phương pháp sinh học kiểm nghiệm dược phẩm

BỘ Y TẾ KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM IV PHẦN CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM SINH HỌC NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC Bài PHÉP THỬ HISTAMIN Các bƣớc tiến hành Dùng chuột lang nặng 250 - 350 g Để chuột nhịn đói 24 giờ, cho uống nước theo nhu cầu chuột Giết chuột đột ngột phương pháp thích hợp Mổ bụng chuột, dùng kẹp, kẹp vào manh tràng, nâng lên kéo phía trước, thấy hồi tràng nối vào manh tràng Cắt lấy đoạn hồi tràng dài khoảng cm, cho vào khay đựng dung dịch B (nếu làm chậm phải sục khí carbogen) Loại bỏ chất cịn đoạn ruột cách dùng pipet có dung dịch B lồng vào đầu đoạn ruột dung dịch B pipet chảy tự nhiên qua đoạn ruột Cần để pipet tư nghiêng cho mặt thoáng dung dịch B không cao cm so với đoạn ruột khay Thay dung dịch B vào khay Buộc vào đầu đoạn ruột sợi mảnh rạch đường ngang nhỏ đoạn ruột Cho đoạn ruột vào bình ni quan lập có dung tích 10 - 20 ml, chứa dung dịch B, giữ nhiệt độ định 34 - 36 oC Sục hỗn hợp khí có 95 thể tích oxygen thể tích carbon dioxyd qua bình ni Một đầu sợi buộc vào gần đáy bình ni, đầu nối với đầu ghi kimograph thiết bị thích hợp để ghi co bóp ruột Nếu dùng bút ghi giấy điều chỉnh cho biên độ khuếch đại lên khoảng 20 lần Sức căng ruột nên vào khoảng 9,8 mN điều chỉnh theo độ nhạy ruột Thay dung dịch B bình ni quan Để yên 10 phút Tiếp tục thay dung dịch B - lần Thêm vào bình ni quan, xác khoảng 0,2 - 0,5 ml dung dịch histamin dihydroclorid có nồng độ định để gây nên đáp ứng gần tối đa lặp lại Liều gọi liều "cao" Thay dung dịch B bình ni lần trước lần thêm histamin Nên thêm histamin vào khoảng thời gian cách để ruột giãn hoàn toàn lần thêm (khoảng phút) Tương tự, thêm thể tích dung dịch có nồng độ histamin thấp đáp ứng có biên độ khoảng nửa biên độ liều "cao" lặp lại Liều gọi liều "thấp" Tiếp tục thêm đặn liều "cao" liều "thấp" histamin nêu xen kẽ thêm thể tích dung dịch pha từ mẫu thử Điều chỉnh độ pha loãng dung dịch thử sức co ruột nhỏ sức co liều "cao" Kiểm tra xem sức co dung dịch thử có lặp lại khơng xem đáp ứng với liều cao liều thấp có trước khơng Tính hoạt lực chất thử microgam histamin base vào độ pha loãng xác định Lượng histamin xác định không vượt lượng ghi chuyên luận Nếu chất thử không gây co bóp ruột, pha dung dịch khác cho thêm lượng histamin tối đa dung nạp ghi chuyên luận thử với dung dịch Theo dõi xem co dung dịch có tương ứng với lượng histamin thêm khơng Nếu dung dịch không gây co tương ứng co dung dịch thử không lặp lại được, sau thử chất thử rồi, thử lại với histamin chuẩn liều "cao" liều "thấp" mà đáp ứng co giảm kết thử khơng có giá trị phải thử chất hạ áp thuốc theo chuyên luận "Phép thử chất hạ áp" Dung dịch A: Natri clorid 160 g Kali clorid 4,0 g Calci clorid khan 2,0 g Magnesi clorid khan 1,0 g Dinatri hydrophosphat Nước cất pha tiêm 50 mg vừa đủ 1000 ml Dung dịch B: Dung dịch A 50 ml Atropin sulfat 0,5 mg Natri hydrocarbonat 1,0 g D - glucose 0,5 g Nước cất pha tiêm vừa đủ 1000 ml Dung dịch B phải pha trước dùng phải dùng vòng 24 Bài PHÉP THỬ NỘI ĐỘC TỐ VI KHUẨN Phép thử nội độc tố vi khuẩn dùng để phát định lượng nội độc tố vi khuẩn gram âm có mẫu thử cần kiểm tra Phương pháp sử dụng thuốc thử lysat dịch phân giải tế bào dạng amip có máu lồi sam biển, Limulus polyphemus Tachypleus tridentatus Hiện có phương