2.10.3.1. Xử lý rỉ đường
Rỉ đường là sản phẩm phụ của ngành công nghiệp đường. Rỉ đường mía hoặc rỉ đường củ cải đều là nguồn nguyên liệu rất tốt cho công nghiệp vi sinh, trong đó có công nghiệp sản xuất nấm men. Trong rỉ đường chứa tới 60 – 75% đường, trong đó phần lớn là saccharose, giàu chất khoáng, nhưng thiếu phospho và có thể thiếu nguồn nitơ dinh dưỡng cho nấm men. Rỉ đường mía khá giàu biotin (vitamin H). Đặc biệt là cả hai loại rỉ đường đều thấy có mặt các vi khuẩn không sinh bào tử và các loài sinh bào tử với số lượng khá lớn. Do vậy, muốn đưa rỉ đường vào nuôi cấy nấm men cần phải xử lý:
Xử lý rỉ đường gồm hai phương pháp sau: a. Phương pháp hóa học:
– Pha loãng đường theo tỷ lệ 1:1 (1 rỉ đường + 1 nước theo thể tích) – Acid hóa bằng acid H2SO4.
– Bổ sung nguồn N và P cùng các chất kháng khuẩn rồi khuấy đều.
– Gia nhiệt có thể tới 1200C trong 10 phút, 1100C trong 30 phút, hoặc 80 – 950C trong vòng 45 – 60 phút. Khi gia nhiệt khuấy đều.
– Để yên khoảng 4 giờ để lắng cặn. Lấy phần trong phía trên cặn để chuẩn bị dịch nuôi men nhân giống.
b. Phương pháp cơ học:
Dùng máy ly tâm để loại chất bẩn, chất keo có ưu điểm hơn so với phương pháp hóa học về phương diện kinh tế và thời gian, giảm thất thoát so với phương pháp hóa học 2% còn 0.14%. Trước khi ly tâm pha loãng rỉ đường với nước theo tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, tùy thuộc vào thành phần muối canxi trong rỉ đường. Nếu lượng muối canxi trong rỉ đường < 0.5% thì pha loãng 1:1, nếu là 0.6% thì pha loãng 1:2, hơn 1% thì pha loãng 1:4.
Ngoài ra nếu gặp rỉ đường bị xấu hay bị thiếu thì ta phải tiến hành xử lý rỉ đường. Nếu rỉ đường không đủ chất dinh dưỡng cho nấm men (chẳng hạn như nhu cầu nấm men đối với Mg ≥ 0,15% cao hơn nồng độ có trong rỉ đường) cần bổ sung cho đủ để nấm men có thể tăng trưởng được. Riêng đối với rỉ đường xấu, tùy yếu tố ảnh hưởng mà xử lý như sau :
Ở nước ngoài, để sản xuất men thương phẩm,thường dùng men mẹ lớn, bảo quản dưới dạng men sữa, có hàm lượng từ 300-700g/l. Giai đọan nuôi men mẹ thường tiến hành trong điều kiện vô trùng, hệ thống nuôi nấm men kín, nguyên liệu được khử trùng hoặc triệt để trong nồi hấp áp suất hoặc ở 1000C trong 60 phút. Chẳng hạn ở Anh, Hunggari, Tiệp Khắc người ta nuôi nấm men mẹ trong phòng thí nghiệm gồm 3 giai đoạn. Ở Thụy Điển, Liên Xô gồm 4 giai đoạn, Ý gồm 5 giai đoạn và 1 giai đoạn cuối sản xuất men mẹ trong phân xưởng giống sạch. Thời gian sản xuất thay đổi từ 3 – 6 ngày.
Trong quy trình sản xuất men mẹ, ở các nước này thường dùng môi trường tổng hợp, nhất là các giai đọan trong phòng thí nghiệm như: nước mạch nha, cà chua, cà rốt, dịch tự phân của nấm men, đường glucose, maltose làm nguồn cacbon và nitơ, vitamin cho nấm men. Giai đoạn sản xuất men mẹ trong phân xưởng giống sạch tuy không vô trùng triệt để, nhưng nguyên liệu, nước đều được khử trùng ở 1000C trong 60 phút, hoặc được xử lý hypocloric.
Ở nước ta, hầu như chỉ có giai đoạn giống gốc, được thực hiện trong phòng thí nghiệm, các giai đoạn nhân giống tiếp theo đều thực hiện trong điệu kiện vô trùng tương đối, hệ thống nuôi men từ giai đoạn 4 trở đi là hệ thống hở và môi trường sử dụng thường không được giàu như các quy trình trên.
Nguồn hydratcacbon: tính trên rỉ đường hoặc rỉ đường có bổ sung nước mạch nha: 12 – 15% chất khô.
– Ammonium sunfat: từ 0,1 – 0,3%. – Urê: 0,1 – 0,15%.
