô tính:

Sinh sản vô tính ở nấm men th ường gặp nhất là nẩy chồi, khi một chồi ho àn

chỉnh sẽ phát triển ngay, ở đó chồi sẽ nối liền với tế b ào mẹ (bud scar) và khi chồi rời

ra tế bào mẹ gọi là điểm sinh sản (birth scar)

Sự phân đôi (fission) không nhận thấy ở Saccharomyces cerevisiae nh

ưng thường gặp ở Schizosaccharomyces

Các giai đoạn phát triển ở chồi v à chồi tách ra khỏi tế b ào mẹ

Nẩy chồi ở nấm men

Hình 12 Sự nảy chồi ở nấm men 2.8.2.2 Sinh sản hữu tính:

Nấm men không sinh ra các cơ quan sinh d ục mà chúng sinh ra hai t ế bào

dinh dưỡng mà nhiệm vụ giống nh ư các giao tử; Quá trình hợp tế bào chất

(plasmogamy) và hợp nhân (karyogamy) xảy ra v à thành lập tế bào nhị bội, nang

và cuối cùng là bào tử nang thành lập trong nang

Hình 13: Giai đoạn sinh sản hữu tính ở nấm men Saccharomyces cerevisiae

Số bào tử nang tùy thuộc vào số lần phân chia nhân nh ưng thường là 8, bào

tử nang được giải phóng, nẩy mầm để h ình thành tế bào dinh dưỡng mới từ đây

chúng sinh sản vô tính bằng sự nẩy chồi hay ph ân đôi

Tuy nhiên, sinh s ản hữu tính không phải đ ơn giản Theo Guilliermond

(1949), nấm men có 3 loại chu kỳ sinh tr ưởng hay vòng đời khác nhau đ ược mô tả

ở 3 loại nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ludwigii và

Schizosaccharomyces octosporus.

• Saccharomyces cerevisiae

Đây là loài dị tản với 4 bào tử nang hình thành và 2 bào tử nang mang gen a,

cả hai α trong 1 nang với 2 bào tử nang mang gen hay a sẽ tạo ra α loại gen phát

triển độc lập Khi tiến ành tiếp hợp, mỗi loài α và a sẽ tiếp hợp thành một chồi

mang tính giao tử rồi hai giao tử tế b ào hợp tử (zygote), sau đó tế b ào tiếp hợp

nẩy chồi cho ra một tế bào giống hệt như tế bào tiếp hợp nhưng mang 2n NST, t ế

bào tiếp hợp phát triển th ành nang (tế bào tiếp hợp to hơn tế bào dinh dưỡng và có

hình bầu dục) và trong điều kiện môi trường bất lợi, tế b ào tiếp hợp giảm phân để

hình thành 4 tế bào đơn bội trong đó 2 tế b ào đơn bội mang gen a v à 2 tế bào đơn

bội mang gen α

2.9 Đặc điểm nấm men d ùng trong sản xuất

Không thể đơn thuần dựa vào hình thái kích th ước, hay khả năng l ên men củanấm men để xác định nấm men tốt hay xấu, c ần có sự phối hợp giữa các thông số này.Kết quả phân tích nấm men bánh m ì hiện được sản xuất ở Liên Xô và một số nước khác,người ta đã đưa ra các tiêu chu ẩn nấm men Saccharomyces cerevisiae được chọn để sảnxuất men bánh m ì như sau:

- Tế bào lớn, có dạng hình cầu hay hình trứng, đường kính ít nhất 7×11 mm

- Hoạt tính maltase:biểu thị thời gian để 1g nấm men ép phóng thích ra 10ml

CO2 khi lên men 20 ml dung d ịch đường maltose 5%≤70 phút

- Hoạt lực làm dậy bột: biểu thị thời gian 5g nấm men ép l àm nở khối bột 280g đếnchiều cao 1,5cm theo khuôn có kích th ước xác định, không quá 45 phút

- 100% bền vững với rỉ đường : chỉ tiêu này được đưa ra sau nhiều năm nghiên cứu,cho thấy nấm men c àng nhạy cảm với nồng độ rỉ đ ường thì khả năng sinh sản qua cácthế hệ c àng nhanh Ch ủng nấm men đ ược đánh giá là bền vững 100% đối với rỉ đường, nếu chúng tồn tạ i 6-7 thế hệ mà không bị chết trong môi trường có nồng độ rỉ đường cao

- Khả năng tích lũy sinh khối nấm men là 0,2/giờ, trong điều kiện nuôi nấm men

có sục khí, môi trường có nồng độ chất khô là 8% ở 30ºc trong 6 giờ, được tính theocông thức sau :

Trong đó ml: sinh khối nấm men sau 6 giờ nuôi

m :sinh khối nấm men

Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

saccharomyces cerevisiae

Hình 14: Một số hình ảnh về saccharomyces:

2.10 Công nghệ sản xuất nấm men bánh mì

2.10.1 Nguyên liệu trong sản xuất nấm men bánh mì

2.10.1.1 Nước

Nước được coi là nguyên liệu chính trong sản xuất vì đây là công nghệ lên men chìmhiếu khí Nước sử dụng trong sản xuất nấm men bánh mỳ là nước sử dụng trong sinh hoạthằng ngày Trong trường hợp sử dụng nước giếng hoặc nước bề mặt khác, phải xử lý để đạtchất lượng nước dùng trong sinh hoạt Yêu cầu của nước:

¾Có độ cứng từ 4 - 8° (1° cứng ≈ 10mg CaO/lít)

¾Không màu, không mùi, không vị

¾Các chất sau không được quá mức cho phép (mg/l): Cl- < 0.5; SO4 2- <

80; As < 0,05; Zn< 5; Cu <3; FeO < 3

¾E coli < 20 tế bào

2.10.1.2 Nguồn hydratcacbon

Hydratcacbon sử dụng trong sản xuất nấm men bánh mì thường là đường có trong rỉđường (mật rỉ) Như vậy rỉ đường là nguyên liệu chính thứ hai dùng trong sản xuất nấmmen bánh mì Rỉ đường có hai loại : rỉ đường từ quá trình sản xuất đường từ mía và từ củ cảiđường Rỉ đường từ hai nguồn nguyên liệu khác nhau này có nhiều đặc điểm vật lý và hoáhọc giống nhau Tuy nhiên, giữa 2 loại nguyên liệu này có một số chất có thành phần khácnhau

Bảng 3 Thành phần hóa học của 2 loại rỉ đường:

Những đặc tính quan trọng của rỉ đường phù hợp với quá trình lên men :

- Chứa hàm lượng đường cao

- Ngoài đường saccharose còn chứa nhiều chất hữu cơ, vô cơ, các chất thuộcvitamin và các chất điều hoà sinh trưởng Trong đó có vitamin H (biotin) là chất kích thíchsinh trưởng đối với phần lớn nấm men Trong 2 loại rỉ đường thì rỉ đường từ mía có hàmlượng biotin cao hơn rỉ đường từ củ cải đường Chính vì thế, ở nhiều nước không có mía,người ta phải nhập rỉ đường từ mía về trộn chung với rỉ đường từ củ cải đường để đảm bảohàm lượng biotin cho nấm men phát triển Tuy nhiên rỉ đường cũng có những đặc điểm khôngphù hợp với quá trình lên men

Muốn sử dụng chúng cho quá trình lên men, ta phải tiến hành một số quá trình xử lý Cácđặc điểm ảnh hưởng quá trình lên men là :