pháp để thực phép thử này: phương pháp tạo gel dựa tạo thành gel cho thuốc thử vào dung dịch có chứa nội độc tố; phương pháp đo độ đục, dựa vào thay đổi độ đục thuốc thử lysat tạo gel; phương pháp đo màu dựa thay đổi màu phức hợp màu - peptid Tuỳ theo điều kiện tính chất mẫu thử, áp dụng kỹ thuật thích hợp để thực phép thử Tuy nhiên, có nghi ngờ tranh chấp, kết luận cuối dựa vào phương pháp tạo gel trừ có dẫn khác Phép thử thực điều kiện tránh nhiễm khuẩn Thiết bị dụng cụ: Tất dụng cụ dùng phép thử phải khơng có chứa nội độc tố Với dụng cụ thuỷ tinh chất liệu chịu nhiệt, loại chất gây sốt cách sấy 250 oC 30 phút Nếu dùng dụng cụ chất dẻo, đầu hút micropipet hay khay lỗ để làm phản ứng, dùng loại có chất liệu khơng ảnh hưởng tới phép thử khơng có chứa nội độc tố Nước để thử nội độc tố (nước BET nước LAL): Là nước tinh khiết cho kết âm tính phép thử nội độc tố điều kiện quy định Có thể dùng nước cất lần loại nước tinh khiết thu phương pháp thích hợp khác đạt u cầu Nếu khơng có dẫn khác, dùng nước BET nước LAL làm dung môi để pha tất dung dịch dùng phép thử Dung dịch acid hydrocloric 0,1M BET natri hydroxyd 0,1M BET: dung dịch pha từ acid hydrocloric đậm đặc natri hydroxid rắn với nước BET dụng cụ khơng có chứa nội độc tố Các dung dịch đạt yêu cầu sau điều chỉnh đến pH 6,0- 8,0, cho kết âm tính điều kiện phép thử Chuẩn nội độc tố dung dịch chuẩn gốc: chuẩn nội độc tố sử dụng phép thử chất đối chiếu Chuẩn thiết lập đánh giá theo chuẩn nội độc tố quốc tế Hoạt lực chuẩn biểu thị theo đơn vị quốc tế qui định Tổ chức Y tế giới (International Unit = IU) đơn vị nội độc tố (Endotoxin Unit – EU) IU tương đương với EU Dung dịch chuẩn gốc nội độc tố pha theo quy định đóng gói nhà sản xuất Trên nhãn tờ hướng dẫn sử dụng kèm theo ghi rõ cách pha, điều kiện bảo quản số đơn vị nội độc tố có dung dịch chuẩn gốc sau pha theo hướng dẫn Pha dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc với nước BET/ LAL để dãy chuẩn có nồng độ thích hợp Trước pha, thường yêu cầu lắc mạnh dung dịch chuẩn gốc 15 phút, lần pha loãng, trộn dung dịch pha lỗng 30 giây Dùng dung dịch chuẩn pha loãng sớm tốt để tránh hoạt lực Dung dịch thử Chuẩn bị dung dịch thử cách hồ tan pha lỗng mẫu thử với nước BET/ LAL đến độ pha loãng thích hợp Một số chất chế phẩm cần phải hịa tan pha lỗng dung dịch thân nước khác pH hỗn hợp phản ứng phải nằm khoảng qui định cho loại thuốc thử, thông thường khoảng 6,0 – 8,0 Do vậy, nên điều chỉnh pH dung dịch thử cho phù hợp dung dịch acid hydrocloric 0,1M BET, natri hydroxyd 0,1M BET đệm thích hợp theo khuyến cáo nhà sản xuất thuốc thử Phép thử khơng thích hợp với số loại mẫu thử loại nhũ dịch, hỗn dịch… Một số chất cho phản ứng dương tính âm tính giả với thuốc thử chế phẩm từ máu, polynucleotid; chế phẩm có chứa kim loại nặng, chất diện hoạt, nồng độ ion cao Do vậy, cần phải khảo sát, tìm phương pháp xử lý đánh giá trước áp dụng phép thử cho chế phẩm Độ pha loãng tối đa: Độ pha loãng tối đa (MVD) hệ số pha loãng lớn cho phép để thu dung dịch thử có chứa lượng nội độc tố phát MVD tính sau: Giới hạn nội độc tố x nồng độ dung dịch thử MVD = Trong đó: Giới hạn nội độc tố (Endotoxin Limit = EL): giới hạn nội độc tố thường quy định chuyên luận riêng Chế phẩm đạt yêu cầu lượng nội độc tố có chế phẩm thấp giới hạn qui định Giới hạn nội độc tố chế phẩm tính sở liều dùng cho người theo công