– DAP: 0,1% hay acid photphoric 0,06%. – Magie sunfat 0,05%.
men sữa. Mầm men trong thể tích trên lại tiếp tục được nhân lên theo cách thức tuần hoàn để sản xuất men ép thành phẩm như sau:
Lắng ly tâm lấy men thành phẩm
Từ giai đoạn ống nghiệm đến giai đoạn 200L có thể xem như giai đọan men mẹ yêu cầu về chất lượng không được để nhiễm men dại hay vi khuẩn. Nếu không có điều kiện nhân giống từ ống nghiệm gốc, có thể ly tâm lấy men trong giai đoạn này để sử dụng cho đợt nuôi men tiếp theo. Nếu để lắng và ly tâm tiếp theo trong giai đoạn này men mẹ phải đạt được các chỉ tiêu sau đây:
– Hoạt lực làm dậy bột ≤ 45phút. – Độ bền vững > 72 giờ.
– Hoạt tính zymase ≤ 45 phút. – Hoạt tính maltase ≤ 70 phút.
– Tính nhạy cảm thẩm thấu ≤ 10 phút.
– Cũng có thể đánh giá sơ bộ bảng đặc điểm hình thái và vài đặc điểm của một số cơ
quan của tế bào khi nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi. – Tế bào đồng nhất không lớn.
– Không có thể mở.
Nhuộm tế bào với xanh metylen: nếu tế bào già, chết sẽ bắt đầu từ màu xanh đến xanh đậm, trong khi tế bào trẻ không bắt màu.
Vòng tuần hoàn sau 200L có thể lên đến 10 lần phụ thuộc vào chất lượng men mẹ, độ sạch của môi trường, nguyên liệu, điều kiện vệ sinh của cơ sở mỗi vòng từ 6 đến 8 giờ. Ở các nước phát triển giai đọan nuôi men mẹ và men thương phẩm được thực hiện trong thiết bị lên men kín, khá tối ưu về điều kiện thông khí, điều kiện kiểm tra quá trình được tự động hoá ,do đó kịp thời xử lý những sơ sót về kỹ thuật.
Thiết bị nuôi men
– Phuy nhựa 200L: 25 – 30 cái, đây là thùng nuôi men bánh mì phổ biến ở thành phố ta, thích hợp với điều kiện sản xuất bán thủ công, dễ làm vệ sinh, sau mỗi đợt nuôi. Tuy nhiên,
nước không đạt, lượng khí chi phí khá cao.
– Nếu có điều kiện đầu tư xây dựng, nên thiết kế hai nồi nuôi men qui mô 0,5m³ và 2m³. Dùng thép không rỉ làm đáy và phầm vỏ bọc xung quanh, nắp đậy bằng kim loại, có hệ thống phân bố khí, hơi nước, hệ kiểm tra nhiệt độ, độ pH, lượng khí,…
2.10.3.3. Nuôi cấy nấm men thương phẩm
Gồm các phương pháp sau:
a. Nuôi nấm men thương phẩm theo chu kì
Trong giai đoạn nuôi cấy cần phải lưu ý mấy vấn đề quan trọng sau:
– Thành phần môi trường: môi trường nuôi cấy nấm men thương phẩm thường không khác nhiều so với môi trường nuôi cấy trong quá trình nhân giống. Tuy nhiên, thành phần môi trường phải tuyệt đối ổn định để chất lượng nấm men đồng đều ở tất cả các mẻ nuôi trong suốt quá trình sản xuất và môi trường nuôi cấy phải vô trùng.
Lượng đường trong môi trường khoảng 2 – 3%, không nên nhiều hơn và cũng không nên ít hơn. Nếu lượng đường cao sẽ vừa lãng phí và vừa tạo ra những sản phẩm trao đổi chất khác, gây ức chế ngược đến quá trình tạo sinh khối.
pH môi trường khỏang 4.2 – 5.4. Không nên hạ thấp độ pH của môi trường xuống vì làm như vậy nấm men sẽ khó phát triển. Nếu pH cao quá vừa ức chế nấm men phát triển, vùa tạo điều kiện cho vi khuẩn nhiễm vào dung dịch nuôi và phát triển, cạnh tranh chất dinh dưỡng, làm giảm chất lượng nấm men.
– Thiết bị nuôi nấm men vừa có dung tích thích hợp, vừa thuận lợi cho việc nạp môi trường, phá bọt cũng như thu nhận sản phẩm. Thiết bị phải được lắp đặt hợp lý hệ thống thổi khí, hệ thống cánh khuấy và tấm cản dòng chuyển động của môi trường để làm tăng quá trình trao đổi chất của vi sinh vật.
– Việc cung cấp oxy cho quá trình tạo sinh khối rất cần thiết. Oxy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae. Vi sinh vật nhất là nấm men không thể sử dụng oxy ở dạng hòa tan trong môi trường lỏng.