thức sau: EL = K/ M Trong đó, K ngưỡng nội độc tố tính cho kg thể trọng người chịu đựng mà không xảy phản ứng độc hại; Giá trị K tham khảo bảng M liều tối đa sản phẩm tính cho kg thể trọng dùng dạng đơn liều thời gian khoảng Liều hiểu lượng thuốc tối đa dùng vòng Với loại thuốc tiêm da, tiêm bắp tiêm tĩnh mạch lần coi dùng đơn liều Với dịch truyền tĩnh mạch thời gian dài, tính M theo lượng thuốc liều truyền tối đa giờ, dựa tốc độ truyền tiêu chuẩn qui định riêng cho chế phẩm Giá trị dùng liều tối đa theo khuyến cáo nhà sản xuất, mức liều vượt mức liều theo dẫn thầy thuốc Bảng 1: Loại sản phẩm K (tính cho kg thể trọng) Các loại thuốc tiêm màng 0,2 Các thuốc phóng xạ tiêm tĩnh mạch 2,5 Tất thuốc tiêm trừ loại tiêm 5,0 màng thuốc phóng xạ Nếu sản phẩm dùng theo đường tiêm vỏ đường tiêm khác giới hạn nội độc tố cho sản phẩm tính theo giá trị K đường tiêm vỏ có u cầu chặt chẽ Trên thực tế, nhà sản xuất thường qui định giới hạn nội độc tố cho sản phẩm thấp nhiều so với giới hạn tính theo ngưỡng chịu đựng người bệnh, để dùng liều tối đa sản phẩm đảm bảo an toàn cho người bệnh Nồng độ dung dịch thử: Tính mg/ ml giới hạn nội độc tố chuyên luận riêng quy định theo khối lượng (IU/ mg) Tính đơn vị/ ml giới hạn nội độc tố chuyên luận riêng quy định theo đơn vị hoạt lực sinh học (IU/ đơn vị) Tính ml/ ml giới hạn nội độc tố chuyên luận riêng quy định theo thể tích (IU/ ml) : độ nhạy thuốc thử ghi nhãn (kỹ thuật tạo gel) nồng độ nội độc tố thấp dùng để xây dựng đường cong chuẩn (phương pháp đo độ đục đo màu) PHƢƠNG PHÁP TẠO GEL Phương pháp tạo gel cho phép phát xác định lượng nội độc tố dựa tạo gel thuốc thử lysat với nội độc tố Nồng độ nội độc tố yêu cầu để tạo gel với thuốc thử lysat điều kiện tiêu chuẩn độ nhạy ghi nhãn thuốc thử Để đảm bảo độ xác giá trị phép thử, phải tiến hành phép thử kiểm tra để khẳng định độ nhạy ghi nhãn thuốc thử lysat kiểm tra yếu tố ảnh hưởng theo hướng dẫn 1, Chuẩn bị thử - Kiểm tra độ nhạy lysat Độ nhạy thuốc thử lysat ghi nhãn nồng độ nội độc tố thấp cần thiết để tạo gel với thuốc thử điều kiện xác định Phép thử kiểm tra độ nhạy thực có lơ thuốc thử có thay đổi điều kiện thí nghiệm ảnh hưởng tới kết phép thử Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch nội độc tố chuẩn với nồng độ tương đương ; ; 1/2 1/4 cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc với nước BET, nồng độ cần ống Trong độ nhạy ghi nhãn lysat muốn kiểm tra Pha thuốc thử lysat với nước BET theo hướng dẫn nhãn Trộn thể tích thuốc thử với đồng lượng dung dịch chuẩn (thường dùng 0,1 ml) cho ống Để ống nghiệm có chứa hỗn hợp phản ứng 37 1o C 60 phút, tránh bị rung động mạnh Đọc kết sau khoảng thời gian qui định Phản ứng dương tính gel tạo thành không bị chảy nhẹ nhàng dốc ngược ống nghiệm (180 o) Phản ứng âm tính khơng tạo thành gel gel không đủ chắc, dễ bị rã dốc ngược ống nghiệm Phép thử khơng có giá trị ống dung dịch chuẩn nội độc tố có nồng độ thấp (0,25 ) cho phản ứng dương tính Khi đó, cần kiểm tra kỹ lại điều kiện thử nghiệm lặp lại thí nghiệm “Điểm dừng” ống cuối có hệ số pha loãng lớn dãy cho phản ứng dương tính Độ nhạy thuốc thử biểu thị trung bình nhân nồng độ điểm dừng (IU/ml), tính sau: tính giá trị trung bình logarit nồng độ nội độc tố điểm dừng, sau lấy đối – logarit giá trị trung bình Trung bình nhân nồng độ điểm dừng = anti log ( e/ f) Trong đó: ( e = tổng logarit nồng độ điểm dừng dãy thử f = số dãy chuẩn nội độc tố thử Độ nhạy ghi nhãn thuốc thử khẳng định trung bình nhân nồng độ điểm dừng lớn 0,5 nhỏ 2,0 Kiểm tra yếu tố ảnh hưởng Phép thử có ý nghĩa để kiểm tra xem mẫu thử có chứa yếu tố làm tăng hay ức chế phản ứng hay khơng Khi có thay đổi điều kiện ảnh hưởng đến kết thử nghiệm, cần thực phép thử Chuẩn bị dung dịch A, B, C D theo bảng Các điều kiện thử nghiệm nhiệt độ, thời gian ủ đánh giá kết tương tự phần Kiểm tra độ nhạy lysat Trung bình nhân nồng độ điểm dừng dung dịch B C xác định theo hướng dẫn nêu phần Kiểm tra độ nhạy lysat Bảng 2: Kiểm tra yếu tố ảnh hưởng Dung Nồng độ nội độc tố Dung môi Hệ dịch đƣợc thêm vào số Nồng độ nội pha loãng dung dịch độc tố sau pha loãng - Số ống nghiệm A 0/ dung dịch thử - - B / dung dịch thử dung dịch mẫu thử 4 0,5 0,25 Nước 2 BET 2 0,5 0,25 C D / nước BET 0/ nước BET - - - Dung dịch A (dung dịch thử): mẫu thử pha độ pha loãng ≤ MVD Dung dịch B (đối chứng dương tính có mẫu thử): nội độc tố pha dung dịch thử để kiểm tra yếu tố ảnh hưởng Dung dịch C (khẳng định độ nhạy lysat): chuẩn nội độc tố pha nước BET với nồng độ khác Dung dịch D (đối chứng âm tính): nước BET Phép thử có giá trị dung dịch A D cho phản ứng âm tính kết dung dịch C khẳng định độ nhạy thuốc thử Nếu độ nhạy lysate tính theo dung dịch B lớn 0,5 nhỏ 2,0 mẫu thử không chứa yếu tố ảnh hưởng phép kiểm tra yếu tố ảnh hưởng đạt yêu cầu Nếu không thoả mãn u cầu mẫu thử có chứa yếu tố ảnh hưởng tới phép thử 10 Tổng 104 216 65 72 137 105 91 196 118 144 262 126 112 238 116 160 276 83 67 150 119 149 268 62 58 120 73 72 145 125 67 192 42 51 93 86 63 149 47 93 140 56 45 101 64 107 171 52 53 105 88 113 201 92 84 176 93 117 210 110 113 223 63 71 134 101 56 157 73 128 201 116 91 207 50 65 115 66 55 121 39 87 126 101 68 169 55 100 155 91 68 159 31 71 102 95,6 82,8 69,6 93,3 89,9 66,6 72,4 106,8 709,7 627,9 số u1 s2 số u2 Tổng 112 Trung u1 Tổng u2 số s2 Tổng s1 s1 số bình Phương 525,1 1.012,5 479,6 230,6 sai Bảng 3.2.8.4.-III – Các tổng đáp ứng tương phản tuyến tính Chế phẩm Chế phẩm chuẩn S thử U Nồng độ thấp S1I = 765 U1I = 719 Nồng độ cao S2I = 557 U2I = 579 Tổng số SI = 1.322 UI = 1.298 Nồng độ thấp S1II = 854 U1II = 746 Nồng độ cao S2II = 533 U2II = 662 Tổng số SII = 1.387 UII = 1.408 Tổng chế phẩm S = 2.709 U = 2.706 Tổng số Ngày I DI = 2.620 Ngày II Tương phản tuyến tính 106 DII = 2.795 y 5.415 1.214,3 1.215,1 Ngày I LSI = -208 LUI = -140 LI = -348 Ngày II LSII = -321 LUII = -84 LII = -405 Tổng số LS = -529 LU = -224 L 753 Phân tích phương sai định lượng bố trí thí nghiệm chéo phức tạp kiểu bố trí thí nghiệm khác độ phân tán, biểu diễn tổng bình phương, gây tính song song không độc lập với độ phân tán đơn vị thí nghiệm (trong ví dụ thỏ) Tính song song đường hồi qui kiểm tra đại lượng sai số bình phương trung bình phụ, tính cách lấy tổng bình phương thỏ thí nghiệm trừ thành phần song song hai thành phần tương tác Ba thành phần tương tác đưa thêm vào phân tích phương sai gây lặp lại nhóm thỏ thí nghiệm, gồm: ngày chế phẩm; ngày hồi qui; ngày tính song song Ba đại lượng biểu thị khuynh hướng biến thiên từ ngày thí nghiệm sang ngày thí nghiệm khác nguồn gây sai số chế phẩm, hồi qui tính song song Giá trị thống kê định lượng phụ thuộc vào mức ý nghĩa tỷ số F tương ứng ba đại lượng nói Nếu F tính có ý nghĩa, Fcal > Fcrit P = 0,01, cần phải thận trọng suy diễn kết định lượng, có thể, phải lặp lại định lượng y N K y2 5.415 64 458.159,77 511.583 Tính giá trị tổng bình phương chế phẩm, hồi qui không song song theo công thức Bảng 3.2.3.