Lượng oxy hòa tan trong nước rất ít. Trong quá trình phát triển, nấm men sẽ nhận oxy hòa tan và như vậy lượng oxy hòa tan sẽ giảm, do đó cần phải cung cấp oxy từ bên ngoài thiết
thiếu oxy trong một thời gian ngắn, ngay lập tức chúng chuyển quá trình lên men hiếu khí sang quá trình lên men yếm khí. Như vậy lượng sinh khối sẽ tạo thành rất ít và đường sẽ chuyển hóa theo các chu trình đường phân của các chu trình khác để cuối cùng tạo ra những sản phẩm trao đổi chất bậc hai. Do đó, quá trình nuôi cấy nấm men thu nhận sinh khối bắt buộc phải được cung cấp oxy liên tục.
Vì nấm men chỉ có thể sử dụng oxy ở dạng hòa tan nên khi tốc độ hòa tan của oxy vào dung dịch bằng tốc độ sử dụng oxy của tế bào nấm men thì sinh khối tế bào nấm men sẽ đạt cực đại.
Tốc độ hòa tan của oxy vào môi trường lỏng được tính theo công thức:
Trong đó:
R: tốc độ hòa tan của oxy C: nồng độ oxy bão hòa
C1: nồng độ oxy hòa tan ở thời điểm khảo sát KLa: hằng số tỷ lệ
t: thời gian.
Trong thiết bị lên men người ta phải lắp đặt hệ thống phân phối khí và hệ thống cánh khuấy. Hệ thống phân phối khí trong nuôi cấy nấm men thường được lắp đặt ở dưới đáy thiết bị.
Khi số vòng quay của cánh khuấy và tốc độ thổi khí tăng thì độ hòa tan của oxy vào dung dịch môi trường sẽ tăng theo. Đồng thời làm tăng sự xáo trộn môi trường, thúc đẩy quá trình trao đổi chất và sinh sản tăng nhanh.
Tuy nhiên, việc tăng tốc độ khuấy và tốc độ thổi khí chỉ đến một giới hạnh nhất định. Nếu tốc độ của hai yếu tố này quá cao, sẽ làm tăng hiện tượng tự phân của tế bào và bọt sẽ tạo ra nhiều.
Độ hòa tan của oxy bị chi phối bởi nhiệt độ của môi trường. Khi nhiệt độ của môi trường tăng thì độ hòa tan của oxy sẽ giảm. Nhiệt độ thấp thường làm tăng tốc độ hòa tan của oxy.
Nếu trong quá trình lên men, nhiệt độ môi trường tăng nhanh (do quá trình hô hấp của vi sinh vật) thì ngay lập tức phải thổi khí mạnh để làm giảm nhiệt độ của môi trường. Nếu không làm hạ nhiệt độ, độ hòa tan của oxy sẽ giảm và năng suất sinh khối sẽ giảm.
Trong trường hợp phải dùng những chất hoạt động bề mặt, chất phá bọt, hoặc một số chất chống nhiễm trùng, độ hòa tan của oxy cũng giảm.
Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định oxy hòa tan. Những phương pháp phổ biến nhất như sau:
– Phương pháp hóa học – Phương pháp cực phổ
– Phương pháp đo điện thế oxy hóa – khử – Phương pháp đo trên máy Vacbua
Khi xác định lượng oxy hòa tan trong môi trường, người ta biểu hiện giá trị này theo các đơn vị sau:
– Phần trăm so với khả năng bão hòa – Áp suất riêng phần
– Milimol hoặc miligam
Nghiên cứu ảnh hưởng của oxy hòa tan đến sự phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae cho thấy: năng suất tạo thành sinh khối tăng dần khi tăng hàm lượng oxy hòa tan. Năng suất sinh khối nấm men đạt cao nhất khi lượng oxy hòa tan tăng từ 0.5 – 1 milimol/l/phút. Khi lượng oxy hòa tan tăng tới 4 milimol/l/phút, sinh khối giảm. Nếu tăng lượng oxy lên nữa, sinh khối sẽ giảm nhanh. Điều đó cho thấy sự tăng oxy hòa tan không phải tỷ lệ thuận với sự tăng sinh khối.
Không khí trước khi đưa vào thiết bị lên men, phải được làm sạch khỏi vi sinh và các tạp chất.
Nhu cầu cung cấp oxy cho quá trình phát triển của nấm men không phải lúc nào cũng giống nhau. Do đó, ta phải thay đổi mức độ cung cấp oxy theo đúng nhu cầu thực tế của nấm
đoạn này, việc tạo thành acid amin, các pectin và acid nucleic xảy ra nhanh hơn các quá trình khác. Thời gian này có thể dài, có thể ngắn tùy thuộc vào từng loại nấm men. Giai đoạn này thường khoảng 0.5 – 1 giờ. Giai đoạn này chỉ cần cung cấp lượng không khí khoảng 50m3/giờ/m3 môi trường là đủ.