-IV với số liệu Bảng 3.2.8.4.-III Chú ý định lượng n = 16, tổng số đáp ứng xử lý qua hai ngày thí nghiệm Chế phẩm S2 U 2n LS Hồi qui tuyến tính = Khơng song song = 2.709 K L2 S Giữa khối (thỏ) = 2.706 32 753 64 529 LU 2nh LU 2n E Bi2 K 458.159,77 0,14 8.859,52 224 32 216 E 238 102 2 8.859,52 1.453,51 458.159,77 39.794,73 Bi tổng đáp ứng thỏ thí nghiệm Bảng 3.2.8.4.-II 107 2 Giữa ngày = DI DII K 2.620 2n 2.795 32 458.159,77 478,51 DI DII tổng đáp ứng ngày thí nghiệm Chế phẩm = S I S II U I U II Giữa ngày 1.322 1.387 1.298 1.408 64 N 31,64 SI, SII, UI UII tổng đáp ứng chế phẩm ngày Giữa ngày hồi qui = LSII LSI LUII LUI Giữa ngày LSI LUII N 208 N LUI 321 208 84 84 140 Không song song = LSII 321 50,77 64 140 64 446,27 LSI, LSII, LUI LUII tương phản tuyến tính ngày thí nghiệm Toàn phần = y2 K 511.583 458.159,77 53.423,23 Sai số dư thỏ = Giữa khối – Không song song – (giữa ngày – (giữa ngày chế phẩm) hồi qui) = 39.794,73 – 1.453,51 – 31,64 – 50,76 = 38.258,81 Sai số dư thỏ = Toàn phần – Giữa khối – Giữa ngày – Chế phẩm – Hồi qui – (giữa ngày không song song) = 53.423,23 – 39.794,73 – 478,51 – 0,14 – 8.859,52 – 446,27 = 3.844,06 Tính có giá trị định lượng Phân tích phương sai cho thấy định lượng thỏa mãn phép kiểm tra tính có giá trị: 1) Hồi qui tuyến tính có ý nghĩa: tỷ số F đại lượng hồi qui tính dựa sai số bình phương trung bình thỏ, Fcal = 64,5 > Fcrit = 7,63 với P = 0,01, f1 = f2 = 28 2) Tính song song đường hồi qui: phép kiểm tra tính song song định lượng chéo dựa sai số bình phương trung bình thỏ, Fcal = 1,06 < F( P = 0,05, f1 = 1, f2 = 28 ) = 4,19, chứng tỏ đường ln(liều) – đáp ứng chuẩn mẫu song song với 3) Ba thành phần tương tác khơng có ý nghĩa, tỷ số F tính 0,02, 0,04 3,25 nhỏ Fcrit = 4,19 Bảng 3.2.8.4.-IV – Phân tích phương sai Nguồn gây sai số Bậc tự Tổng Bình bình phương 108 Tỷ số F Xác suất phương trung bình Khơng song song 1.453,5 1.453,5 1,06 > 0,05 Giữa ngày chế 31,6 31,6 0,02 > 0,05 hồi 50,8 50,8 0,04 > 0,05 28 38.258,8 1.366,4 31 39.794,7 1.283,7 Chế phẩm 0,1 0,1 0,00 > 0,05 Hồi qui 8.859,5 8.859,5 64,5 < 0,01 Giữa ngày 478,5 478,5 3,48 > 0,05 Giữa ngày 446,3 446,3 3,25 > 0,05 28 3.844,1 137,3 phẩm Giữa ngày qui Sai số dư thỏ Giữa khối (thỏ) không song song Sai số dư thỏ Toàn phần 63 53.423,2 847,9878472 Tính hoạt lực giới hạn tin cậy Tỷ lệ pha lỗng 2, I = ln(2) = 0,69315 Với P = 0,95 f = 28, t = 2,05 (Bảng 5.1) yU b U S 2n yS LS LU 2nI yU M 753 32 I yS b M 2.706 2.709 32 M 32 ln AU 32 33,948 33,948 0,00276 0,00276 ln 40 3,6916 Hoạt lực R = antiln(M) = antiln(0,00276) = 40,1 IU/ml C E E s 2t 8.859,5 8.859,5 137,3 2,052 H E b dn 8.859,5 33,948 16 C CM 2 2H 1,0697 0,24023 0,0697 1,0697 0,00276 109 0,24023 0,033488 Logarithm giới hạn tin cậy bằng: ln AU CM 0,033488 3,6918 0,1830 Giới hạn tin cậy hoạt lực từ 33,4 đến 48,2 IU/ml Phối hợp kết định lƣợng 4.1 Mở đầu Để đáp ứng yêu cầu Dược điển, ví dụ u cầu độ xác, phải lặp lại hai hay nhiều định lượng độc lập phối hợp kết định lượng để kết cuối xác đáng tin cậy Hai định lượng coi độc lập với q trình thực định lượng khơng gây ảnh hưởng đến kết định lượng khác Điều có nghĩa sai số ngẫu nhiên yếu tố chủ yếu ảnh hưởng đến kết định lượng (ví dụ: chuẩn bị dung dịch thử chuẩn mẫu thử, độ nhạy thị sinh học) định lượng phải độc lập với sai số ngẫu nhiên tương ứng định lượng Các định lượng thực vào ngày dùng dung dịch gốc chế phẩm chuẩn định lượng độc lập Có nhiều phương pháp phối hợp kết định lượng độc lập, nhiên, trình bày ba phương pháp gần tính đơn giản dễ áp dụng chúng Trước phối hợp, hoạt lực phải hiệu chỉnh với hoạt lực giả định chế phẩm thử (xem ví dụ 3.2.8.3) phải biểu diễn dạng logarithm 4.2 Phối hợp cân chỉnh kết định lƣợng (weighted combination) Phương pháp áp dụng thỏa mãn điều kiện sau: 1) định lượng phải độc lập với nhau; 2) đại lượng C định lượng phải nhỏ 1,1 (xem công thức 3.2.5-6 để biết công thức tính ý nghĩa C); 3) bậc tự sai số dư định lượng phải lớn 6, tốt lớn 15; 4) khác hoạt lực cần phối hợp phải khơng có ý nghĩa thống kê (xem mục 4.2.2) Nếu điều kiện không thỏa mãn, dùng phương pháp giới thiệu mục 4.3 để tính hoạt lực trung bình lấy kết tính làm hoạt lực giả định cho lần định lượng 4.2.1 Tính hệ số cân chỉnh W 110 Giả sử kết đo n’ định lượng phân tích để n’ giá trị logarithm hoạt lực M giới hạn tin cậy tương ứng Đối với định lượng, tính logarithm khoảng giới hạn tin cậy L cách lấy logarithm giới hạn tin cậy trừ logarithm giới hạn tin cậy Tính hệ số W cho giá trị M theo phương trình 4.2.1.1, với t số Student dùng tính giới hạn tin cậy W 4t L2 (4.2.1.-1) 4.2.2 Tính đồng hoạt lực Để kiểm tra tính đồng dãy hoạt lực, thành lập biểu thức có phân phối xấp xỉ phân phối sau: WM W M M n WM n W n (4.2.2.-1) n với: Nếu WM W M tính nhỏ giá trị tương ứng với bậc tự f = (n’ – 1) tra từ Bảng 5.2, khác hoạt lực khơng có ý nghĩa thống kê và, đó, tiếp tục tính hoạt lực trung bình giới hạn tin cậy theo cơng thức mục 4.2.3 Nếu tính lớn giá trị tới hạn tương ứng đọc từ Bảng 5.2, hoạt lực tính khơng đồng sử dụng công thức mục 4.2.3, thay vào đó, dùng cơng thức mục 4.2.4 4.2.3 Tính hoạt lực trung bình có cân chỉnh (weighted mean) giới hạn tin cậy Logarithm hoạt lực trung bình tính theo cơng thức: M WM W (4.2.3.-1) Độ lệch chuẩn logarithm hoạt lực trung bình bậc hai nghịch đảo tổng hệ số W: sM W (4.2.3.-2) logarithm giới hạn tin cậy hoạt lực trung bình tính theo phương trình sau: 111 M (4.2.3.-3) ts M t số Student đọc từ Bảng 5.2 với bậc tự tổng số bậc tự sai số dư định lượng 4.2.4 Hoạt lực trung bình có cân chỉnh giới hạn tin cậy dựa độ phân tán định lƣợng định lƣợng Khi phối hợp kết số định lượng lặp lại, giá trị có ý nghĩa Độ phân tán hoạt lực phân tích thành hai thành phần, gồm: 1) Phương sai định lượng sM / W 2) Phương sai định lượng với M sM M M n n trung bình chưa cân chỉnh (trung bình số học) M Phương sai đầu thay đổi từ định lượng đến định lượng khác, phương sai sau chung cho tất M Đối với M tính hệ số cân chỉnh theo công thức: W sM sM Dùng W’ thay cho W công thức mục 4.2.3, với t = 4.3 Phối hợp không cân chỉnh kết định lƣợng (unweighted combination) Phương pháp phối hợp kết định lượng đơn giản tính trung bình số học n’ logarithm hoạt lực M sau tính độ lệch chuẩn theo cơng thức: sM M M n ( n 1) (4.3.-1) logarithm giới hạn tin cậy bằng: M (4.3.-2) ts M t có (n’ – 1) bậc tự Vì số định lượng cần phối hợp thường nhỏ nên giá trị t lớn 4.4 Ví dụ Bảng 4.4.