Ở giai đoạn tăng trưởng, nấm men tiến hành quá trình trao đổi chất rất mạnh, khối lượng nấm men trong các thiết bị tăng rõ rệt. Việc tổng hợp enzyme được xúc tiến nhanh. Hàm lượng RNA được tổng hợp nhiều nhất. Giai đoạn này thường kéo dài khoảng 7 – 14 giờ và cũng là giai đọan nấm men cần nhiều oxy nhất, do đó lượng oxy cung cấp phải gấp đôi giai đoạn đầu tiên, khoảng 80 – 100m3/giờ/m3 môi trường.
Giai đoạn kế tiếp là giai đoạn cân bằng. Giai đoạn này có nhiều thay đổi quan trọng. Lượng tế bào mới sinh gần bằng lượng tế bào chết. Các quá trình trao đổi chất giảm mạnh, do đó nhu cầu oxy không nhiều. Giai đoạn này kéo dài khoảng 1 – 2 giờ và ta phải giảm lượng không khí cấp vào môi trường. Lượng không khí cấp vào giai đoạn này từ 20 – 50m3/giờ/m3 môi trường.
Trong sản xuất nấm men bánh mì, người ta thường kết thúc quá trình nuôi nấm men ờ giai đoạn 2, bởi vì, một trong những yêu cầu quan trọng của nấm men bánh mì là số lượng tế bào nấm men sống phải chiếm đại đa số nên không thể đợi đến giai đoạn cân bằng mới tiến hành thu nhận sinh khối, làm như vậy nấm men thu được sẽ chứa nhiều tế bào già.
Trong nuôi cấy nấm men bánh mì, người ta thường nuôi trong khoảng thời gian 8 – 16 giờ. Tối đa là 16 giờ.
b. Nuôi cấy nấm men bánh mì theo chu kì có bổ sung dịch nuôi cấy Nuôi cấy theo chu kì có nhược điểm:
– Tổn thất thời gian cho giai đoạn vệ sinh thiết bị và điều kiện sản xuất.
– Sinh khối nấm men thu nhận được bao gồm cả tế bào mới sinh trưởng, tế bào trưởng thành và tế bào già.
– Bị tác động mạnh bởi chất dinh dưỡng với hàm lượng khá cao ngay từ thời gian mới nuôi cấy.
Để khắc phục nhược điểm thứ hai và thứ ba, người ta cải tiến phương pháp bằng cách đưa chất dinh dưỡng vào thành nhiều đợt. Phương pháp này giúp tế bào nấm men không chịu
Ghi chú:
–Tỉ lệ phần trăm so với tổng số chất dinh dưỡng cần cho vào.
–Thiết bị trên dùng cho thiết bị nuôi cấy là 100m3, dung tích dịch nuôi là 70 m3 c. Nuôi cấy nấm men thương phẩm theo phương pháp liên tục
Để khắc phục nhược điểm của phương pháp nuôi cấy theo chu kì, người ta thực hiện phương pháp nuôi cấy liên tục. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là năng suất tăng và tế bào nấm men luôn luôn được đổi mới chất dinh dưỡng.
Phương pháp nuôi cấy liên tục còn cho phép ta kiểm soát và điều khiển dễ dàng quá trình. Điều lưu ý là việc cung cấp oxy là phải liên tục và có cùng một mức độ. Đây là điểm khác biệt giữa phương pháp liên tục và phương pháp theo chu kì. Mức độ cung cấp không khí trong phương pháp này là 80 – 100m3/giờ/m3 môi trường suốt quá trình nuôi cấy.
Thiết bị sử dụng: Máy nén khí (máy thổi) [2]
Là một trong những thiết bị quan trọng nhất trong bộ phận sản xuất men. Cần chọn máy có khả năng tự hoạt động được cả về số lượng khí vận dụng và năng lượng tiêu thụ, có thể
bảo an toàn. Yếu tố này cần thiết vì thể tích khí thay đổi tùy giai đoạn phát triển của nấm men và môi trường nuôi men.
2.10.3.4. Ly tâm tách rửa men bánh mì:
Dịch bã là một hệ thống các cấu tử phức tạp, gồm có nước ( 82-90% theo khối lượng), chất khô (4-10%) và rượu etylic và các chất bay hơi (5-8%) theo khối lượng (W) hoặc 6-10% theo thể tích (V). Dịch này luôn luôn có một lượng CO2 hòa tan nhất định (1-1.5% g/l), độ chua khoảng 0.5, pH 4.9-5.2. Dịch men sau kết thúc quá trình lên men rượu có khá nhiều tế bào nấm men lơ lửng trong dịch và một phần bị lắng thành cặn xác men.[1]