-1 liệt kê kết sáu định lượng độc lập với giới hạn tin cậy bậc tự sai số dư tương ứng Tất định lượng đáp ứng điều kiện 1, mục 4.2 Các hệ số W tính theo cơng thức mục 4.2 Kiểm tra tính đồng hoạt lực 112 WM W M M n n WM 2.123 323,8792 W n 216 478,4988 22.070,6028 4,42 n tính nhỏ giá trị tới hạn 11,07 đọc từ Bảng 5.2 với bậc tự f = Do đó, khác hoạt lực khơng có ý nghĩa thống kê Bảng 4.4.-I – Hoạt lực giới hạn tin cậy sáu định lượng độc lập Lần định R lượng (IU/lọ) Các giới hạn tin cậy Hoạt lực (IU/lọ) Giới hạn Giới hạn Bậc tự DF 18.367 17.755 19.002 20 18.003 17.415 18.610 20 18.064 17.319 18.838 20 17.832 17.253 18.429 20 18.635 17.959 19.339 20 18.269 17.722 18.834 20 Tổng số 120 Bảng 4.4.-II M= W MW WM2 9,8183 0,0679 3.777,8301 37.091,9101 364.179,9033 9,7983 0,0664 3.951,6825 38.719,7456 379.387,4392 9,8017 0,0841 2.462,5579 24.137,1950 236.584,9721 9,7887 0,0659 4.003,1116 39.185,4586 383.576,6531 9,8328 0,0740 3.175,7400 31.226,4061 307.042,9060 9,8130 0,0609 4.699,6807 46.117,7833 452.552,0054 ln(R) Tổng số 58,8528 L* 22.070,6028 216.478,4988 2.123.323,8792 * L = ln(giới hạn tin cậy trên) – ln(giới hạn tin cậy dưới) Hoạt lực trung bình giới hạn tin cậy Hoạt lực trung bình giới hạn tin cậy tính công thức mục 4.2.3 số liệu Bảng 4.4.-I 4.4.-II 113 WM W M 216.478,4988 22.070,6028 sM 22.070,6028 W 9,8085 0,00673 Với số bậc tự f = 120, P = 0,95, t = 1,98 M ts M 9,8085 1,98 0,00673 9,7951 9,8218 Bằng cách lấy antilogarithm giá trị tính được, hoạt lực trung bình 18.187 IU/lọ với khoảng tin cậy xác suất 95 % từ 17.946 đến 18.431 IU/lọ Các Bảng tra cứu 5.1 Bảng mức ý nghĩa t (giá trị tuyệt đối) P f 0,95 P 0,99 f 0,95 0,99 12,71 63,66 18 2,10 2,88 4,30 9,92 19 2,09 2,86 3,18 5,84 20 2,09 2,85 2,78 4,60 21 2,08 2,83 2,57 4,03 22 2,07 2,82 2,45 3,71 23 2,07 2,81 2,36 3,50 24 2,06 2,80 2,31 3,36 25 2,06 2,79 2,26 3,25 26 2,06 2,78 10 2,23 3,17 27 2,05 2,77 11 2,20 3,11 28-29 2,05 2,76 12 2,18 3,05 30 2,04 2,75 13 2,16 3,01 40-43 2,02 2,7 14 2,14 2,98 57-63 2,00 2,66 15 2,13 2,95 102- 1,98 2,26 126 16 2,12 2,92 600-∞ 1,96 17 2,11 2,58 2,90 114 Nếu giá trị quan sát lớn giá trị bảng, coi có ý nghĩa (P = 0,95) hay có ý nghĩa (P = 0,99) 5.2 Bảng mức ý nghĩa P P f 0,05 0,01 f 0,05 0,01 3,84 6,63 11 19,68 24,73 5,99 9,21 12 21,03 26,22 7,81 11,34 13 22,36 27,69 9,49 13,28 14 23,68 29,14 11,07 15,09 15 25,00 30,58 12,59 16,81 16 26,30 32,00 14,07 18,48 20 31,41 37,57 15,51 20,09 25 37,65 44,31 16,92 21,67 30 43,77 50,89 10 18,31 23,21 40 55,76 63,69 Nếu giá trị quan sát lớn giá trị bảng, coi có ý nghĩa (P = 0,95) hay có ý nghĩa (P = 0,99) 5.3 Mức ý nghĩa tỷ số F = varmax/varmin k phương sai nhóm xử lý, phương sai có f bậc tự (Hartley’s test) k f 10 12 20,6 29,5 37,5 41,1 44,6 51,4 49 69 89 97 106 120 13,7 18,7 22,9 24,7 26,5 29,9 28 38 46 50 54 60 10,4 13,7 16,3 17,5 18,6 20,7 115 19,1 37 8,44 10,8 12,7 13,5 14,3 15,8 18,4 22 23 24 27 7,18 9,03 10,5 11,1 11,7 12,7 14,5 16,9 17,9 18,9 21 6,31 7,80 8,95 9,45 9,91 10,7 12,1 13,9 14,7 15,3 16,6 5,67 6,92 7,87 8,28 8,66 9,34 8,6 10 34 9.9 32 11,7 30 14,5 25 10,4 11,8 12,4 12,9 13,9 Nếu F tính lớn giá trị bảng, biến số cần kiểm tra coi có ý nghĩa (dịng trên, P = 0,05), hay có ý nghĩa (dịng dưới, P = 0,01) Các ký hiệu thuật ngữ Ký hiệu Định nghĩa b Độ dốc hồi qui tuyến tính đường thẳng liều – đáp ứng hay ln(liều) – đáp ứng tất chế phẩm định lượng d Số liều chế phẩm định lượng đối xứng e số logarithm tự nhiên e = 2,718281828… f số bậc tự h số chế phẩm định lượng, bao gồm chế phẩm chuẩn k số xử lý định lượng, k = dh n số đáp ứng hay số lần lặp lại xử lý n’ số ước lượng hoạt lực s độ lệch chuẩn, s1,s2,s3 Nồng độ thấp, trung bình cao chế phẩm S, định s s2 lượng có nồng độ chế phẩm s2 đại diện cho nồng độ 116 cao s2 ước lượng sai số dư tính từ sai số bình phương trung bình s2 M phương sai logarithm hoạt lực M t thống kê Student (Bảng 5.1) t’ thống kê Dunnett (Bảng 3.2.4.-II) u1…z3 Nồng độ dung dịch thử chế phẩm cần định lượng U … Z y đáp ứng riêng hay đáp ứng riêng biến đổi y’ đáp ứng tính dùng để thay cho giá trị bị yS yZ AU…AZ đáp ứng trung bình chế phẩm chuẩn chế phẩm thử hoạt lực giả định chế phẩm cần định lượng, hoạt lực dùng để tính lượng chế phẩm cần lấy pha dung dịch thử B1…B2n tổng đáp ứng đơn vị thí nghiệm (1 đến n) định lượng chéo đôi B’ tổng đáp ứng khối hay hàng có chứa giá trị bị C đại lượng biểu thị ý nghĩa hồi qui, dùng tính tốn giới hạn tin cậy (phương trình 3.2.5-5) Trong số tài liệu thống kê định lượng sinh học, ý nghĩa hồi qui biểu thị g: C C1…Cn 1 g tổng đáp ứng cột (1 đến n) bố trí thí nghiệm hình vng Latin C’ tổng đáp ứng cột có chứa giá trị bị bố trí thí nghiệm hình vng Latin D liều DI,DII tổng đáp ứng giai đoạn I giai đoạn II định lượng chéo đơi E tổng bình phương đại lượng hồi qui (Bảng 3.2.3.-IV) F tỷ số hai ước lượng phương sai độc lập (Bảng 3.2.4.-I) G’ tổng đáp ứng định lượng có giá trị bị I khoảng cách ln(liều) nhau, ví dụ I = ln(S 2) – ln(S 1) K đại lượng dùng để tính tổng bình phương phân tích phương sai 117 K L y N độ rộng logarithm giới hạn tin cậy, L = ln(giới hạn tin cậy trên) – ln(giới hạn tin cậy dưới) LS…LZ tương phản tuyến tính chế phẩm chuẩn chế phẩm thử (Bảng 3.2.3.-I, 3.2.3.-II 3.2.3.-III) M ước lượng logarithm hoạt lực, định lượng đa chế phẩm M dùng kèm với ký tự U…Z , ví dụ MU, để phân biệt chế phẩm M trung bình vài M độc lập M’ logarithm tỷ lệ hoạt lực hay ước lượng hoạt lực trước hiệu chỉnh với hoạt lực giả định N tổng số đáp ứng định lượng NS,NU tổng số đáp ứng chế phẩm S U P xác suất QS…QZ tương phản bậc hai chế phẩm chuẩn chế phẩm thử R hoạt lực tính – dùng với ký tự đại diện cho chế phẩm thử để phân biệt chế phẩm định lượng đa chế phẩm R1…Rn tổng đáp ứng hàng (1 đến n) bố trí thí nghiệm hình vng Latin, hay khối bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo khối S chế phẩm chuẩn S tổng đáp ứng chế phẩm chuẩn S1,S 2,S3 tổng đáp ứng liều thấp, trung bình cao chế phẩm S, định lượng có nồng độ chế phẩm S đại diện cho nồng độ cao T’ tổng đáp ứng xử lý có giá trị bị U…Z tổng đáp ứng chế phẩm thử U…Z U…Z chế phẩm cần định lượng U1,U2,U3 tổng đáp ứng liều thấp, trung bình cao chế phẩm U, định lượng có nồng độ chế phẩm U2 đại diện cho nồng độ cao 118 X ln(liều) W hệ số dùng phối hợp kết định lượng độc lập (phương trình 4.2.1.-1) 119 120 ... hai phương pháp thử thường dùng phương pháp màng lọc phương pháp cấy trực tiếp Khi tiến hành thử phải làm bề ống (hoặc chai, lọ, bình ) đựng chế phẩm chất sát khuẩn thích hợp Sau lấy lượng chế phẩm. .. trùng Chuẩn bị thí nghiệm Lấy mẫu: 35 Đối với thử nghiệm đây, thử nghiệm lấy 10ml 10g chế phẩm Cách thử nghiệm: Một mẫu chế phẩm cần xác định giới hạn vi khuẩn phải thực đầy đủ thử nghiệm sau: Đếm... hoà tan tốt tạo thành dung dịch đục, dùng phương pháp đĩa thạch Còn chế phẩm khác dùng phương pháp hồ lỗng ống nghiệm 36 Hồ tan làm nhũ hố 10 g 10 ml chế phẩm vừa đủ 100 ml dung dịch đệm phosphat